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中枢神経系における血液脳関門(BBB;blood-brain barrier)は、血管内皮細胞などが密集しており物理的に狭くなっていることや、これらの細胞の生理学的機能などにより、中枢神経系への物質の取り込みが非常に制限されている。この血液脳関門の透過の機構は未だ解明されておらず、中枢神経系に障害が生じても、薬物を中枢神経系の目的とする領域に到達させることができないのが現状である。 中枢神経系の障害としては、例えば、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルスなどによる感染症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病等の神経変性疾患などが挙げられる。中枢神経系における感染症に対しては、ワクチン投与による予防、感染後は対症療法が主流となっており、有効な治療方法は未だ見出されていない。 例えば、ポリオウイルスに対する治療薬としてはクエン酸及び/又は亜鉛及びL-アルギニンを可能な担体とともに含有する抗ウイルス剤組成物(特許文献1参照)や、セレギリンを有効成分とする抗ウイルス剤(特許文献2参照)などの治療薬も提案されているが、これらの抗ウイルス剤を用いても、血液脳関門を透過することができない点で問題である。 近年、薬物のより安全でより有効な利用を図るため、薬物に適した剤型だけでなく、薬物を標的となる生体内の部位に効率よく薬物送達(drug delivery)する方法が注目されている。特に、薬物を必要な時に必要な量を必要な場所へ効率よく運ぶ輸送システムとして薬物送達システム(DDS;Drug Delivery System)の実用化が求められている。 中枢神経系においては、ウイルスベクターを用いた方法が提案されている(例えば、特許文献3参照)。しかし、この方法は、安全性の面で問題であり、実用化には至っていない。したがって、血液脳関門を透過できるようなDDSは見出されていないのが現状である。 一方で、ウイルスは血液脳関門を透過して中枢神経系に感染する。例えば、ピコナウイルス科エンテロウイルス属に属するプラス鎖一本鎖RNAウイルスであるポリオウイルス(PV;poliovirus)は、小児マヒ(ポリオ;急性灰白髄炎)の病因であり、向神経性を有することが知られている。自然宿主はヒトのみであるが、実験的に霊長類には感染が成立する。ヒトには経口感染し、消化管で増殖後、扁桃腺やパイエル板を介し血液中に侵入する。やがてポリオウイルスは、血液脳関門を透過して中枢神経系に侵入し、そこで主に運動神経細胞に感染し細胞機能を破壊する。その結果、感染者の四肢に麻痺が生じる。中枢神経系には骨格筋から逆行性に神経軸索を輸送され運動神経細胞に到達する経路が存在することも知られている。 ポリオウイルス受容体(PVR:poliovirus receptor)としては、CD155が、その感染に関与することが知られている(非特許文献2参照)。 しかし、PVR遺伝子を導入したトランスジェニックマウスの研究から、ポリオウイルスの血液脳関門の透過には、CD155は関与していないことが示唆された(非特許文献1参照)。これより、ポリオウイルスの血液脳関門の透過には、別の受容体が関与していることが推察される。 したがって、ポリオウイルスの感染機構を解明することができれば、血液中から中枢神経系への血液脳関門透過機構も解明することができることが考えられるが、その機構は未だ解明されていないのが現状である。 本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、血液脳関門を透過することができるペプチド、中枢神経系の目的とする細胞に薬物を輸送することができる薬物輸送体、ポリオウイルスによる疾患発症を予防できる抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、及びトランスフェリン受容体捕捉体を提供することを目的とする。 前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、下記配列番号:1から4で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含むペプチドが血液脳関門を透過することを知見し、本発明の完成に至った。 本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、 <1> 下記配列番号:1から4で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含むことを特徴とするペプチドである。 ALGDSLYGAASLN (配列番号:1) MTVDNPASTTNKDKLFSVWK (配列番号:2) PGAVPEK (配列番号:3) STKDLTTY (配列番号:4) <2> 血液脳関門を透過する前記<1>に記載のペプチドである。 <3> トランスフェリン受容体と結合する前記<1>から<2>のいずれかに記載のペプチドである。 <4> トランスフェリン受容体のAD(Apical domain)と結合する前記<3>に記載のペプチドである。 <5> 下記配列番号:5から8で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかと結合する前記<1>から<4>のいずれかに記載のペプチドである。 TQFPPSQSS (配列番号:5) TQFPPSRSS (配列番号:6) TQFPPVASS (配列番号:7) TQFPPVESS (配列番号:8) <6> 前記<1>から<5>のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とする薬物輸送体である。 <7> 更に担体を含む前記<6>に記載の薬物輸送体である。 <8> 担体が、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、及びエマルジョンから選択される少なくともいずれかである前記<7>に記載の薬物輸送体である。 <9> 担体の内部に診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が担持される前記<7>から<8>のいずれかに記載の薬物輸送体である。 <10> 診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子、及びこれらの類縁体、グリコサミノグリカン及びその誘導体、オリゴ糖、多糖及びこれらの誘導体、タンパク質及びペプチド、抗神経剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、抗炎症剤、ステロイド剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血管拡張剤、平滑筋細胞の増殖及び/又は遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、免疫抑制剤、脂質取込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、血管内皮細胞の増殖又は抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫賦活剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成酵素阻害剤、終末糖化産物阻害剤、及びラジカルスカベンジャーから選択される少なくともいずれかである前記<9>に記載の薬物輸送体である。 <11> エンドサイトーシスにより細胞内に輸送される前記<6>から<10>のいずれかに記載の薬物輸送体である。 <12> 細胞が血管内皮細胞である前記<11>に記載の薬物輸送体である。 <13> 経口投与に用いられる前記<6>から<12>のいずれかに記載の薬物輸送体である。 <14> 前記<1>から<5>のいずれかに記載のペプチドを含有し、ポリオウイルスによる疾患発症を予防することを特徴とする抗ポリオウイルス剤である。 <15> 前記<1>から<5>のいずれかに記載のペプチドを含有し、血液脳関門を透過することを特徴とする血液脳関門透過剤である。 <16> 前記<1>から<5>のいずれかに記載のペプチドを含有し、トランスフェリン受容体と結合することを特徴とするトランスフェリン受容体捕捉体である。 本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、血液脳関門を透過することができるペプチド、中枢神経系の目的とする細胞に薬物を輸送することができる薬物輸送体、ポリオウイルスによる疾患発症を予防できる抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、及びトランスフェリン受容体捕捉体を提供することができる。 図1は、試験例1における、ポリオウイルスの血液脳関門透過試験の結果を示す図である。縦軸:透過量(μL)、横軸:時間(分間)。 図2は、試験例2の概略説明図である。 図3は、試験例2のウエスタンブロットの結果を示す図である。 図4は、マウスのトランスフェリン受容体1(mTfR1)のドメイン構造の概略説明図である。 図5は、試験例3で作製したコンストラクトの概略説明図である。 図6は、試験例4-1及び試験例4-2のウエスタンブロットによる検討の概略説明図である。 図7-1は、試験例4-1のウエスタンブロットの結果を示す図である。 図7-2は、試験例4-2のウエスタンブロットの結果を示す図である。 図8は、ポリオウイルス(Mahoney株)のX線結晶解析(PDB ID:1HXS)により決定された立体構造の(2.2Å)を示す図である。 図9は、試験例5のウエスタンブロットの結果を示す図である。 図10は、試験例6のウエスタンブロットの結果を示す図である。 図11は、試験例7における、配列番号:1で表されるペプチドの血液脳関門透過試験の結果を示す図である。縦軸:透過量(μL)、横軸:時間(分間)。 図12Aは、ポリオウイルスのVP1、VP2、及びVP3の複合体のシュミレーションモデル図である。 図12Bは、ポリオウイルスのVP1を拡大したシュミレーションモデル図である。 図12Cは、トランスフェリン受容体のシュミレーションモデル図である。 図12Dは、ポリオウイルスのVP1、VP2、及びVP3の複合体とトランスフェリン受容体とが結合したシュミレーションモデル図である。 (ペプチド) 本発明のペプチドは、下記配列番号:1から4で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含む。前記ペプチドは、主に血液脳関門を透過する機能を有する。 N末端-ALGDSLYGAASLN-C末端 (配列番号:1) N末端-MTVDNPASTTNKDKLFSVWK-C末端 (配列番号:2) N末端-PGAVPEK-C末端 (配列番号:3) N末端-STKDLTTY-C末端 (配列番号:4) 前記ペプチドとしては、血液脳関門を透過する限りは、前記配列番号:1から4で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかの全体又は一部において、1個若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。また、前記ペプチドは、N末端若しくはC末端に化学修飾が施されたものであってもよい。前記化学修飾としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセチル化、ミリストイル化、アミド化、シスチニル化などが挙げられる。 また、前記ペプチドは、前記配列番号:1から4で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかからなるものであってもよい。 前記ペプチドの入手方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成する方法、ポリオウイルス(PV;Poliovirus)の遺伝子配列に基づき分子生物学的手法により得る方法などが挙げられる。 前記ペプチドの化学合成の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ペプチド合成装置(例えば、株式会社島津製作所製)を用いて化学合成する方法などが挙げられる。 前記ポリオウイルスの遺伝子配列に基づき分子生物学的手法により得る方法としては、特に制限はなく、前記ペプチドの配列などに応じて適宜選択することができ、例えば、ポリオウイルスから調製したゲノムRNAを逆転写酵素によってcDNAとして合成したものを鋳型とし、PCR法により増幅させ、クローニングする方法などが挙げられる。 前記PCR法に用いるプライマーとしては、前記配列番号:1から4で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを増幅させることができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記配列番号:1で表されるアミノ酸配列の場合は、下記配列番号:9で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:10で表されるアンチセンスプライマーを用いることが好ましく、前記配列番号:2で表されるアミノ酸配列の場合は、下記配列番号:11で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:12で表されるアンチセンスプライマーを用いることが好ましく、前記配列番号:3で表されるアミノ酸配列の場合は、下記配列番号:13で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:14で表されるアンチセンスプライマーを用いることが好ましく、前記配列番号:4で表されるアミノ酸配列の場合は、下記配列番号:15で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:16で表されるアンチセンスプライマーを用いることが好ましい。 センスプライマー:5’-GCTCTAGAGACCAATCAGCAGCGTTGGGCGATTCACTTTATGGTGCTGCATCC-3’ (配列番号:9) アンチセンスプライマー:5’-CCCAAGCTTCTATTATTAGTTCAAGGATGCAGCACCATAAAGTGAATC-3’ (配列番号:10) センスプライマー:5’-GCTCTAGAATGACTGTGGACAACCCGGCTTCTACTACAAACAAAGACAAATTGTTTTCT-3’ (配列番号:11) アンチセンスプライマー:5’-CCCAAGCTTCTATTATTACTTCCACACAGAAAACAATTTGTCTTTGTTTGTAGT-3’ (配列番号:12) センスプライマー:5’-GCTCTAGACCAGGGGCACCGGTGCCAGAGAAATAAT-3’ (配列番号:13) アンチセンスプライマー:5’-CCCAAGCTTCTATTATTATTTCTCTGGCACCGGTGC-3’ (配列番号:14) センスプライマー: 5’-GCTCTAGACTCGCTCCCTTATCCACCAAAGACCTGACAACGTACGCTAG-3’ (配列番号:15) アンチセンスプライマー: 5’-CCCAAGCTTCTATTATTAGTACGTTGTCAGGTCTTTGGTGGAT-3’ (配列番号:16) <ペプチドの結合対象> 前記ペプチドの結合対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェリン受容体などが挙げられる。 -トランスフェリン受容体- 前記トランスフェリン受容体(TfR;Transferrin Receptor)の細胞外ドメインは、図4に示すように、第1のプロテアーゼ様ドメイン(PD1;Protease-like domain1)、アピカルドメイン(AD;Apical domain)、第2のプロテアーゼ様ドメイン(PD2;Protease-like domain2)、ヘリカルドメイン(HD;Helical domain)を含むことが知られている。 これらの中でも、前記ペプチドは、ADに結合することが好ましく、下記配列番号:5から8で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかに結合することがより好ましい。なお、下記配列番号:5で表されるアミノ酸配列は、マウスのトランスフェリン1受容体由来の配列であり、下記配列番号:6で表されるアミノ酸配列は、ヒトのトランスフェリン1受容体由来の配列であり、下記配列番号:7で表されるアミノ酸配列は、ヒトのトランスフェリン2受容体由来の配列であり、下記配列番号:8で表されるアミノ酸配列は、マウスのトランスフェリン2受容体由来の配列である。 N末端(321)-TQFPPSQSS-(329)C末端 (配列番号:5) N末端(318)-TQFPPSRSS-(326)C末端 (配列番号:6) N末端(341)-TQFPPVASS-(349)C末端 (配列番号:7) N末端(336)-TQFPPVESS-(344)C末端 (配列番号:8) 前記ペプチドの機能としては、血液脳関門を透過するだけでなく、前記配列番号:5から8で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを含む受容体などを有する細胞であれば、どのような細胞であっても結合でき、細胞の種類に応じて、該細胞内に取り込まれる。また、前記ペプチドが結合する対象としては、受容体に限られるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。 <用途> 前記ペプチドの用途としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、後述する本発明の薬物輸送体、抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、トランスフェリン受容体捕捉体などに好適に用いられる。 (薬物輸送体) 本発明の薬物輸送体は、少なくとも本発明の前記ペプチドを含有し、更に必要に応じて、担体、薬物などのその他の成分を含有する。 <ペプチド> 前記薬物輸送体中の前記ペプチドの含有量としては、薬物を輸送することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 前記ペプチドは、上述のとおり、前記配列番号:1から4で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかの全体又は一部において、1個若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよく、N末端若しくはC末端に化学修飾が施されたものであってもよい。これらのアミノ酸の置換、欠失、付加、又は化学修飾は、前記薬物輸送体において、特に制限はなく、輸送対象の薬物などに応じて適宜選択することができる。即ち、前記薬物は、前記ペプチドに担持されて輸送されてもよく、後述する担体に担持されて輸送されてもよい。 <担体> 前記担体の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記薬物を、膜で形成された閉鎖空間内に内包した形態、膜間に内包した形態、膜内に包含した形態などが挙げられ、これらの組合せによる形態であってもよい。このように、前記担体としては様々な形態が考えられ、したがって「担持」は、その形態により、内包、封入、相互作用などを広く意味する。 前記担体の形態の具体例としては、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、エマルジョンなどが挙げられる。前記担体としては、特に制限はなく、医薬製剤の分野で公知のものの中から目的に応じて適宜選択することができる。 前記薬物輸送体の平均粒子径としては、特に制限はなく、細胞内に輸送され得る限り、目的に応じて適宜選択することができる。 細胞への前記薬物輸送体の取り込み方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ファゴサイトーシス、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、マクロピノサイトーシスなどが挙げられる。 多くの細胞ではエンドサイトーシスによることが知られている。エンドサイトーシスで取り込むことができる大きさとしては、最大約300nm程度であり、それ以上になると極端に取り込み量が減少することがある。 したがって、前記薬物輸送体の平均粒子径としては、300nmより小さいことが好ましい。前記平均粒子径は、粒度分布測定装置で測定することができる。 <薬物> 前記薬物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防、治療、及び診断の少なくともいずれかを行うための薬物や、その他の薬理学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質、診断用物質などが挙げられる。 前記薬物の性質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、親水性の薬物であってもよく、疎水性の薬物であってもよい。 前記薬物の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子、及びこれらの類縁体、グリコサミノグリカン及びその誘導体、オリゴ糖、多糖及びこれらの誘導体、タンパク質及びペプチドなどの生理活性的物質;抗神経剤、抗ウイルス剤、抗癌剤、抗生物質、酵素剤、抗酸化剤、抗炎症剤、ステロイド剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、血管拡張剤、平滑筋細胞の増殖及び/又は遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、ケミカルメディエーターの遊離抑制剤、免疫抑制剤、脂質取込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、血管内皮細胞の増殖又は抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫賦活剤、メイラード反応抑制剤、アミロイドーシス阻害剤、一酸化窒素合成酵素(NOS;:Nitric Oxide Synthase)阻害剤、終末糖化産物(AGEs;Advanced glycation endproducts)阻害剤、及びラジカルスカベンジャー等の薬理的活性物質などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。 前記薬物輸送体は、血液脳関門を好適に透過できることから、これらの薬物の中でも、中枢神経系の治療及び/又は診断に用いることができる薬物が好ましく、ポリオウイルスによる感染を治療できる薬物がより好ましい。 前記抗神経剤の具体例としては、コンスタン、セパゾン、セルシン、セレナール、ソラナックス、デパス、バランス、メイラックス、リーゼ、リボトリール、レキソタン、ワイバックス、セディール、グランダキシン、エリスパン等の抗不安剤;アナフラニール、トフラニール、トリプタノール、アモキサン、アンプリット、プロチアデン、テシプール、テトラミド、ルジオミール、デジレル、レスリン、アビリット、ドグマチール、ミラドール、リタリン、デプロメール、パキシル、ルボックス、トレドミン等の抗うつ剤;アモバン、ハルシオン、エバミール、マイスリー、リスミー、レンドルミン、ロラメット、サイレース、ドラール、ベンザリン、ユーロジン、ロヒプノール、インスミン、ソメリン、ダルメート、フェノバール、イソミタール等の抗不眠剤;ウインタミン、コントミン、ニューレプチル、ヒルナミン、PZC、メレリル、インプロメン、セレネース、オーラップ、クレミン、クロフェクトン、デフェクトン、ホーリット、ロドピン、アタラックス等の精神安定剤;リーマス、テグレトール等の躁鬱剤;エトトイン、フェニトイン、アセチルフェネトライド、プリミドン、スルチアム、エトスクシミド、クロナゼパム、カルバマゼピン、バルプロ酸ナトリウム、ゾニサミド等の抗てんかん剤;レボドパ剤、メシル酸ペルゴリド、塩酸アマンダジン、塩酸トリヘキシフェニジル、塩酸ピロヘプチン、塩酸マザチコ-ル、塩酸メチキセン、ビペリデン、プロフェナミン、ドロキシドパ等のパーキンソン病治療剤などが挙げられる。 前記抗ウイルス剤の具体例としては、アシクロビル、ガンシクロビル、ジダノシン、ジドブジン、ソリブジン、ビダラビンなどが挙げられる。 前記抗癌剤の具体例としては、シクロフォスファミド、イフォスファミド、塩酸ナイトロジェンマスタード-N-オキシド、チオテパ、ブルスファン、カルボコン、塩酸ニムスチン、ラニムスチン、メルファラン、トシル酸インプロスルファン、ダカルバジン、塩酸プロカルバジン、シタラビン、シタラビンオクスファート、エノシタビン、メルカプトプリン、チオイノシン、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、テガフール、メトトレキサート、カルモフール、ヒドロキシカルバミド、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、エトポシド、クロモマイシンA3、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アラクルビシン、ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ダクチノマイシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、マイトマイシンC、ネオカルノスタチン、L-アスパラギナーゼ、アセグラトンミトプロニトール、デキストラン硫酸ナトリウム、酢酸オクトレオチド、シスプラチン、カルボプラチン、クエン酸タモキシフェン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロレリンなどが挙げられる。 前記抗生物質の具体例としては、ベンジルペニシリンカリウム、ベンジルペニシリンベンザチン、フェノキシメチルペニシリンカリウム、フェネチシリンカリウム、クロキサシリンナトリウム、フルクロキサシリンナトリウム、アンピシリン、トシル酸スルタミシリン、塩酸バカンピシリン、塩酸タランピシリン、レナンピシリン、ヘタシリンカリウム、シクラシリン、アモキシシリン、塩酸ピブメシリナム、アスポキシシリン、カルベニシリンナトリウム、カリンダシリンナトリウム、スルベニシリンナトリウム、チカルシリンナトリウム、ピペラシリンナトリウム、セファロリジン、セファロチンナトリウム、セファゾリンナトリウム、セファピリンナトリウム、セフラジン、セファレキシン、セファトリジンプロピレングリコール、セフロキサジン、セファクロル、セファドロキシル、塩酸セフォチアム、塩酸セフォチアムヘキセチル、セフロキシムナトリウム、セフロキシムアキセチル、セファマンドールナトリウム、セフジニル、塩酸セフェタメトピポキシル、セフチプテン、セフメタゾールナトリウム、セフォキシチンナトリウム、セフォテタンナトリウム、セフミノクスナトリウム、セフプペラゾンナトリウム、セフピラミドナトリウム、セフスロジンナトリウム、セフォタキシムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、塩酸セフメノキシム、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セフピミゾールナトリウム、セフィキシム、セフテラムピポキシル、セフゾナムナトリウム、セフポドキシプロキセチル、セフォジジム、硫酸セフピロム、ラタモキセフナトリウム、フロモキセフナトリウム、イミペネム、シラスタチンナトリウム、アズトレオナム、カルモナムナトリウム、硫酸ステレプトマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸フラジオマイシン、硫酸アミカシン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸パロモマイシン、硫酸ペカナマイシン、硫酸リポスタマイシン、硫酸ジベカシン、トブラマイシン、硫酸シソマイシン、硫酸ミスロノマイシン、硫酸アストロマイシン、硫酸ネチルマイシン、硫酸イセパマイシン、硫酸アルベカシン、エリスロマイシン、キタサマイシン、アセチルキタサマイシン、リン酸オレアンドマイシン、ジョサマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシン、酢酸ミデカマイシン、ロキタマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、塩酸テトラサイクリン、塩酸オキシテトラサイクリン、メタリン酸テトラサイクリン、塩酸デメチルクロルテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、塩酸ミノサイクリン、クロラムフェニコール、コハク酸クロラムフェニコールナトリウム、パルミチン酸クロラムフェニコール、チアンフェニコール、塩酸アミノ酢酸チアンフェニコール、硫酸コリスチン、コリスチンメタンスルホン酸ナトリウム、硫酸ポリミキシンB、バシトラシン、塩酸バンコマイシン、塩酸リンコマイシン、クリンダマイシン、塩酸スペクチノマイシン、フォスフォマイシンナトリウム、フォスフォマイシンカルシウムなどが挙げられる。 前記酵素剤の具体例としては、キモトリプシン、結晶トリプシン、ストレプトキナーゼ・ストレプトドルナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ウロキナーゼ、ナサルプラーゼ、アルテプラーゼ、塩化リゾチーム、セミアルカリプロティナーゼ、セラペプターゼ、チソキナーゼ、デュテプラーゼ、バトロキソビン、プロナーゼ、プロメラインなどが挙げられる。 前記抗酸化剤の具体例としては、トコフェロール、アスコルビン酸、尿酸などが挙げられる。 前記抗炎症剤の具体例としては、サリチル酸コリン、サザピリン、サリチル酸ナトリウム、アスピリン、ジフルニサル、フルフェナム酸、メフェナム酸、フロクタフェニン、トルフェナム酸、ジクロフェナクナトリム、トルメチンナトリウム、スリンダク、フェンブフェン、フェルビナクエチル、インドメタシン、インドメタシンファルネシル、アセメタシン、マレイン酸プログルメタシン、アンフェナクナトリウム、ナブメトン、イブプロフェン、フルルビプロフェン、フルルビプロフェンアキセチル、ケトプロフェン、ナプロキセン、プロチジン酸、プラノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、チアプロフェン酸、オキサプロジン、ロキソプロフェンナトリウム、アルミノプロフェン、ザルトプロフェン、フェニルブタゾン、クロフェゾン、ケトフェニルブタゾン、ピロキシカム、テノキシカム、アンピロキシカム、塩酸チアラミド、塩酸チノリジン、塩酸ベンジダミン、エピリゾール、エルモファゾンなどが挙げられる。 前記ステロイド剤の具体例としては、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン(リン酸エステル、酢酸塩)、酪酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、プレドニゾロン(アセテート、サクシネート、第三級ブチル酢酸エステル、リン酸エステル)、メチルプレドニゾロン(アセテート)、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド(酢酸トリアムシノロン)、デキサメタゾン(リン酸エステル、酢酸塩、リン酸ナトリウム塩、硫酸エステル)、パルミチン酸デキサメタゾン、ベタメタゾン(リン酸塩、2ナトリウム塩)、酢酸パラメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸ハロプレドン、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、プロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、酢酸ベタメタゾン、酢酸コルチゾンなどが挙げられる。 前記アンジオテンシン変換酵素阻害剤の具体例としては、アラセプリル、塩酸イミダプリル、塩酸テモカプリル、塩酸デラプリル、塩酸ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、マレイン酸エナラプリル、リシノプリルなどが挙げられる。 前記血管拡張剤の具体例としては、テオフィリン、ジプロフィリン、プロキシフィリン、アミノフィリン、コリンテオフィリン、プロスタグランジン、プロスタグランジン誘導体、アルプロスタジルアルファデクス、アルプロスタジル、リマプロストアルファデクス、パパベリン、シクランデラート、シンナリジン、フマル酸ベンシクラン、マレイン酸シネパジド、塩酸ジラゼプ、トラピジル、塩酸ジフェニドール、ニコチン酸、イノシトールヘキサニコチネート、クエン酸ニカメタート、酒石酸ニコチニックアルコール、ニコチン酸トコフェロール、ヘプロニカート、塩酸イソクスプリン、硫酸バメタン、塩酸トラリゾン、メシル酸ジヒドロエルゴトキシン、酒石酸イフェンプロジル、塩酸モキシシリト、ニセルゴリン、塩酸ニカルジピン、ニルバジピン、ニフェジピン、塩酸ベニジピン、塩酸ジルチアゼム、ニソルジピン、ニトレンジピン、塩酸マニジピン、塩酸バルニジピン、塩酸エホニジピン、塩酸ベラパミル、塩酸トリメタジジン、カプトプリル、マレイン酸エナラプリル、アラセプリル、塩酸デラプリル、シラザプリル、リシノプリル、塩酸ベナゼプリル、塩酸ヒドララジン、塩酸トドララジン、ブドララジン、カドララジン、インダパミド、塩酸カルボクロメン、エフロキサート、塩酸エタフェノン塩酸オキシフェドリン、ニコランジル、亜硝酸アミル、硝酸イソソルビドなどが挙げられる。 前記平滑筋細胞の増殖及び/又は遊走阻害剤の具体例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム(低分子ヘパリン)、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸などが挙げられる。 前記血小板凝集阻害剤の具体例としては、塩酸チクロピジン、シロスタゾール、イコサペント酸エチル、ベラプロストナトリウム、塩酸サルプグレラート、バトロキソビン、ジピリダモールなどが挙げられる。 前記抗凝固剤の具体例としては、ヘパリンナトリウム、ダルテパリンナトリウム(低分子ヘパリン)、ヘパリンカルシウム、デキストラン硫酸、ワルファリンカリウム、アルガトロバンなどが挙げられる。 前記ケミカルメディエーター遊離抑制剤の具体例としては、トラニラスト、フマル酸ケトフェチン、塩酸アゼラスチン、オキサトミド、アンレキサノクス、レピリナストなどが挙げられる。 前記免疫抑制剤の例としては、シクロスポリンなどが挙げられる。 また、診断に用いられる薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、X線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等の体内診断薬などが挙げられる。 前記X線造影剤の具体例としては、アミドトリゾ酸メグルミン、イオタラム酸ナトリウム、イオタラム酸メグルミン、ガストログラフィン、ヨーダミドメグルミン、リピオドールウルトラフルイド、アジピオドンメグルミン、イオキサグル酸、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオヘキソール、イオベルソール、イオポダートナトリウム、イオメプロール、イソペーク、ヨードキサム酸などが挙げられる。 前記薬物輸送体に担持される薬物の量としては、特に制限はなく、薬物の種類などに応じて適宜選択することができる。 <その他の成分> 前記薬物輸送体中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。 前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、pH調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。 前記その他の成分は、前記薬物輸送体と共に配合されていてもよく、前記担体中に配合されていてもよい。 前記殺菌剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムなどのカチオン性界面活性剤などが挙げられる。 前記保存剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、クレゾールなどが挙げられる。 前記粘結剤、増粘剤、固着剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、澱粉、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。 前記結合剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。 前記着色剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。 前記安定化剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン、ピロ亜硫酸ナトリウム、EDTA、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。 前記pH調整剤及び前記緩衝剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。 前記等張化剤としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。 前記薬物輸送体中の前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 <薬物輸送体の輸送> 前記薬物輸送体を細胞内に輸送する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、輸送対象の細胞の機能や特性を利用して行う方法などが挙げられる。 前記薬物輸送体の輸送に利用可能な細胞の機能や特性としては、例えば、細胞のファゴサイトーシスやエンドサイトーシスなどが挙げられる。 前記薬物輸送体を投与する前に、ファゴサイトーシスやエンドサイトーシスが起こりやすくするために予め細胞を活性化させておいてもよい。また、細胞が高度に活性化し、粘着性が亢進しすぎたり、凝集が生じたりする場合は、適宜選択した方法により細胞を不活性化してもよい。 前記薬物輸送体を適用できる細胞としては、前記配列番号:1から4で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかを認識できる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。これらの中でも、本発明のペプチドは、血液脳関門を透過でき、即ち、前記薬物輸送体は血液脳関門を透過できるため、中枢神経系の予防、治療、又は診断などに好適に用いられる。 中枢神経系を構成する細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、神経細胞、グリア細胞、血管内皮細胞、周皮細胞などが挙げられる。これらの中でも、前記薬物輸送体は、血管内皮細胞内に好適に輸送される。 <投与> 前記薬物輸送体の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。 前記局所投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、皮膚上投与法、吸入投与法、注投与法、結膜上への点眼、経鼻投与法、膣内投与法などが挙げられる。 前記経腸投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与法、経管栄養法、注腸投与法などが挙げられる。 前記非経口投与法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、経静脈投与法、経動脈投与法、筋肉内投与法、心臓内投与法、皮下投与法、骨内投与法、皮内投与法、くも膜下投与法、腹腔内投与法、膀胱内投与法、経皮投与法、経粘膜投与法、吸入投与法、硬膜外投与法、硝子体内投与法などが挙げられる。 前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。 前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。これらの中でもヒトに好適に用いられる。 <使用> 前記薬物輸送体は、1種単独で使用してもよく、他の成分を有効性分とする医薬や薬物輸送体と併せて使用してもよい。また、他の成分を有効成分とする医薬に配合された状態で使用してもよい。 <用途> 本発明の薬物輸送体は、血液脳関門を透過できるため、中枢神経系における障害の予防、治療又は診断に好適に用いられる。これらの中でも、特にポリオウイルスによる感染の予防、治療又は診断に好適に用いられる。 (抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤) <抗ポリオウイルス剤> 本発明の抗ポリオウイルス剤は、本発明の前記ペプチドを含有し、更に必要に応じて、その他の成分を含む。 前記抗ポリオウイルス剤は、中枢神経系の血管内皮細胞、特に血液脳関門を構成する血管内皮細胞に存在するポリオウイルスの受容体としてのトランスフェリン受容体に好適に結合することができる。前記抗ポリオウイルス剤が前記トランスフェリン受容体に結合すると、エンドサイトーシス等により該トランスフェリン受容体を有する血管内皮細胞内に取り込まれる。したがって、前記抗ポリオウイルス剤は、ポリオウイルスの血液脳関門の透過に対する拮抗阻害作用を有し、ポリオウイルスの血液脳関門の透過を予防することができ、ポリオウイルス感染に伴う神経障害を予防することができる。 前記抗ポリオウイルス剤中の前記ペプチドの含有量としては、ポリオウイルスの血液脳関門の透過を予防することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記抗ポリオウイルス剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。 <血液脳関門透過剤> 本発明の血液脳関門透過剤は、本発明の前記ペプチドを含有し、更に必要に応じて、その他の成分を含む。 前記血液脳関門透過剤中の前記ペプチドの含有量としては、血液脳関門を透過することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記血液脳関門透過剤は、前記ペプチドそのものであってもよい。 <その他の成分> 前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容される担体などが挙げられる。 前記担体としても、特に制限はなく、前記抗ポリオウイルス剤の剤型などに応じて適宜選択することができ、例えば、前記薬物輸送体のその他の成分で記載したものなどが挙げられる。 また、前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤は、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用してもよい。 <剤型> 前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤の剤型としては、特に制限はなく、所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、固形剤、半固形剤、液剤などが挙げられる。 前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤の製造方法としては、特に制限はなく、剤型に応じて常法の中から適宜選択することができる。 -固形剤- 前記固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内容剤として用いられる場合、例えば、錠剤、チュアブル錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、トローチ剤、ドロップ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、ドライシロップ剤、浸剤などが挙げられる。 前記固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、坐剤、パップ剤、プラスター剤などが挙げられる。 -半固形剤- 前記半固形剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、舐剤、チューインガム剤、ホイップ剤、ゼリー剤などが挙げられる。 前記半固形剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ムース剤、インヘラー剤、ナザールジェル剤などが挙げられる。 -液剤- 前記液剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、内用剤として用いられる場合、例えば、シロップ剤、ドリンク剤、懸濁剤、酒精剤などが挙げられる。 前記液剤が、外用剤として用いられる場合、例えば、液剤、点眼剤、エアゾール剤、噴霧剤などが挙げられる。 <投与> 前記抗ポリオウイルス剤及び前記血液脳関門透過剤の投与方法、投与量、投与時期、及び投与対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 前記投与方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、局所投与法、経腸投与法、非経口投与法などが挙げられる。 前記投与量としては、特に制限はなく、投与対象個体の年齢、体重、体質、症状、他の成分を有効成分とする医薬の投与の有無など、様々な要因を考慮して適宜選択することができる。 前記投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられるが、これらの中でもヒトに好適に用いられる。 (トランスフェリン受容体捕捉体) 本発明のトランスフェリン受容体捕捉体は、本発明の前記ペプチドを含有し、更に必要に応じて、その他の成分を含む。前記トランスフェリン受容体捕捉体は、トランスフェリンを好適に捕捉することができる。 前記トランスフェリン受容体捕捉体中の前記ペプチドの含有量としては、トランスフェリン受容体を捕捉することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記トランスフェリン受容体捕捉体は、前記ペプチドそのものであってもよい。 <その他の成分> 前記トランスフェリン受容体捕捉体中のその他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬理学的に許容される担体などが挙げられる。 前記担体としても、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、前記薬物輸送体のその他の成分で記載したものなどが挙げられる。 また、前記トランスフェリン受容体捕捉体中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 前記トランスフェリン受容体捕捉体は、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよく、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用してもよい。また、前記トランスフェリン受容体捕捉体は、他の成分を有効成分とする医薬中に配合された状態で使用してもよい。 以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。 (試験例1:ポリオウイルスの血液脳関門透過におけるトランスフェリンの影響) -脳血管内皮細胞の調製- マウス由来脳血管内皮細胞(mouse brain capillary endotherial cell;MBEC)4株は、10質量% 非働化ウシ胎児血清(FBS)(コスモバイオ社製)含有D-MEM(シグマ社製)を用いて培養を行った。 この脳血管内皮細胞は、トリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)処理することにより分散させた。 なお、MBECは、Shirai A et al., BBA;1994 Jul 21;1222(3):400-404に基づき調製した。 -ポリオウイルスの調製- 精製ポリオウイルス(PV)の調製方法は、本発明者らが以前に報告したYang WX. et al., 1997, Virology, Vol.229, p421-p428に基づいて行った。 ポリオウイルス(Mahoney株)を感染させた浮遊HeLa細胞を、バッファー(10mM トリス塩酸(pH7.4)、100mM 塩化ナトリウム、1.5mM 塩化マグネシウム、5mM EDTA)中でDounce型ホモジェナイザーを用いて細胞破砕を行い、その細胞質画分をDEAE-Sepharose(商品名:CL-6B、GEヘルスケア社製)処理後、ショ糖密度勾配遠心、塩化セシウム密度勾配遠心を経た後、脱塩カラム(商品名:PD-10、GEヘルスケア社製)処理を行い、ポリオウイルス粒子を精製した。 -蛍光ラベル化ポリオウイルスの調製- 前記精製したポリオウイルスに、商品名:Alexa Fluor(登録商標) 568-Protein Labeling Kit(インビトロジェン社製)を用いて蛍光ラベルを付した。この蛍光ラベル化ポリオウイルスは、PBSにて濃度0.4mg/mLとなるように調製した。 なお、前記PBSの組成は、2.7mM 塩化カルシウム、1.47mM リン酸二水素カリウム(無水)、137mM 塩化ナトリウム、8.1mM リン酸-水素ナトリウム(無水)である。 <ポリオウイルスの血液脳関門透過試験> トランズウェルプレート(商品名:Transwell plate(12well)、コーニング社製)はI型コラーゲン(シグマ社製)で37℃にて4時間コーティングを行い、一晩乾燥させたものを用いた。 トランズウェルプレートの上層部に前記調製した脳血管内皮細胞(7×10 4 細胞/ウェル)を播種し、10質量% 非働化ウシ胎児血清(FBS)(コスモバイオ社製)含有D-MEM(シグマ社製)で37℃、5%CO 2 にて72時間培養することにより、血液脳関門のインビトロモデル培養系を作製した。 トランズウエル内の脳血管内皮細胞の培養液に、前記蛍光ラベル化ポリオウイルス127μg/mL、及び、蛍光ラベル化トランスフェリン(商品名:Alexa Fluor(登録商標) 555-transferrin、インビトロジェン社製)180μg/mL、又は、前記FITC標識デキストラン(シグマ社製)180μg/mLをそれぞれ添加し、5分間後、10分間後、15分間後のトランズウェルプレート下層部内の培養液をそれぞれ回収し、分光蛍光光度計(商品名:F-2500、株式会社日立ハイテクノロジーズ製)にて蛍光強度を観察し、これをトランズウェルプレート内の脳血管内皮細胞を透過した量として測定した。 結果を図1に示す。ポリウイルスのみを添加した場合(図1の「PV」)のPS値(透過速度、透過活性)は1.89であり、ポリオウイルス及びトランスフェリンを添加した場合(図1の「PV+Tf」)のPS値は1.02であり、デキストランを添加した場合のPS値は0.20であった。 ポリオウイルスを単独で脳血管内皮細胞に添加した場合(PV)と比較して、ポリオウイルスとトランスフェリンとを混合して脳血管内皮細胞に添加した場合(PV+Tf)は透過速度が遅かったことから、トランスフェリンがポリオウイルスの血液脳関門の透過を阻害していることがわかった。この結果より、ポリオウイルスは、トランスフェリンと共通の受容体を介して脳血管内皮細胞を透過することが示唆された。 (試験例2:ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合の確認) 次に、ポリオウイルスがトランスフェリン受容体と直接結合していることをウエスタンブロットにより以下の方法で確認した。図2に、試験例2の概略説明図を示す。 -トランスフェリン受容体の調製- --マウストランスフェリン受容体1(mTfR1)のクローニング-- マウス肝臓から調製したtotal RNAをPtimeScript 1st Strand cDNA synthesis Kit(タカラバイオ株式会社製)を用いてcDNAを調製し、これをmTfR1可溶性領域(R123~F763)のクローニング用の鋳型として用いた。プライマーは、GeneBank登録番号 BC054522.1の配列情報を基に、センスプライマーとしてSacII切断部位(下線部)を含む下記配列番号:17で表されるプライマー配列、及びアンチセンスプライマーとしてXhoI切断部位(下線部)を含む下記配列番号:18で表されるプライマー配列(終始コドンから3’側150塩基下流)を用いてPCR法によりmTfR1遺伝子断片を増幅し、N末端Strepタグ融合タンパク質発現用ベクター(商品名:pASK-IBA7(+)、IBA社製)のSacII-XhoI切断部位に挿入した。作製した発現ベクターを以下、pASK-mTfR1と称することがある。 センスプライマー:5’-TCC CCGCGG TCGCTTATATTGGGCAGACCTCAAA-3’ (配列番号:17) アンチセンスプライマー:5’-CCG CTCGAG TCCAACCCCGCACTAAAAGCTG-3’ (配列番号:18) --Strep-mTfR1の発現及び精製-- 構築した発現ベクターpASK-mTfR1を大腸菌JM109株(東洋紡株式会社製)に形質転換し、OD600における濁度が0.5となるまで37℃で培養後、200ng/mLのテトラサイクリンを添加し、mTfR1の誘導後、3時間で集菌を行った。集菌した細胞をSTDバッファー(20mM Hepes-KOH(pH7.4)、150mM 塩化ナトリウム)で洗浄した。STDバッファーで懸濁した細胞は、超音波破砕を20秒間(30秒間インターバル)で10回繰り返した後、10,000×g、4℃、15分間、遠心を行い、未破砕細胞を除いたものをライセート(上清)として用いた。精製Strep-mTfR1は、その上清からカラム(商品名:Strep-tactin supper-flow sepharoseカラム、IBA社製)を用いたアフィニティー精製及びゲルろ過(商品名:NAP-10カラム、GEヘルスケア社製)を行い調製した。 -生ポリオウイルスの調製- 5質量% ウシ胎児血清(NCS)含有D-MEMで培養したAGMK(アフリカミドリザル腎臓)細胞にポリオウイルス(Mahoney株)を感染させ、AGMK細胞の培養上清から生ポリオウイルスを調製した。この生ポリオウイルスのウイルス力価は10 8 pfu/mLであった。 -混合液2-1の調製- 150μLの前記生ポリオウイルスと、10μgの前記Strep-mTfR1とをSTDバッファー中に混合し、混合液の量を合計0.25mLになるように調製し、37℃にて2時間インキュベートし、次いで、4℃で16時間インキュベートした。 -混合液2-2の調製- 混合液2-1の調製において、Strep-mTfR1を添加しなかったこと以外は、混合液2-1と同様の方法で混合液2-2を調製した。 -混合液2-3の調製- 混合液2-1の調製において、Strep-mTfR1に代えて、Strep-tagII(IBA社製)を用いたこと以外は、混合液2-1と同様の方法で混合液2-3を調製した。 <ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合試験> 混合液2-1~混合液2-3を、それぞれStrep-Tactin(登録商標) Sepharose(Super flow)(IBA社製)に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、900rpmで3分間遠心し、上清を捨てた後、沈殿に200μLのSTDバッファーを添加し、900rpmで3分間遠心することにより該沈殿を洗浄した。この洗浄を合計5回行うことで精製した。この精製により、Strep-Tactin(登録商標) Sepharose(Super flow)に結合したもの(Strep-tagを有するもの及び/又はそれと結合したもの)は沈殿に残り、結合しなかったものは洗浄される。 精製後、得られた沈殿に、STDバッファーに懸濁した5mM Desthiobiotin(シグマ社製)を8μL添加し、900rpmで3分間遠心し、この上清を得た。これにより、Strep-Tactin(登録商標) Sepharose(Super flow)と、該Strep-Tactin(登録商標) Sepharoseに結合したものとの結合がはずれ、上清中に溶出される。 精製した混合液2-1~混合液2-3の上清にSDS-PAGE用5×サンプルバッファーを添加した。また、ポジティブコントロールとして、未精製の混合液2-1を25μL(混合液合計量の10質量%)採取し、これにSDS-PAGE用5×サンプルバッファーを添加した。これらを、95℃で3分間インキュベートした後、900rpmで3分間遠心して得られた上清をSDS-PAGE用サンプルとした。 なお、前記SDS-PAGE用5×サンプルバッファーの組成は、0.312M トリス塩酸(pH6.8)、5質量% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、50質量% グリセロール、0.025質量% ブロモフェノールブルー(BPB)、5mM ジチオトレイトール(DTT)である。以下の試験例においても、同様にこのSDS-PAGE用5×サンプルバッファーを使用した。 これらのサンプルを用いて、常法に従いSDS-PAGE及びウエスタンブロットを行った。なお、ウエスタンブロットは、1次抗体として、抗ポリオウイルス粒子抗体(商品名:ウサギ由来ポリクローナル抗体)又は、抗ウシ血清抗体(商品名:Anti Serum albumin、mouse monoclonal antibody、ANTIBODY SHOP社製)を用い、2次抗体として、抗ウサギIg-HRP抗体(商品名:Anti-Rabbit Ig-HRP、DAKO社製)を用いて行った。 結果を図3に示す。ポリオウイルスとStrep-mTfR1とを含む混合液2-1を用いた場合、精製後においてもバンドが検出された。この結果より、ポリオウイルスは、トランスフェリン受容体と直接結合することがわかった。 (試験例3:トランスフェリン受容体におけるポリオウイルスの結合領域の同定) 次に、ポリオウイルスがトランスフェリン受容体のどの領域で結合しているかを以下の方法で確認した。 図4に示すように、マウスのトランスフェリン受容体1(mTfR1)は、N末端側からアミノ酸の、第124残基~第185残基が第1のプロテアーゼ様ドメイン(PD1)、第186残基~387残基がアピカルドメイン(AD)、第388残基~608残基が第2のプロテアーゼ様ドメイン(PD2)、第609残基~第763残基がヘリカルドメイン(HD)であることが知られている。これらは、細胞外ドメインを構成するドメインである。 試験例2で調製したpASK-mTfR1を鋳型としてPCR法により常法で、細胞外ドメイン全長からなるコンストラクト1、PD1及びADからなるコンストラクト2、細胞外ドメイン全長からADを除いた(ΔAD)コンストラクト3、ADのみからなるコンストラクト4、PD2及びHDからなるコンストラクト5、及び、PD1のみからなるコンストラクト6の6種類のコンストラクトを作製した。コンストラクト1~6の概略説明図を図5に示す。 作製したコンストラクト1から5は、Strep-tag発現ベクター(商品名:pASK-IBA7(+)、IBA社製)にクローニングした。また、コンストラクト6は、GST-tag発現ベクター(商品名:pGEX-p4X、プロメガ社製)にクローニングした。 以下、前記コンストラクト1を含む発現ベクターを「pASK-コンストラクト1」、前記コンストラクト2を含む発現ベクターを「pASK-コンストラクト2」、前記コンストラクト3を含む発現ベクターを「pASK-コンストラクト3」、前記コンストラクト4を含む発現ベクターを「pASK-コンストラクト4」、前記コンストラクト5を含む発現ベクターを「pASK-コンストラクト5」、前記コンストラクト6を含む発現ベクターを「pGEX-コンストラクト6」とそれぞれ称することがある。 次いで、前記pASK-コンストラクト1を大腸菌JM109株(東洋紡株式会社製)に導入し、組換え体タンパク質1(細胞外ドメイン全長)を発現させた。 前記pASK-コンストラクト1の場合と同様にして、pASK-コンストラクト2を用いて組換え体タンパク質2(PD1+AD)を、pASK-コンストラクト3を用いて組換え体タンパク質3(ΔAD)を、pASK-コンストラクト4を用いて組換え体タンパク質4(AD)を、pASK-コンストラクト5を用いて組換え体タンパク質5(PD2+HD)を、pGEX-コンストラクト6を用いて組換え体タンパク質6(GST-PD1)をそれぞれ発現させた。 試験例2で調製した生ポリオウイルス 150μLと、前記組換え体タンパク質1~6のいずれか 10μgと、STDバッファーとをそれぞれ混合した混合液を合計0.3mLとなるように調製し、37℃にて2時間インキュベートし、次いで、4℃で16時間インキュベートした。 これらの混合液を、試験例2と同様の方法でSDS-PAGE用サンプルとし、試験例2と同様の方法でSDS-PAGE及びウエスタンブロットを行った。 結果を下記表1に示す。下記表1において、「○」は、組換え体タンパク質とポリオウイルスとが結合したもの(ウエスタンブロットでバンドが検出されたもの)を示し、「×」は結合しなかったもの(ウエスタンブロットバンドが検出されなかったもの)を示す。 表1の結果より、ポリオウイルスは、トランスフェリン受容体のADと結合することがわかった。なお、トランスフェリン等のトランスフェリン受容体と結合することが知られている他のリガンドは、PD2+HDに結合することが報告されており(Cheng Y et al., 2004, Cell, 116:565-576参照)、ポリオウイルスの結合部位はこれらの公知のリガンドの結合部位とは異なっていた。 (試験例4-1:トランスフェリン受容体におけるポリオウイルスの結合部位の同定) ポリオウイルスと、マウスのトランスフェリン受容体1(mTfR1)との結合能をウエスタンブロットにより検討した。図6に、試験例4-1のウエスタンブロットによる検討の概略説明図を示す。 -GST-mTfR1の調製- 下記配列番号:5で表されるアミノ酸配列は、マウスのトランスフェリン受容体1(mTfR1)の一部の配列である。この下記配列番号:5で表されるアミノ酸配列を、GST-tag発現ベクター(商品名:pGEX-p4X、プロメガ社製)にクローニングし、試験例3と同様の方法でGST融合組換え体タンパク質(以下、「GST-mTfR1」と称することがある。)を調製した。 321-TQFPPSQSS-329 (配列番号:5) -混合液4-1の調製- 試験例2で調製した生ポリオウイルス 150μLと、前記GST-mTfR1 10μgと、STDバッファーとを混合した混合液を合計0.2mLとなるように調製し、37℃にて2時間インキュベートし、次いで、4℃で16時間インキュベートした。 -混合液4-2の調製- 混合液4-1の調製において、GST-mTfR1に代えて、GST-tag(プロメガ社製)を用いたこと以外は、混合液4-1と同様の方法で混合液4-2を調製した。 -混合液4-3の調製- 混合液4-1の調製において、ポリオウイルスを添加しなかったこと以外は、混合液4-1と同様の方法で混合液4-3を調製した。 -混合液4-4の調製- 混合液4-1の調製において、GST-mTfR1を添加しなかったこと以外は、混合液4-1と同様の方法で混合液4-4を調製した。 -混合液4-5の調製- 混合液4-1の調製において、GST-mTfR1に代えて、試験例2で調製したStrep-mTfR1を用いたこと以外は、混合液4-1と同様の方法で混合液4-5を調製した。 <トランスフェリン受容体とポリオウイルスとの結合試験> 混合液4-1~混合液4-4を、それぞれGlutathione―Sepharose(fast-flow)(GEヘルスケア社製)に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、900rpmで3分間遠心し、上清を捨てた後、沈殿に200μLのSTDバッファーを添加し、900rpmで3分間遠心することにより該沈殿を洗浄した。この洗浄を合計5回行うことで精製した。この精製により、Glutathione-Sepharoseに結合したもの(GST-tagを有するもの及び/又はそれと結合したもの)は沈殿に残り、結合しなかったものは洗浄される。 精製後、得られた沈殿に、STDバッファーに懸濁した10mMグルタチオンを8μL添加し、900rpmで3分間遠心し、この上清を得た。これにより、Glutathione-Sepharoseと、該Glutathione-Sepharoseに結合したものとの結合がはずれ、上清中に溶出される。 また、混合液4-5は、Strep-Tactin(登録商標) Sepharose(Super flow)(IBA社製)に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、900rpmで3分間遠心し、上清を捨てた後、沈殿に200μLのSTDバッファーを添加し、900rpmで3分間遠心することにより該沈殿を洗浄した。この洗浄を合計5回行うことで精製した。 精製後、得られた沈殿に、STDバッファーに懸濁した5mM Desthiobiotin(シグマ社製)を8μL添加し、900rpmで3分間遠心し、この上清を得た。 精製した混合液4-1~混合液4-5の上清、及び未精製の混合液4-1を試験例2と同様の方法でSDS-PAGE用サンプルとし、試験例2と同様の方法でSDS-PAGE及びウエスタンブロットを行った。 結果を図7-1に示す。ポリオウイルスと、Strep-mTfR1とを含む混合液を用いたポジティブコントロールでは、精製後にバンドが検出された。これと同様に、ポリオウイルスと、GST-mTfR1とを含む混合液を用いた場合も、精製後においてバンドが検出された。 この結果より、配列番号:5で表されるアミノ酸配列がポリオウイスルとの結合に直接関与していることがわかった。 (試験例4-2:トランスフェリン受容体におけるポリオウイルスの結合部位の同定) ポリオウイルスと、マウスのトランスフェリン受容体1(mTfR1)以外のトランスフェリン受容体との結合能についても、試験例4-1と同様の方法で検討した。 -GST-hTfR1の調製- 下記配列番号:6で表されるアミノ酸配列は、ヒトのトランスフェリン受容体1(hTfR1)の一部の配列である。この下記配列番号:6で表されるアミノ酸配列を、GST-tag発現ベクター(商品名:pGEX-p4X、プロメガ社製)にクローニングし、試験例3と同様の方法でGST融合組換え体タンパク質(以下、「GST-hTfR1」と称することがある。)を調製した。 318-TQFPPSRSS-326 (配列番号:6) -GST-hTfR2の調製- 下記配列番号:7で表されるアミノ酸配列は、ヒトのトランスフェリン受容体2(hTfR2)の一部の配列である。この下記配列番号:7で表されるアミノ酸配列を、GST-tag発現ベクター(商品名:pGEX-p4X、プロメガ社製)にクローニングし、試験例3と同様の方法でGST融合組換え体タンパク質(以下、「GST-hTfR2」と称することがある。)を調製した。 341-TQFPPVASS-349 (配列番号:7) -GST-mTfR2の調製- 下記配列番号:8で表されるアミノ酸配列は、マウスのトランスフェリン受容体2(mTfR2)の一部の配列である。この下記配列番号:8で表されるアミノ酸配列を、GST-tag発現ベクター(商品名:pGEX-p4X、プロメガ社製)にクローニングし、試験例3と同様の方法でGST融合組換え体タンパク質(以下、「GST-mTfR2」と称することがある。)を調製した。 336-TQFPPVESS-344 (配列番号:8) -混合液4-6の調製- 試験例2で調製した生ポリオウイルス 100μLと、前記GST-hTfR1 5μgと、STDバッファーとを混合した混合液を合計0.2mLとなるように調製し、37℃にて2時間インキュベートし、次いで、4℃で16時間インキュベートした。 -混合液4-7の調製- 混合液4-6の調製において、GST-hTfR1に代えて、試験例4-1で調製したGST-mTfR1を用いたこと以外は、混合液4-6と同様の方法で混合液4-7を調製した。 -混合液4-8の調製- 混合液4-6の調製において、GST-hTfR1に代えて、GST-hTfR2を用いたこと以外は、混合液4-6と同様の方法で混合液4-8を調製した。 -混合液4-9の調製- 混合液4-6の調製において、GST-hTfR1に代えて、GST-mTfR2を用いたこと以外は、混合液4-6と同様の方法で混合液4-9を調製した。 -混合液4-10の調製- 混合液4-6の調製において、GST-hTfR1に代えて、GST-tag(プロメガ社製)を用いたこと以外は、混合液4-6と同様の方法で混合液4-10を調製した。 -混合液4-11の調製- 混合液4-6の調製において、GST-hTfR1を添加しなかったこと以外は、混合液4-6と同様の方法で混合液4-11を調製した。 <トランスフェリン受容体とポリオウイルスとの結合試験> 混合液4-6~混合液4-11を用いて、試験例4-1と同様の方法で、Glutathione―Sepharose(fast-flow)(GEヘルスケア社製)を用いたトランスフェリン受容体とポリオウイルスとの結合試験を行った。 精製した混合液4-6~混合液4-11の上清、及び前記試験例4-1における未精製の混合液4-1を試験例2と同様の方法でSDS-PAGE用サンプルとし、試験例2と同様の方法でSDS-PAGE及びウエスタンブロットを行った。 結果を図7-2に示す。マウスのトランスフェリン受容体1(mTfR1)の部分配列(配列番号:5)の結果と同様に、ヒトのトランスフェリン受容体1(hTfR1)の部分配列(配列番号:6)、ヒトのトランスフェリン受容体2(hTfR2)の部分配列(配列番号:7)、及びマウスのトランスフェリン受容体2(mTfR2)の部分配列(配列番号:8)も、ポリオウイスルとの結合に直接関与していることがわかった。 (試験例5:ポリオウイルスにおけるトランスフェリン受容体結合部位の同定) ポリオウイルス(Mahoney株)をX線結晶解析(PDB ID:1HXS)により決定された立体構造の(2.2Å)結果を図8に示す。ウイルス粒子径は30nmであった。ポリオウイルス表面において黒く見える箇所は、ポリオウイルス粒子の中でへこんでいる箇所であり、キャニオンと呼ばれる。ここには、VP1、VP2、及び、VP3と呼ばれるタンパク質が存在する。前記VP1におけるトランスフェリン受容体の結合能を以下の方法で検討した。 -MBP-VP1GHストランドIの調製- GeneBanK登録番号:EF374015.1のポリオウイルスのRNAゲノム配列情報を基にプライマーを設計し、ポリオウイルスのcDNA配列を鋳型としてPCR法により常法で、ポリオウイルスのVP1におけるGHストランドと呼ばれる領域(第637塩基~第735塩基)を増幅させた。 増幅したVP1GHストランドIの遺伝子断片をMBP発現ベクター(商品名:pMAL-p4X、New England Biolabs(NEB)社製)にクローニングし、試験例3と同様の方法で形質転換を行い、VP1GHストランドIとMBPとの融合組換え体タンパク質(以下、「MBP-VP1GHストランドI」と称することがある。)を調製した。 なお、前記MBP-VP1GHストランドIは、下記配列番号:19で表される、ポリオウイルスのVP1におけるGHストランドの第213残基~第245残基のアミノ酸配列を有する。 213-SKVPLKDQSAELGDSLYGAASLNDFGILAVRVV-245 (配列番号:19) -MBP-VP1GHストランドIIの調製- GeneBanK登録番号:V01149のポリオウイルスのRNAゲノム配列情報を基にプライマーを設計し、ポリオウイルスのcDNA配列を鋳型としてPCR法により常法で、ポリオウイルスのVP1におけるGHストランドと呼ばれる領域(第637塩基~第739塩基)を増幅させた。 前記MBP-VP1GHストランドIの調製において、VP1GHストランドIの遺伝子断片に代えて、VP1GHストランドIIの遺伝子断片を用いたこと以外は前記MBP-VP1GHストランドIの調製と同様の方法で、VP1GHストランドIIとMBPとの融合組換え体タンパク質(以下、「MBP-VP1GHストランドII」と称することがある。)を調製した。 なお、前記MBP-VP1GHストランドIIは、下記配列番号:20で表される、ポリオウイルスのVP1におけるGHストランドの第213残基~第245残基のアミノ酸配列を有する。 213-SKVPLKDQSAALGDSLYGAASLNDFGILAVRVV-245 (配列番号:20) -MBP-VP1GHループの調製- GeneBanK登録番号:V01149のポリオウイルスのRNAゲノム配列情報に従い、下記配列番号:9で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:10で表されるアンチセンスプライマーを用いたPCR法により常法で、ポリオウイルスのVP1におけるGHループと呼ばれる領域をコードする(第667塩基~第1,006塩基)を増幅させた。 前記MBP-VP1GHストランドIの調製において、VP1GHストランドIの遺伝子断片に代えて、VP1GHループの遺伝子断片を用いたこと以外は前記MBP-VP1GHストランドIの調製と同様の方法で、VP1GHループとMBPとの融合組換え体タンパク質(以下、「MBP-VP1GHループ」と称することがある。)を調製した。 なお、前記MBP-VP1GHループは、下記配列番号:1で表される、ポリオウイルスのVP1におけるGHループの第223残基~第235残基のアミノ酸配列を有する。 センスプライマー: 5’-GCTCTAGAGACCAATCAGCAGCGTTGGGCGATTCACTTTATGGTGCTGCATCC-3’ (配列番号:9) アンチセンスプライマー: 5’-CCCAAGCTTCTATTATTAGTTCAAGGATGCAGCACCATAAAGTGAATC-3’ (配列番号:10) 223-ALGDSLYGAASLN-235 (配列番号:1) -混合液5-1の調製- 0.5μgのMBP-VP1GHループと、5μgの試験例4-1で調製したGST-mTfR1と、STDバッファーとを混合した混合液を合計10μLとなるように調製し、23℃にて2時間インキュベートし、次いで、4℃で16時間インキュベートした。 -混合液5-2の調製- 混合液5-1の調製において、MBP-VP1GHループを添加しなかったこと以外は、混合液5-1と同様の方法で混合液5-2を調製した。 -混合液5-3の調製- 混合液5-1の調製において、MBP-VP1GHループに代えて、MBP(NEB社製)を用いたこと以外は、混合液5-1と同様の方法で混合液5-3を調製した。 -混合液5-4の調製- 混合液5-1の調製において、MBP-VP1GHループに代えて、MBP-VP1GHストランドIを用いたこと以外は、混合液5-1と同様の方法で混合液5-4を調製した。 -混合液5-5の調製- 混合液5-1の調製において、MBP-VP1GHループに代えて、MBP-VP1GHストランドIIを用いたこと以外は、混合液5-1と同様の方法で混合液5-5を調製した。 <ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合試験> 混合液5-1~混合液5-5を、それぞれアミロースレジン(商品名:Amylose-resin、NEB社製)に添加し、4℃で1時間インキュベートした。次いで、900rpmで3分間遠心し、上清を捨てた後、沈殿に200μLの1質量%Triton X-100含有STDバッファーを添加し、900rpmで3分間遠心することにより該沈殿を洗浄した。この洗浄を合計5回行うことで精製した。この精製により、アミロースレジンに結合したもの(MBPを有するもの及び/又はそれと結合したもの)は沈殿に残り、結合しなかったものは洗浄される。 精製後、得られた沈殿に、1質量%Triton X-100含有STDバッファーに懸濁した20mMマルトースを8μL添加し、900rpmで3分間遠心し、この上清を得た。これにより、アミロースレジン、該アミロースレジンに結合したものとの結合がはずれ、上清中に溶出される。 精製した混合液5-1~混合液5-5の上清、及び未精製の混合液5-1を試験例2と同様の方法でSDS-PAGE用サンプルとし、常法に従いSDS-PAGE及びウエスタンブロットを行った。 なお、ウエスタンブロットは、1次抗体として、抗GST抗体(商品名:Anti-GST-tag,mouse monoclonal antibody、MBL社製)を用い、2次抗体として、抗マウスIG-HRP抗体(商品名:Anti-mouse Ig-HRP、Dako社製)を用いて行った。 結果を図9に示す。MBP-VP1GHループとGST-mTfR1とを含む混合液5-1を用いた場合、精製後においてもバンドが検出された。また、MBP-VP1GHストランドIとGST-mTfR1とを含む混合液5-4を精製したもの、及び、MBP-VP1GHストランドIIとGST-mTfR1とを含む混合液5-5を精製したものについてもバンドが検出された。 この結果より、ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合には、ポリオウイルスのVP1における配列番号:1で表されるアミノ酸配列と、トランスフェリン受容体のADにおける配列番号:5で表されるアミノ酸配列とが結合することによるものであることが明らかになった。 (試験例6:ポリオウイルスにおけるトランスフェリン受容体結合部位の同定) VP1の試験例5とは異なる領域におけるトランスフェリン受容体の結合能を以下の方法で検討した。 -MBP-VP1BCループの調製- GeneBanK登録番号:V01149のポリオウイルスのRNAゲノム配列情報を基に、下記配列番号:11で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:12で表されるアンチセンスプライマーを用いたPCR法により常法で、ポリオウイルスのVP1におけるBCループと呼ばれる領域をコードする(第268塩基~第327塩基)を増幅させた。 増幅したVP1BCループの遺伝子断片をMBP発現ベクター(商品名:pMAL-p4X、NEB社製)にクローニングし、試験例3と同様の方法で形質転換を行い、VP1BCループとMBPとの融合組換え体タンパク質(以下、「MBP-VP1BCループ」と称することがある。)を調製した。 なお、前記MBP-VP1BCループは、下記配列番号:2で表される、ポリオウイルスのVP1におけるBCループの第91残基~第109残基のアミノ酸配列を有する。 センスプライマー: 5’-GCTCTAGAATGACTGTGGACAACCCGGCTTCTACTACAAACAAAGACAAATTGTTTTCT-3’ (配列番号:11) アンチセンスプライマー: 5’-CCCAAGCTTCTATTATTACTTCCACACAGAAAACAATTTGTCTTTGTTTGTAGT-3’ (配列番号:12) 91-MTVDNPASTTNKDKLFSVWK-109 (配列番号:2) -MBP-VP1EFループの調製- GeneBanK登録番号:V01149のポリオウイルスのRNAゲノム配列情報を基に、下記配列番号:13で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:14で表されるアンチセンスプライマーを設計し、ポリオウイルスのcDNA配列を鋳型としてPCR法により常法で、ポリオウイルスのVP1におけるEFループと呼ばれる領域(第484塩基~第507塩基)を増幅させた。 前記MBP-VP1BCループの調製において、VP1BCループの遺伝子断片に代えて、VP1EFループの遺伝子断片を用いたこと以外は前記MBP-VP1BCループの調製と同様の方法で、VP1BCループとMBPとの融合組換え体タンパク質(以下、「MBP-VP1BCループ」と称することがある。)を調製した。 なお、前記MBP-VP1EFループは、ポリオウイルスのVP1におけるEFループの第162残基~第169残基のアミノ酸配列(下記配列番号:3で表されるアミノ酸配列)を有する。 センスプライマー: 5’-GCTCTAGACCAGGGGCACCGGTGCCAGAGAAATAAT-3’ (配列番号:13) アンチセンスプライマー: 5’-CCCAAGCTTCTATTATTATTTCTCTGGCACCGGTGC-3’ (配列番号:14) 162-PGAVPEK-169 (配列番号:3) -MBP-VP1FGループの調製- GeneBanK登録番号:V01149のポリオウイルスのRNAゲノム配列情報を基に、下記配列番号:21で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:22で表されるアンチセンスプライマーを設計し、ポリオウイルスのcDNA配列を鋳型としてPCR法により常法で、ポリオウイルスのVP1におけるFGループと呼ばれる領域(第528塩基~第617塩基)を増幅させた。 前記MBP-VP1BCループの調製において、VP1BCループの遺伝子断片に代えて、VP1FGループの遺伝子断片を用いたこと以外は前記MBP-VP1BCループの調製と同様の方法で、VP1FGループとMBPとの融合組換え体タンパク質(以下、「MBP-VP1FGループ」と称することがある。)を調製した。 なお、前記MBP-VP1FGループは、ポリオウイルスのVP1におけるFGループの第176残基~第205残基のアミノ酸配列(下記配列番号:23で表されるアミノ酸配列)を有する。 センスプライマー: 5’-GCTCTAGACAAACGTCCTCCAACCCATCAATTTTCTACACCTACGGCACGGCACCAGCTCGAATT-3’ (配列番号:21) アンチセンスプライマー: 5’-CCCAAGCTTTTACTATTAATACGCGTTAGAAATGCCAACGTATGGAACCGAAATTCGAGCTGGTGCCGTGCCGTAGGT-3’ (配列番号:22) 176-PSIFYTYGTAPARISVPYVGISNAY-205 (配列番号:23) -MBP-VP1C末端の調製- GeneBanK登録番号:V01149のポリオウイルスのRNAゲノム配列情報を基に、下記配列番号:15で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:16で表されるアンチセンスプライマーを設計し、ポリオウイルスのcDNA配列を鋳型としてPCR法により常法で、ポリオウイルスのVP1におけるC末端領域(第883塩基~第906塩基)を増幅させた。 前記MBP-VP1BCループの調製において、VP1BCループの遺伝子断片に代えて、VP1C末端領域の遺伝子断片を用いたこと以外は前記MBP-VP1BCループの調製と同様の方法で、VP1C末端領域とMBPとの融合組換え体タンパク質(以下、「MBP-VP1C末端領域」と称することがある。)を調製した。 なお、前記MBP-VP1C末端は、ポリオウイルスのVP1におけるC末端の第295残基~第302残基のアミノ酸配列(下記配列番号:4で表されるアミノ酸配列)を有する。 センスプライマー: 5’-GCTCTAGACTCGCTCCCTTATCCACCAAAGACCTGACAACGTACGCTAG-3’ (配列番号:15) アンチセンスプライマー: 5’-CCCAAGCTTCTATTATTAGTACGTTGTCAGGTCTTTGGTGGAT-3’ (配列番号:16) 295-STKDLTTY-302 (配列番号:4) -混合液6-1の調製- 0.5μgのMBP-VP1FGループと、5μgの試験例4-1で調製したGST-mTfR1と、STDバッファーとを混合した混合液を合計10μLとなるように調製し、23℃にて2時間インキュベートし、次いで、4℃で16時間インキュベートした。 -混合液6-2の調製- 混合液6-1の調製において、MBP-VP1FGループに代えて、MBPを用いたこと以外は、混合液6-1と同様の方法で混合液6-2を調製した。 -混合液6-3の調製- 混合液6-1の調製において、MBP-VP1FGループに代えて、MBP-VP1BCループを用いたこと以外は、混合液6-1と同様の方法で混合液6-3を調製した。 -混合液6-4の調製- 混合液6-1の調製において、MBP-VP1FGループに代えて、MBP-VP1EFループを用いたこと以外は、混合液6-1と同様の方法で混合液6-4を調製した。 -混合液6-5の調製- 混合液6-1の調製において、MBP-VP1FGループに代えて、試験例5で調製したMBP-VP1GHループを用いたこと以外は、混合液6-1と同様の方法で混合液6-5を調製した。 -混合液6-6の調製- 混合液6-1の調製において、MBP-VP1FGループに代えて、MBP-VP1C末端を用いたこと以外は、混合液6-1と同様の方法で混合液6-6を調製した。 <ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合試験> 試験例5のポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合試験において、混合液5-1~混合液5-5に代えて、混合液6-1~混合液6-6を用いたこと以外は、試験例5と同様の方法で結合試験を行った。 精製した混合液6-1~混合液6-6の上清、及び未精製の混合液6-1を試験例2と同様の方法でSDS-PAGE用サンプルとし、試験例5と同様の方法でSDS-PAGE及びウエスタンブロットを行った。 結果を図10に示す。GST-mTfR1にMBPのみを混合した混合液6-2以外は全てバンドが検出された。 この結果より、ポリオウイルスとトランスフェリン受容体との結合には、ポリオウイルスのVP1における配列番号:2から4で表されるアミノ酸配列と、トランスフェリン受容体のADにおける配列番号:5で表されるアミノ酸配列との結合が関与することが明らかになった。 (試験例7:配列番号:1で表されるペプチドの血液脳関門の透過) -Alexa488-MBP-VP1GHループの調製- 試験例5で調製したMBP-VP1GHループのMBPタグのアミノ酸側鎖の一級アミノ酸部位にAlexa Fluor(登録商標) 488-Protein Labeling Kit(インビトロジェン社製)を用いてAlexa Fluor(登録商標) 488を導入した。蛍光ラベルを付したMBP-VP1GHループを、以下「Alexa488-MBP-VP1GHループ」と称することがある。 このAlexa488-MBP-VP1GHループは、STDバッファーにて濃度2mg/mLとなるように調製した。 -Alexa488-MBPの調製- Alexa488-MBP-VP1GHループの調製において、MBP-VP1GHループに代えて、MBP2を用いたこと以外は、Alexa488-MBP-VP1GHループの調製と同様の方法でMBPに蛍光ラベルを付した。蛍光ラベルを付したMBPを、以下「Alexa488-MBP」と称することがある。 このAlexa488-MBPは、Alexa Fluor(登録商標) 488-Protein Labeling Kit(インビトロジェン社製)を用いて、濃度2mg/mLとなるように調製した。 <配列番号:1で表されるペプチドの血液脳関門透過試験> 試験例1と同様の血液脳関門のインビトロモデル培養系を用いて試験を行った。 トランズウェル内の脳血管内皮細胞の培養液に、前記Alexa488-MBP-VP1GHループ90μg/mL、蛍光ラベル化トランスフェリン(Alexa Fluor(登録商標) 488-transferrin(インビトロジェン社製)、以下、「Alexa488-Tf」と称することがある。)180μg/mL、前記Alexa488-MBP90μg/mL、又は前記デキストランの蛍光標識体(重量平均分子量:70kDaのAlexa Flor(登録商標) 488標識体、インビトロジェン社製)180μg/mLをそれぞれトランズウェル培養プレート(コーニング社製)上層部に添加し、10分間後、20分間後、30分間後のトランズウェル培養プレート下層部の培養液をそれぞれ回収し、分光蛍光光度計(商品名:F-2500、株式会社日立ハイテクノロジーズ製)にて蛍光強度を観察し、これをトランズウェル内の脳血管内皮細胞を透過した量として測定した。 結果を図11に示す。Alexa488-MBP-VP1GHループのPS値は0.82であり、蛍光ラベル化トランスフェリンのPS値は0.33であり、Alexa488-MBPのPS値は0.28であり、デキストランの蛍光標識体のPS値は0.33であった。 Alexa488-MBP-VP1GHループは、トランスフェリンと同様に、脳血管内皮細胞を透過し、その透過速度も同程度であった。 この結果より、配列番号:1で表されるアミノ酸配列を含むペプチドは、血液脳関門を透過できることがわかった。 <共焦点顕微鏡観察による血液脳関門透過の確認> マウス由来cDNAを用いてトランスフェリンレセプター1(mTfR1)の全長遺伝子を、試験例2と同様に、GeneBank登録番号 BC054522.1の情報を基に設計した下記配列番号:24で表されるセンスプライマー及び下記配列番号:25で表されるアンチセンスプライマーを用いてPCR法で調製した。 センスプライマー:5’-CCGCTCGAGGCCACCATGATGGATCAAGCCAGATCA-3’ (配列番号:24) アンチセンスプライマー:5’-CGCGGATCCCGAAACTCATTGTCAATATTCC-3’ (配列番号:25) 増幅した遺伝子断片を赤色蛍光タンパク質発現ベクター(商品名:pmCherry-N1、クロンテック社製)のXhoIとBamHIとの切断部位に挿入することにより、mTfR1のカルボキシル末端にmCherryを融合した発現ベクター(以下、「pmCherry-mTfR1」と称することがある。)を得た。これを試験例1で用いた脳血管内皮細胞にFuGENE6(NEB社製)を用いてトランスフェクションし、mCherry-mTfR1の発現を行った。 このmCherry-mTfR1を発現させた脳血管内皮細胞に、前記Alexa488-MBP-VP1GHループを添加し、共焦点顕微鏡(Carl Zeiss社製)で60分間観察した。 その結果、トランスフェリン受容体とAlexa488-MBP-VP1GHループとが結合し、約20分間で脳血管内皮細胞内に取り込まれる様子が観察された。一方、Alexa488-MBPは取り込まれなかった。 これまでの結果に基づき、タンパク質-タンパク質間の相互作用をE_RDock及びZDockを用いてドッキングシュミレーションを行った。解析プログラムは、ACCELYS社製を使用した。図12Aは、ポリオウイルスのVP1、VP2、及びVP3の複合体のシュミレーションモデル図であり、図12Bは、VP1を拡大したシュミレーションモデル図であり、図12Cは、トランスフェリン受容体のシュミレーションモデル図であり、図12Dは、図12Aの複合体と図12Cのトランスフェリン受容体とが結合したシュミレーションモデル図である。この計算値によっても、ポリオウイルスが有する配列番号:1で表されるアミノ酸配列と、トランスフェリン受容体が有する配列番号:5で表されるアミノ酸配列とが結合することが確認された。 本発明のペプチドは、血液脳関門を透過することができるため、細胞内、特に中枢神経系の細胞に薬物を輸送することができる薬物輸送体、抗ポリオウイルス剤、血液脳関門透過剤、及びトランスフェリン受容体捕捉体などに好適に利用可能である。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}},"description_lang":["ja"],"has_description":true,"has_docdb":true,"has_inpadoc":true,"has_full_text":true,"biblio_lang":"ja"},"jurisdiction":"WO","collections":[],"usersTags":[],"lensId":"157-929-343-615-979","publicationKey":"WO_2012_105595_A1","displayKey":"WO 2012/105595 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\n ALGDSLYGAASLN (配列番号:1)
\n MTVDNPASTTNKDKLFSVWK (配列番号:2)
\n PGAVPEK (配列番号:3)
\n STKDLTTY (配列番号:4)"],"number":1,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":[" 下記配列番号:5から8で表されるアミノ酸配列の少なくともいずれかと結合する請求項1に記載のペプチド。
\n TQFPPSQSS (配列番号:5)
\n TQFPPSRSS (配列番号:6)
\n TQFPPVASS (配列番号:7)
\n TQFPPVESS (配列番号:8)"],"number":2,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":[" 請求項1から2のいずれかに記載のペプチドを含有することを特徴とする薬物輸送体。"],"number":3,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":[" 更に担体を含む請求項3に記載の薬物輸送体。"],"number":4,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":[" 担体が、巨大分子、微小集合体、微小粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、リポソーム、及びエマルジョンから選択される少なくともいずれかである請求項4に記載の薬物輸送体。"],"number":5,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":[" 担体の内部に診断、予防、及び治療の少なくともいずれかを行うための薬物が担持される請求項4から5のいずれかに記載の薬物輸送体。"],"number":6,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":[" 請求項1から2のいずれかに記載のペプチドを含有し、ポリオウイルスによる疾患発症を予防することを特徴とする抗ポリオウイルス剤。"],"number":7,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":[" 請求項1から2のいずれかに記載のペプチドを含有し、血液脳関門を透過することを特徴とする血液脳関門透過剤。"],"number":8,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":[" 請求項1から2のいずれかに記載のペプチドを含有し、トランスフェリン受容体と結合することを特徴とするトランスフェリン受容体捕捉体。"],"number":9,"annotation":false,"title":false,"claim":true}]}},"filters":{"npl":[],"notNpl":[],"applicant":[],"notApplicant":[],"inventor":[],"notInventor":[],"owner":[],"notOwner":[],"tags":[],"dates":[],"types":[],"notTypes":[],"j":[],"notJ":[],"fj":[],"notFj":[],"classIpcr":[],"notClassIpcr":[],"classNat":[],"notClassNat":[],"classCpc":[],"notClassCpc":[],"so":[],"notSo":[],"sat":[]},"sequenceFilters":{"s":"SEQIDNO","d":"ASCENDING","p":0,"n":10,"sp":[],"si":[],"len":[],"t":[],"loc":[]}}