ANTICUERPO ANTI-DECTIN-1 HUMANO. HIBRIDOMA PRODUCTOR DE DICHO ANTICUERPO Y SUS APLICACIONES

ESTADO DE LA TÉCNICA La respuesta inmune innata es Ia encargada del reconocimiento y contención inmediatos de Ia invasión microbiana y dirige Ia respuesta adaptativa contra los patógenos a través del control del crecimiento de los mismos, de Ia expresión de moléculas co-estimuladoras en los fagocitos, de Ia presentación antigénica y de Ia producción de citoquinas y quimioquinas. Estos factores regulan el tráfico de los leucocitos iniciando Ia respuesta inflamatoria, activan las capacidades microbicidas de los fagocitos y dirigen Ia polarización de las células T cooperadoras. La respuesta inflamatoria sirve para limitar Ia infección, pero Ia inflamación tiene que resolverse para evitar procesos patológicos. En este sentido, se ha propuesto que Ia producción de citoquinas inhibitorias como Ia interleuquina (IL)-IO por los neutrófilos, macrófagos, células dendríticas (DCs) y células T reguladoras, tiene un papel importante en las fases tardías de Ia infección para prevenir una activación excesiva de Ia respuesta innata y el establecimiento del comensalismo y quizá de Ia latencia y persistencia del patógeno (Romani 2004).

En Ia respuesta inmune innata, el reconocimiento de los patógenos se lleva a cabo por las células fagocíticas a través de los receptores de patrones de reconocimiento (PRR, Pattern Recognition Receptor) que detectan estructuras microbianas altamente conservadas. El prototipo de PRR son los TLR (Toll-like receptors), pero recientemente se ha demostrado que también receptores de Ia familia de las lectinas como Dectin-1 pueden funcionar como PRRs (Akira y Takeda 2004; Gordon 2002; Brown 2005). El receptor de membrana Dectin-1 humano reconoce polisacáridos con enlaces β(1→3) y/o β(1→6), los llamados β-glucanos, presentes en Ia pared de los hongos (Brown y Gordon 2001 ; Brown et al. 2003). Como consecuencia, Dectin-1 está implicado en Ia respuesta inmune innata frente a patógenos fúngicos (Brown y Gordon 2003) tanto en humanos como en ratón.

La estructura de este receptor contiene una región extracelular con un único dominio de unión a carbohidratos de tipo CTLD (C-type lectin-like domain) (Weis et al. 1998) conectado al dominio intracelular a través de un cuello y una región transmembrana. Dectin-1 sufre un proceso de procesamiento alternativo que da lugar a varias isoformas, sólo dos de ellas funcionales: Dectin-1a (completa) y Dectin-1 b (predominante, carente del cuello). Aunque parecen funcionar de manera similar in vitro, se expresan de forma diferencial según el tipo celular (Willment et al. 2001 , Heinsbroek et al. 2006). En su tallo citoplasmático posee un motivo semi- ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) con dos residuos de tirosina potencialmente fosforilables, implicado en activación celular (Gantner et al. 2003; Brown et al. 2003; Gordon 2002). Identificado inicialmente en macrófagos de ratón como el receptor principal de β-glucanos (Brown y Gordon 2001 ; Willment et al. 2005), Dectin-1 media Ia unión, captación y eliminación de patógenos, dispara Ia respuesta oxidativa generando especies reactivas de oxígeno (ROS) y produce citoquinas pro-inflamatorias y quimioquinas. Además, Dectin-1 está implicado en fenómenos de tolerancia y control de Ia respuesta inmune puesto que puede inducir Ia generación de citoquinas inhibitorias (Interleuquina (IL)-IO, IL-2). Estas funciones pueden influenciar Ia respuesta inmune resultante y, en ciertas circunstancias, llevar a procesos patológicos y de autoinmunidad (Haskard y Landi 2002). Aunque se consideraba que Dectin-1 se expresaba de forma mayoritaria en células dendríticas (DCs) inmaduras y en células de Langerhans y que los estímulos de maduración disminuían su expresión (Ariizumi et al .2000; Hermanz-Falcon et al. 2001 ; Sobanov et al. 2001 ; Yokota et al. 2001 ), posteriormente se comprobó que Dectin-1 no está restringido al linaje mieloide, sino que también se expresa en neutrófilos, eosinófilos, células B y una sub-población de células T (Brown et al. 2002; Taylor et al. 2002; Willment et al. 2005) aunque no en todos los tejidos (Reid. et al. 2004).

Dectin-1 es crucial en Ia respuesta inmune frente a patógenos fúngicos vivos como Candida albicans (Gantner et al. 2005; Taylor et al. 2007), Coccidiodes posadasii (Viriyakosol et al. 2005), Pneumocystis carinii (Steele et al. 2003 y 2005) y Aspergillus fumigatus (Hohl et al. 2005; Steele et al. 2005; Gersuk et al. 2006). La relevancia de este receptor se ha establecido gracias a Ia generación de ratones deficientes en el gen que codifica para Dectin-1 , en los cuales se ha visto que aumenta Ia susceptibilidad a C. albicans (Taylor et al. 2007) y a P. carinii (Saijo et al. 2007). No obstante, el papel que desempeña Dectin-1 en el control de Ia infección es aún controvertido. En cualquier caso, se ha demostrado que Dectin-1 puede desencadenar respuestas específicas contra patógenos en colaboración con los TLRs o de forma independiente de ellos. En Ia vía independiente de TLRs Ia unión del ligando provoca una cascada de señalización intracelular: Ia fosforilación de Ia tirosina proximal del motivo de activación ITAM por Ia tirosina quinasa Src, permite reclutar Ia tirosina quinasa de bazo (Syk, Spleen Tyrosine Kinase). Syk es necesaria para Ia señalización a través del receptor específico de antígeno de células T y B, y en células mieloides se ha descrito como crucial para estimular Ia producción de especies de oxígeno reactivas a través de Dectin-1 (Underhill et al. 2005; Rogers et al. 2005). Tras Ia activación de Syk, se produce una cascada de fosforilación que implica entre otros, al factor de transcripción NF-κB (Dennehy. y Gordon 2007; Dennehy et al. 2008). Recientemente, se ha demostrado que Ia señalización vía Dectin-1 (inducida por β-glucano particulado (zymosan) o con esporas de C. albicans) puede modular directamente Ia expresión génica a través de Ia activación del factor de transcripción NFAT, tanto en macrófagos como en DCs, induciendo a su vez los factores de transcripción Egr2, Egr3 y COX-2 (Goodridge. et al. 2007). Además, Dectin-1 participa en una nueva ruta de señalización independiente de TLRs en DCs, mediando directamente Ia activación de NF-κB vía Ia molécula adaptadora de señalización CARD9 (Gross et al. 2006). La ruta Dectin-1-Syk-CARD9 acopla Ia respuesta inmune y Ia adaptativa, siendo CARD9 necesaria para el desarrollo de una respuesta de tipo linfocito T cooperador (TH-17) frente a patógenos como C. albicans (LeibundGut-Landmann et al. 2007).

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DESCRIPCIÓN DE LA PATENTE

Descripción breve

Un objeto de Ia presente invención Io constituye el anticuerpo anti-

Dectin-1 humano MGD3, caracterizado porque se une y reconoce específicamente el dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ

ID NO2) ya sea un anticuerpo monoclonal o policlonal, en adelante el anticuerpo de Ia invención.

Un objeto más particular de Ia invención es el anticuerpo de Ia invención caracterizado porque es monoclonal que es producido por el hibridoma MGD3 (depositado en Ia colección de cultivos ECACC -

European Collection of Animal CeII Culture- el 6 de Febrero de 2008 con Ia referencia 08020601 ). Otro objeto de Ia presente invención es Ia secuencia de nucleótidos caracterizada por ser codificante del dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO1 ), y por ser: a) una secuencia de nucleótidos análoga a Ia SEQ ID NO1 b) un fragmento de Ia secuencias de a, y c) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) y b).

Otro objeto de Ia invención Io constituye Ia secuencia de aminoácidos aislada de Ia proteína humana Dectin-1 caracterizada porque se corresponde con el dominio 71-247 de ésta (SEQ ID NO2), y por ser: a) una secuencia de aminoácidos análoga a Ia SEQ ID NO2 b) un fragmento de Ia secuencia de a, y c) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) y b).

Un objeto particular de Ia invención es el uso de Ia secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO1 ) para Ia producción de anticuerpos anti-Dectin-1 humanos, ya sean monoclonales o policlonales. Un objeto particular de Ia invención es el uso de Ia secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO2) para Ia producción de anticuerpos anti-Dectin- 1 humanos, ya sean monoclonales o policlonales.

Un objeto de Ia presente invención es el hibridoma caracterizado porque produce un anticuerpo específico del dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO2).

Un objeto particular de Ia invención es el hibridoma de Ia invención caracterizado porque es el hibridoma MGD3 productor del anticuerpo de Ia invención (depositado en Ia colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal CeII Culture-e\ 6 de Febrero de 2008 con Ia referencia

08020601 ). Otro objeto más particular de Ia invención es el uso de hibridoma de Ia invención para Ia producción del anticuerpo monoclonal anti-Dectin-1 humano, preferentemente el anticuerpo monoclonal de Ia invención.

Un objeto de Ia presente invención es una composición biotecnológica, farmacéutica, diagnostica o terapéutica caracterizada porque contiene el anticuerpo de Ia invención.

Uso del anticuerpo de Ia invención para Ia elaboración de una composición biotecnológica, farmacéutica diagnóstica o terapéutica útil para Ia realización de: - ensayos de detección, identificación y/o cuantificación de Ia proteína Dectin-1 humana,

- tratamiento de enfermedades infecciosas, autoinmunes y/o inflamatorias, y

- diagnóstico de enfermedades infecciosas, autoinmunes y/o inflamatorias.

Otro objeto de Ia invención es Ia composición biotecnológica, farmacéutica diagnostica o terapéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo de Ia invención.

Otro objeto particular de Ia invención es el uso de Ia composición de Ia invención y del anticuerpo de Ia invención en un procedimiento ex vivo de detección, identificación y/o cuantificación de Ia proteína Dectin-1 humana.

Otro objeto particular de Ia invención es el uso de Ia composición de Ia invención y del anticuerpo de Ia invención en un procedimiento ex vivo para el diagnóstico de una enfermedad autoinmune, infecciosa y/o inflamatoria.

Otro objeto particular de Ia invención es el uso de Ia composición de Ia invención y del anticuerpo de Ia invención en un procedimiento terapéutico de una enfermedad humana donde Ia proteína Dectin-1 humana presenta un papel etiopatogénico. Otro objeto más particular de Ia invención es el uso de Ia composición de Ia invención y del anticuerpo de Ia invención donde Ia enfermedad a Ia que se Ie aplica el procedimiento terapéutico es una enfermedad inflamatoria, infecciosa y/o autoinmune.

Descripción Detallada

La presente invención se basa en que los inventores han observado que un anticuerpo específico, concretamente un anticuerpo monoclonal y más concretamente el anticuerpo monoclonal MGD3, generado por los inventores al inmunizar ratones con una proteína de fusión que comprende Ia región entre los aminoácidos 71-247 (dominio Dectin-1/71-247) de Ia proteína Dectin-1 humana (SEQ ID NO2), presenta una serie de características que Ie confieren una serie de ventajas técnicas con respecto a los anticuerpos descritos en el estado de Ia técnica, por Io que el anticuerpo MGD3 representa una nueva herramienta biotecnológica útil en el campo de Ia investigación biomédica y en el campo asistencial médico, tanto en el área del diagnóstico como en el ámbito terapéutico.

Las ventajas técnicas que posee el anticuerpo MGD3 de Ia invención son las siguientes: es capaz de inhibir Ia unión del ligando natural a su receptor - en ensayos de citometría de flujo (Figura 6)- de manera análoga a los β-glucanos solubles (laminarina). También es capaz de inhibir de forma significativa Ia producción de citoquinas pro- y antiinflamatorias como TNF-α e interleuquina (IL)-IO, respectivamente, en células dendríticas derivadas de monocitos en respuesta a Ia interacción con esporas de C. albicans (Figuras 7A y 7B). Puede emplearse para detectar cambios en los niveles de expresión del receptor Dectin-1 en leucocitos humanos, Io que podría indicar Ia capacidad de estas células para detectar Ia presencia de patógenos fúngicos como Candida albicans, Coccidiodes posadasii, Pneumocystis carínii y/o Aspergillus fumigatus y por tanto, Ia susceptibilidad hacia estos. Son útiles como marcadores de Ia proteína Dectin-1 humana in vivo en Ia superficie de monocitos, macrófagos, células de Langerhans y células dendríticas derivadas de monocitos de sangre periférica (Figura 3), leucocitos en reposo y activados en procesos infecciosos, por ejemplo por agentes fúngicos, así como en patologías autoinmunes y/o inflamatorias y podrían servir para definir el papel de este receptor en Ia patogenia de estas enfermedades así como para definir Ia susceptibilidad hacia diferentes patologías inflamatorias. Finalmente, los anticuerpos MGD3 de Ia invención pueden ser utilizados como indicadores del efecto terapéutico de distintos agentes antiinflamatorios e inmunosupresores. Además, el anticuerpo MGD3 de Ia invención:

1. reconoce Ia proteína Dectin-1 in vivo en células mieloides con una elevada calidad en Ia relación señal-fondo (ver Figura 3).

2. es el único anticuerpo monoclonal anti-Dectin-1 humano que bloquea Ia unión de Candida albicans en ensayos in vitro con transfectantes estables de Ia proteína.

3. es el único anticuerpo monoclonal anti-Dectin-1 humano que reconoce Ia proteína Dectin-1 humana (SEC ID NO2) con alta afinidad tanto en ensayos de citometría de flujo como de Western Blot (ver Figuras 1 , 2, 3 y 4). 4. es capaz de capturar Ia proteína soluble DECTIN-1-FLAG en ensayos de interacciones moleculares mediante SPR en el biosensor Biacore 3000, Io que indica una gran afinidad por el ligando (Figura 7).

5. es capaz de inhibir de forma significativa Ia producción de TNF-α en DCs derivadas de monocitos que han estado en contacto con esporas de C. albicans (Figura 7A).

6. es capaz de inhibir de forma significativa Ia producción de IL-10 en DCs derivadas de monocitos que han estado en contacto con esporas de C. albicans (Figura 7B).

Todas las características descritas y enumeradas hasta ahora confieren al anticuerpo MGD3 de Ia invención las ventajas técnicas que hacen del mismo un anticuerpo único y ventajoso sobre el resto de anticuerpos anti-Dectin-1 humanos descritos previamente.

La invención, también se refiere a un hibridoma clonado (MGD3) (depositado en Ia colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal CeII Culture- el 6 de Febrero de 2008 con Ia referencia 08020601 ) que produce un anticuerpo monoclonal, denominado en adelante MGD3, que reconoce específicamente el receptor de membrana Dectin-1 humano. Dicho clon se obtuvo por procedimientos estándar de fusión celular entre un linfocito B del bazo de un ratón BALB/c inmunizado y células de mieloma (X63.Ag.653 NP3) (Ejemplo 1 ).

Por Io tanto, un aspecto de Ia presente invención es un anticuerpo anti-Dectin-1 humano, en adelante anticuerpo de Ia invención, que se une y reconoce específicamente el dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO2), ya sea un anticuerpo monoclonal o policlonal. Un aspecto más particular de Ia invención Io constituye el anticuerpo monoclonal de Ia invención y producido por el hibridoma MGD3 (depositado en Ia colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal CeII Culture- el 6 de Febrero de 2008 con Ia referencia 08020601 ), en adelante anticuerpo monoclonal MGD3 de Ia invención. Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo recombinante o minianticuerpo que mantienen su capacidad de unión a antígeno. El término "minianticuerpo" se define como fragmentos derivados de anticuerpos construidos por tecnología de ADN recombinante, que, pese a su menor tamaño, conservan Ia capacidad de unión al antígeno ya que mantienen al menos un dominio variable de inmunoglobulina donde residen las zonas de unión a antígenos, e incluye, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: Fab, F(ab')2, scFv, y anticuerpos recombinantes monodominio (dAbs). En el marco de Ia presente invención, se entiende por anticuerpos recombinantes monodominio y/o dominios tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y reconocimiento independiente, tanto a los dominios variables de cadena pesada (VH), a los dominios variables de cadena ligera (VL), a los anticuerpos recombinantes de camélidos (VHH), los anticuerpos recombinantes de camélidos humanizados, los anticuerpos recombinantes de otras especies camelizados, los anticuerpos monodominio IgNAR de peces cartilaginosos; es decir, que se incluyen tanto dominios que de forma natural son monodominio (caso de VHH e IgNAR), como anticuerpos que por ingeniería se han alterado para que por sí solos sean capaces de interaccionar con el antígeno y mejorar sus propiedades de estabilidad y solubilidad. Se incluye en esta definición cualquier modificación de los anticuerpos recombinantes como su multimerización o Ia fusión a cualquier molécula (p.ej. toxinas, enzimas, antígenos, otros fragmentos de anticuerpos, etc.).

El anticuerpo puede ser obtenido de un ser humano o un animal (p.ej. camellos, llamas, vicuñas, ratones, ratas, conejos, caballos, tiburones nodriza, etc.) o mediante técnicas de DNA recombinante o síntesis química de genes, o bien desde o selección in vitro o in vivo de genotecas de anticuerpos.

Otro aspecto de Ia presente invención es Ia secuencia de nucleótidos caracterizada por ser codificante del dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO1 ), así como cualquier secuencia de nucleótidos análoga a ésta. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a Ia secuencia de nucleótidos mostrada en Ia presente memoria, por ejemplo, mediante Ia introducción de sustituciones de nucleótidos conservativos o no conservativos, incluyendo Ia inserción de uno o más nucleótidos, Ia adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de Ia molécula o Ia deleción de uno o más nucleótidos, en cualquier extremo o en el interior de Ia secuencia, y que constituya una secuencia codificante o péptido con actividad similar a Ia secuencia de Ia proteína humana Dectin-1. En general, una secuencia de nucleótidos análoga es sustancialmente homologa a Ia secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.

Esta secuencia de nucleótidos puede ser utilizada bien en su totalidad o bien de forma parcial mediante fragmentos de Ia misma para Ia expresión del péptido/s correspondientes en distintas células para sus posteriores usos biotecnológicos.

Otro aspecto de Ia presente invención es Ia secuencia de aminoácidos aislada de Ia proteína humana Dectin-1 correspondiente al dominio 71-247 de Ia misma (SEQ ID NO2), así como cualquier secuencia de aminoácidos análoga a ésta. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a Ia secuencia de aminoácidos mostrada en Ia presente memoria, por ejemplo, mediante Ia introducción de sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, incluyendo Ia inserción de uno o más aminoácidos, Ia adición de uno o más aminoácidos en cualquiera de los extremos de Ia molécula o Ia deleción de uno o más aminoácidos, en cualquier extremo o en el interior de Ia secuencia, y que constituya un péptido con actividad similar a Ia secuencia de Ia proteína humana Dectin-1. En general, una secuencia de aminoácidos análoga es sustancialmente homologa a Ia secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. Otro aspecto de Ia invención es el uso de Ia secuencia nucleótidos y de aminoácidos - SEC ID NO1 y SEC ID NO2, respectivamente- para producir anticuerpos anti-Dectin-1 humanos, ya sean monoclonales y policlonales. Otro aspecto de Ia invención es un hibridoma, en adelante hibridoma de Ia invención, que produce un anticuerpo específico del dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO2).

Otro aspecto más particular de Ia invención Io constituye el hibridoma de Ia invención denominado hibridoma MGD3 y productor del anticuerpo MGD3 (depositado en Ia colección de cultivos ECACC -

European Collection of Animal CeII Culture-e\ 6 de Febrero de 2008 con Ia referencia 08020601 ).

Otro aspecto de Ia invención Io constituye el uso del anticuerpo de Ia invención en Ia elaboración de una composición biotecnológica o una composición farmacéutica diagnóstica o terapéutica útil para Ia realización de ensayos de identificación de Ia proteína Dectin-1 humana o para el tratamiento y/o diagnóstico de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias.

Otro aspecto de Ia invención Io constituye una composición biotecnológica, composición farmacéutica diagnóstica o terapéutica que comprende el anticuerpo anti-Dectin-1 de Ia invención.

Otro aspecto de Ia invención Io constituye el uso del anticuerpo o de

Ia composición farmacéutica de Ia invención en un procedimiento ex vivo de detección, identificación y/o cuantificación de Ia proteína anti-Dectin-1 humana, ya sea con fines de investigación o con fines de diagnóstico de una enfermedad humana.

Otro aspecto más particular de Ia presente invención es el uso del anticuerpo anti-Dectin-1 humano o de Ia composición biotecnológica de Ia invención, en un procedimiento biotecnológico ex vivo donde se requiera Ia identificación de Ia proteína Dectin-1 humana, como por ejemplo y sin que ello limite el alcance de Ia invención, en: - ensayos de inmunofluorescencia e inmunohistoquímica

- procesos de inmunoprecipitación de Ia proteína Dectin-1

- ensayos in vivo para reconocer Ia proteína Dectin-1 humana en Ia superficie de monocitos, macrófagos, células de Langerhans y células dendríticas derivadas de monocitos de sangre periférica y que permitan identificar o seleccionar poblaciones que expresan Dectin-1 de poblaciones que no Ia expresan.

- ensayos in vitro de inhibición de Ia unión de hongos, por ejemplo de Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Coccidiodes posadasii, Pneumocystis carínii y Aspergillus fumigatus, al receptor

Dectin-1 expresado en transfectantes estables o transitorios de dicha proteína o en células primarias.

- ensayos in vitro de inhibición de Ia producción de citoquinas mediada por Dectin-1 (por ejemplo TNF-a, IL-6, IL-10, IL-2, etc) Otro aspecto más particular de Ia presente invención es el uso del anticuerpo anti-Dectin-1 humano o de Ia composición farmacéutica diagnóstica de Ia invención en un procedimiento ex vivo de identificación de Ia proteína Dectin-1 humana, como por ejemplo y sin que limite el alcance de Ia invención, en: - Ia identificación de células patogénicas activadas en enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias, que indique el grado de exacerbación de Ia enfermedad y permita medir Ia eficacia de los tratamientos en las fases tempranas de ensayos clínicos con nuevas terapias, - un procedimiento para determinar Ia susceptibilidad a Ia infección por patógenos fúngicos, mediante Ia identificación de cambios en Ia expresión del receptor endógeno de Ia proteína Dectin-1 humana, indicativos de Ia presencia de β-glucano en fluidos biológicos,

- Ia detección y cuantificación por citometría de Ia expresión del receptor de Ia proteína Dectin-1 humana en fagocitos activados en patologías autoinmunes o condiciones de inflamación crónica, como

Ia artritis psoriásica.

Así, otro aspecto particular de Ia presente invención es el uso del anticuerpo anti-Dectin-1 humano o de Ia composición farmacéutica terapéutica de Ia invención en un procedimiento terapéutico de una enfermedad donde Ia proteína Dectin -1 humana presenta un papel etiopatogénico.

El anticuerpo monoclonal anti-Dectin-1 humano de Ia invención, más concretamente el anticuerpo MGD3, podría utilizarse para Ia elaboración de composiciones farmacéuticas útiles en el tratamiento de patologías inflamatorias, ya que bloquea Ia producción de citoquinas pro- inflamatorias que se inducen a través de Dectin-1 (por ejemplo el Factor de Necrosis Tumoral, TNF-alfa) y que están involucradas en Ia patogenia, por ejemplo y sin que limite el alcance de Ia invención, de diversas formas de artritis.

Así, otro objeto de Ia invención es el uso de Ia composición y/o del anticuerpo de Ia invención en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Otro objeto de Ia invención es el uso de Ia composición y/o del anticuerpo de Ia invención en el tratamiento de enfermedades infecciosas y/o autoinmunes.

Otro objeto particular de Ia invención es el uso de Ia composición y/o del anticuerpo de Ia invención en un procedimiento ex vivo para el diagnóstico de una enfermedad autoinmune, infecciosa y/o inflamatoria.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1.- El anticuerpo monoclonal (mAb) MGD3 de Ia invención reconoce Dectin-1 humano en Ia superficie de transfectantes estables. Células de Ia línea celular linfoblástica humana K562 transfectadas establemente con DectiniaFlag (denominadas de ahora en adelante K562Dectin1aFlag) y células de Ia línea parental, fueron teñidas con el mAb anti-Dectin-1 MGD3 y con el control de isotipo (lgG2a) y analizadas por citometría de flujo. En Ia figura solo se muestran las células K562Dectin1aFlag teñidas con el control de isotipo (en gris) y con el anticuerpo MGD3 (en negro). Figura 2.- El mAb MGD3 reconoce Dectin-1 humano en Ia superficie de transfectantes transitorios de Dectin-1. Las células humanas HEK293T se transfectaron transitoriamente con Dectin-1a humano y con el vector vacío (pcDNA 3.1 ) como control. A las 48 horas se realizó una citometría de flujo, tiñendo las células con el mAb anti- Dectin-1 MGD3 (línea negra) y con un control de isotipo (lgG2a, histograma gris).

Figura 3.- El mAb MGD3 de Ia invención reconoce específicamente a Ia proteína Dectin-1 in vivo en Ia superficie de monocitos (MO), macrófagos (M0) y células dendríticas derivadas de monocitos de sangre periférica humana (MDDC). Los MO se obtuvieron mediante purificación con bolas magnéticas acopladas a CD14 (Miltenyi Biotech). Para Ia obtención de M0, se cultivaron los MO durante 5 - 7días en presencia de 1000 U/ml GM-CSF y para obtener MDDCs se cultivaron las células con 1000 U/ml GM-CSF + 10 μg/ml IL-4. Los histogramas grises representan Ia tinción con un mAb control (X63) y Ia línea negra representan Ia tinción con el mAb anti-Dectin-1 MGD3. En Ia parte inferior de Ia figura se muestra Ia tinción obtenida por un marcador específico de cada tipo celular utilizado.

Figura 4.- El mAb MGD3 de Ia invención es capaz de reconocer Dectin-1 humano, en ensayos de Western Blot. Lisados totales de células K562Dectin1aFlag tratadas o no con tunicamicina (3 μM, 16 horas) fueron sometidos a electroforesis (SDS-PAGE) en condiciones no desnaturalizantes (30 μg de proteína celular total/carril), transferido a una membrana y revelado con el mAb MGD3. El MGD3 reconoce una banda de aproximadamente 45 kDa en los carriles de los lisados de las células K562Dectin1aFlag sin tratar con tunicamicina, correspondiente a Ia isoforma a del Dectin-1 humano. En los carriles dónde Ia muestra ha sido tratada con tunicamicina, aparece una banda de aproximadamente 43 kDa que corresponde a esta misma isoforma tras Ia pérdida de N- glicosilaciones debidas al tratamiento.

Figura 5.- El mAb MGD3 es capaz de reconocer Dectin-1 humano en ensayos de inmunofluorescencia. A.- Se utilizaron células K562 WT y K562Dectin1aFlag adheridas a cristales (10 x 104 céls/cubreobjeto) recubiertos con poli-L-lisina. Las células se tiñeron con los mAb anti- Dectin-1 humano MGD3 o con un control de isotipo lgG2a, seguidos de un Ab secundario de cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado a Alexa488 (verde). En Ia figura se muestran las imágenes obtenidas mediante microscopía de fluorescencia utilizando el control de isotipo, y el mAb MGD3. En paralelo se muestra Ia tinción de núcleos con el colorante DAPI (azul), Ia imagen del contraste diferencial (DIC) de Nomarsky y el resultado de solapar las imágenes. En verde tan sólo se observa tinción cuando se utiliza el mAb MGD3 en las células K562Dectin1aFlag. B.- Células HeLa WT y transfectadas transitoriamente con Dectin-1a-Flag, (50 x 103 células/cubreobjeto), se tiñeron con el anticuerpo anti-Dectin-1 humano MGD3, seguido de un Ab secundario de cabra-anti- inmunoglobulinas de ratón conjugado a Alexa488. Del mismo modo, se utilizó un mAb anti-Flag como control positivo de Ia expresión de Ia proteína transfectada. En Ia figura se muestran las imágenes obtenidas mediante microscopía de fluorescencia con el Ab anti-Flag y MGD3. Únicamente muestran tinción las células que expresan Dectin-1. Figura 6.- El mAb MGD3 de Ia invención es capaz de inhibir Ia unión de Candida albicans a Dectin-1 humano en ensayos de citometría de flujo de manera similar a Ia inhibición causada por el β-glucano soluble laminarina. Se estudió Ia capacidad de unión de Candida albicans a células K562 WT y a los transfectantes K562Dectin1aFlag, para Io que se incubaron las células con laminarina (500 μg/ml, SIGMA) o con el mAb MGD3 (2 μg/ml), previamente a Ia incubación con las esporas marcadas con fluoresceína. A.- Análisis por citometría de flujo del bloqueo de Ia unión de esporas a células K562Dectin1aFlag. La línea gris oscura representa el bloqueo por laminarina y Ia línea negra representa el bloqueo por el anticuerpo monoclonal MGD3. En gris aparece Ia unión total, en ausencia de competidor. Se muestra un experimento representativo. B.- Análisis de siete experimentos de citometría realizados en los que se muestra Ia cuantificación de Ia unión (binding) y los bloqueos con el MGD3 y Ia laminarina.

Figura 7.- El mAb MGD3 de Ia invención es capaz de inhibir Ia producción de citoquinas secretadas por células dendríticas en respuesta a esporas de Candida albicans. Se utilizaron células dendríticas humanas derivadas de monocitos de sangre periférica. Las células fueron incubadas con esporas de C. albicans (obtenidas a partir de Ia cepa CAF2). Las esporas fueron previamente inactivadas con luz ultravioleta (U. V.) para evitar su germinación. Los tratamientos de inhibición con 5 μg/ml de los anticuerpos purificados y libres de endotoxinas, anti-Dectin-1 MGD3 (blanco) y el control de isotipo lgG2a (gris), o en ausencia de tratamiento (negro), se pre-incubaron 30 min a 37° C antes de añadir las esporas. Como controles de las condiciones experimentales se utilizaron zymosan (200 μg/ml, SIGMA) y lipopolisacárido (LPS, 100 ng/ml, SIGMA). Se recogieron los sobrenadantes y se cuantificó Ia producción de TNF-α e IL-10 mediante ELISA (Immunotools y R&D respectivamente). (A) Secreción de TNF-a las 6 horas B) producción de IL-10 a las 18 horas. **P<0.01 células no tratadas versus tratadas con el anticuerpo MGD3. Los valores de P fueron calculados por el método de Mann Whitney's two tailed analysis. Los datos representan Ia media ± S. E. de los duplicados de seis diferentes experimentos. Figura 8.- El mAb MGD3 de Ia invención es capaz, en ensayos de interacciones moleculares mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR), de capturar Ia proteína Dectin-1 recombinante humana (dominio extracelular, aminoácidos 71-247) presente en el medio condicionado por el crecimiento de células de mamífero transfectadas. Se utilizó un equipo biosensor Biacore 3000 (GE Healthcare) y un chip modelo CM5, al que se unió un anticuerpo de captura anti-inmunoglobulinas de ratón, de forma covalente, utilizando técnicas estandarizadas de entrecruzamiento de grupos amino. Se muestran las respuestas como señal relativa de resonancia (RU) en función del tiempo en segundos. Las curvas de Ia figura corresponden a Ia sustracción entre Ia señal obtenida para el anticuerpo MGD3 y Ia señal obtenida para el anticuerpo control negativo. La línea base corresponde a Ia señal de inyección del tampón HBS, seguida por Ia inyección de los medios condicionados realizada entre los 300 y 1200 segundos. En esta fase de asociación se observa Ia captura progresiva de las dos formas solubles de Dectin-1 por el anticuerpo. Una vez finalizada Ia inyección, el sistema continúa inyectando tampón y puede observarse Ia disociación de Dectin-1 y de HA-Dectin-1-Flag del complejo formado con el anticuerpo MGD3.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN Ejemplo 1.- Obtención del anticuerpo monoclonal (mAb) MGD3

En una primera etapa, se generó una proteína soluble con Ia secuencia de aminoácidos 71-247 del receptor Dectin-1 humano, que comprende el cuello y el dominio de reconocimiento de carbohidratos (CTLD) de dicho receptor (SEQ ID NO2). Dicha proteína se obtuvo mediante inserción de Ia secuencia génica de ADN codificante para dicho péptido soluble (SEQ ID NO1 ) en vectores de expresión de mamífero (pEF), fusionados a los dominios HA y Flag, transitoriamente transfectados mediante Ia técnica de fosfato calcico en Ia línea celular humana HEK293T. La recolección de los sobrenadantes de cultivo de dichas células eucariotas y su posterior purificación mediante técnicas de inmunoafinidad y cromatográficas, permitió obtener cantidad suficiente como para realizar Ia inmunización de ratones de Ia cepa BALB/c, siguiendo protocolos estándar de inmunización.

Tras Ia fusión, Ia selección de hibridomas se realizó por ensayos de inmuno-absorción enzimática (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA). En este caso, los antígenos inmovilizados sobre Ia fase sólida utilizados han sido proteínas solubles de Dectin-1 humanas, purificadas y obtenidas tanto en mamíferos como en bacterias, así como diversos β- glucanos (ligandos del receptor Dectin-1 ). En estos ensayos se utilizaron los antígenos referidos como tapiz y como método de detección se añadió un anticuerpo anti-inmunoglobulinas de ratón acoplado a peroxidasa seguidos del sustrato de Ia reacción colorimétrica. De esta forma, se seleccionaron los hibridomas secretores de anticuerpos más específicos para el antígeno. Todos los hibridomas fueron testados y confirmados en paralelo por ensayos de citometría de flujo sobre transfectantes estables de Dectin-1 humano en Ia línea linfoblastoide K562 versus Ia línea parental. Del mismo modo se testó su capacidad de reconocer células humanas obtenidas a partir de sangre periférica (monocitos y derivados de ellos, células dendríticas, macrófagos y células de Langerhans). Como resultado de los tres tipos de análisis realizados se seleccionaron los mejores hibridomas entre los que destacó el hibridoma MGD3 (depositado en Ia colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal CeII Culture- el 6 de Febrero de 2008 con Ia referencia 08020601 ) que expresa establemente inmunoglobulinas del isotipo lgG2a, correspondientes al anticuerpo monoclonal (mAb) anti-Dectin-1 humano MGD3.

Ejemplo 2.- El anticuerpo monoclonal MGD3 de Ia invención reconoce Dectin-1 humano en Ia superficie de transfectantes estables de Dectin-1 humano.

Se utilizaron células de Ia línea celular linfoblástica humana K562 transfectadas establemente con un vector con el cDNA de Dectin-1a- humano acoplado al epítopo reportero FLAG (K562Dectin1aFlag) y células parentales, fueron teñidas con el mAb anti-Dectin-1 MGD3 y con control de isotipo (lgG2a) y analizadas por citometría de flujo. El patrón de tinción permitió comprobar que el mAb MGD3 reconoce específicamente Dectin-1 humano ya que tiñe específicamente las células transfectadas K562Dectin1aFlag y no las células parentales (Figura 1 ). Ejemplo 3.- El anticuerpo monoclonal MGD3 de Ia invención reconoce Dectin-1 humano en Ia superficie de transfectantes transitorios de Dectin-1 humano.

El resultado obtenido en el ejemplo 2 no descarta Ia posibilidad de que el hibridoma MGD3 pudiera estar secretando anticuerpos que reconozcan el epítopo FLAG. Para comprobar que el hibridoma MGD3 tan solo producía mAb anti-Dectin-1 se utilizó otras células humanas (HEK293T, derivadas de riñon embrionario) que se transfectaron transitoriamente con el cDNA completo de Dectin-1a humano sin FLAG o con el vector vacío (pcDNA 3.1 ) como control. A las 48 horas se realizó una citometría de flujo, tiñendo las células con el mAb anti- Dectin-1 MGD3 y con un control de isotipo. El patrón de tinción de membrana obtenido, tanto en los transfectantes estables de Dectin-1 con el epítopo Flag, como en los transfectantes transitorios que carecen de él, permitió comprobar que el mAb MGD3 de Ia invención reconoce específicamente Dectin-1 humano y no reconoce el epítopo Flag (Figura 2).

Ejemplo 4.- El anticuerpo monoclonal MGD3 reconoce específicamente Ia proteína ex vivo en Ia superficie de monocitos (MO), macrófagos (M0) y células dendríticas derivadas de monocitos de sangre periférica (MDDC).

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas a partir de concentrados de células sanguíneas exentos de plaquetas {buffy coats) de donantes sanos mediante gradientes de densidad obtenidos utilizando medios de separación de linfocitos (Figura 3). Los monocitos se obtuvieron mediante purificación con bolas magnéticas acopladas a CD14 (Miltenyi Biotech). Para Ia obtención de MDDCs y M0, se cultivan los monocitos durante 7 días en presencia de 1000 U/ml GM-CSF para los M0, y 1000 U/ml GM-CSF + 10 μg/ml IL-4 para las MDDCs. Debido a Ia gran variabilidad de las muestras procedentes de diferentes individuos, en Ia figura 3 se muestran los perfiles de citometría de un solo donante representativo. Los patrones de tinción muestran una expresión semejante de Dectin-1 en Ia membrana de los tres tipos celulares. En Ia parte inferior se muestra Ia expresión de marcadores moleculares característicos de cada tipo celular.

Ejemplo 5.- El mAb MGD3 de Ia invención es capaz de reconocer Dectin-1 humano en ensayos de Western Blot

Se realizó un Western Blot en condiciones no reductoras con usados totales de Ia línea celular humana establemente transfectada K562Dectin1aFlag y el correspondiente control con las células parentales. Para inhibir las N-glicosilaciones las células fueron tratadas con tunicamicina 3 μM durante 16 horas. Los usados (30 μg de proteína celular total/carril), fueron sometidos a electroforesis (SDS-PAGE) en condiciones no desnaturalizantes, transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Tras el bloqueo de Ia membrana (TBS-T ween 0,1 %, 5% leche desnatada en polvo y 2% BSA) se procedió a Ia hibridación de Ia misma durante Ia noche a 40C con el mAb anti-Dectin-1 humano MGD3 de Ia invención a 2 μg/ml. Tras los lavados correspondientes, Ia membrana se incubó con un Ab secundario de cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón acoplado a peroxidasa y se reveló con un sustrato quimioluminiscente. El mAb MGD3 de Ia invención reconoció dos bandas: una de 45 kDa aprox. correspondiente a Ia isoforma a del Dectin-1 humano presente en Ia muestra de células transfectadas K562Dectin1aFlag sin tratar y otra de 43 kDa aproximadamente que corresponde a esta misma isoforma tras el tratamiento con tunicamicina (Figura 4).

Ejemplo 6.- El mAb MGD3 es capaz de reconocer Dectin-1 humano en ensayos de inmunofluorescencia.

Se utilizaron células K562Dectin1 aFlag en suspensión, adheridas a cristales (10 x 103 céls/cubreobjeto) recubiertos de poli-L-lisina. Las células se fijaron con paraformaldehído 3,7% y tras los lavados y bloqueos pertinentes se tiñeron con el anticuerpo anti-Dectin-1 humano MGD3, seguido de un Ab de cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón conjugado a Alexa488. Del mismo modo, se usó un mAb de isotipo lgG2a como control. La figura 5A muestra las imágenes obtenidas mediante microscopía de fluorescencia para el control de isotipo y el mAb MGD3. Tan solo se detecta señal en verde en las células K562Dectin1aFlag teñidas con el mAb MGD3 Io que indica que el receptor Dectin-1a -FLAG está siendo reconocido específicamente.

Estos datos se confirmaron utilizando otra línea celular humana adherente (HeLa, epiteliales de ovario), transfectada transitoriamente con Dectin-1a-Flag. Las células fueron crecidas sobre cristales (50 x 103 células/cubreobjeto) y fijadas con paraformaldehído 3,7%. Tras los lavados y bloqueos pertinentes se tiñeron con el anticuerpo anti-Dectin-1 humano MGD3 o con el mAb anti-Flag que reconoce el epítopo FLAG como control positivo, seguidos de un Ab secundario cabra-anti-inmunoglobulinas de ratón acoplado a Alexa488. En Ia Figura 5B aparecen las imágenes obtenidas con el microscopio de fluorescencia donde se comprueba como el mAb MGD3 tiñe Dectin-1 con similar intensidad que el Ab anti-Flag el epítopo FLAG.

Ejemplo 7.- El mAb MGD3 es capaz de inhibir Ia unión de Candida albicans a Dectin-1 humano en ensayos de citometría de flujo de manera similar a Ia inhibición causada por el β-glucano soluble laminarina. Se estudió Ia capacidad de unión de Candida albicans (cepa CAF-2) a los transfectantes K562Dectin1aFlag. Para ello se utilizaron esporas de C. albicans marcadas con fluoresceína (FITC) incubadas en una relación célula/espora de 1/10 durante 30 min. Para determinar Ia capacidad del mAb MGD3 de bloquear esta unión, se preincubaron las células con laminarina (500 μg/ml), o con el mAb MGD3 de Ia invención (2 μg/ml) durante 20 min., antes de Ia incubación con las esporas. El análisis de Ia unión y bloqueo de Ia misma se realizó por citometría de flujo (Figura 6A). Los resultados indican que el anticuerpo MGD3 inhibe totalmente Ia unión especifica de C. albicans mediada por Dectin-1 puesto que Ia incubación con el anticuerpo disminuye Ia unión a niveles aún inferiores a los que presentan las células parentales. En este ensayo el anticuerpo MGD3 tiene Ia misma capacidad de inhibir Ia unión de esporas a Dectin-1 que el beta-glucano soluble laminarina (Figura 6B).

Ejemplo 8.- El mAb MGD3 es capaz de inhibir Ia producción de TNF-α e IL-10 en células dendríticas humanas derivadas de monocitos en respuesta a esporas de Candida albicans

Para estimular Ia producción de citoquinas, se incubaron las MDDC con esporas de C .albicans inactivadas por luz U. V. Para determinar Ia capacidad del mAb MGD3 de bloquear dicha secreción, se preincubaron las células con los mAb MGD3 de Ia invención (5 μg/ml) o con el control de isotipo (lgG2a, 5 μg/ml) durante 30 min., antes de Ia incubación con las esporas. Se recogió sobrenadante a las 6 y a las 18 horas. La cuantificación de las citoquinas presentes en el sobrenadante se realizó mediante ensayos de ELISA. Los resultados indican que el anticuerpo MGD3 inhibe significativamente tanto Ia producción de TNF-α Fig. 7 Acornó Ia de IL-1 OFig. 7B inducidas por las esporas de C. albicans en las MDDC. Esta inhibición es específica puesto que el control de isotipo (lgG2a) no produce una disminución significativa en Ia secreción de ninguna de las dos citoquinas analizadas. En cuánto a los controles positivos, el anticuerpo MGD3 no bloquea de forma significativa Ia secreción de TNF-q producida por zymosan seguramente debido a que este estímulo induce elevados niveles de secreción de TNF-α mediada por Ia existencia de otros receptores (ej. TLR2 y receptor de mañosa) que también reconocen esta partícula (constituida además de por β-glucanos, por chitina, mananos y lípidos). En el caso del LPS Ia disminución de Ia secreción tampoco es significativa, resultado esperado puesto que el receptor implicado es el TLR4, no Dectin-1. Ejemplo 9.- El mAb MGD3 es capaz, en ensayos de interacciones moleculares mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR), de capturar Dectin-1 humano recombinante presente en el medio condicionado por el crecimiento de células de mamífero transfectadas. Se estudió Ia capacidad de interacción entre el anticuerpo MGD3 de

Ia invención y proteínas solubles de Dectin-1. Para ello, se transfectaron transitoriamente células HEK293T bien con Ia porción extracelular (aminoácidos 71-247, dominio Dectin-1/71-247) del receptor humano Dectin- 1 o bien con esta misma porción extracelular fusionada a los epítopos HA y Flag (HA-Dectin-1a-Flag) (SEQ ID NO2). Los sobrenadantes recolectados se purificaron mediante técnicas de inmunoafinidad y cromatográficas.

Se utilizó un equipo biosensor Biacore 3000 (GE Healthcare) y un chip modelo CM5, al que se unió un anticuerpo de captura anti-inmunoglobulinas de ratón, de forma covalente, utilizando técnicas estandarizadas de entrecruzamiento de grupos amino. Se utilizaron en paralelo dos celdas de flujo, en una se inyectó sobrenadante que contenía un anticuerpo control inespecífico y en Ia otra el anticuerpo MGD3, a una concentración de 15 μg/ml y a una velocidad de 5 μl/min, en tampón HBS (150 mN NaCI, Hepes 10 mM, pH 7.4). En un nuevo ciclo, realizado a continuación, se inyectó el sobrenadante de células transfectadas con los plásmidos control "mock" (verde), Dectin-1 (azul) y Dectin-1-Flag+HA (roja).

En Ia Figura 8 se muestran las respuestas como señal relativa de resonancia (RU) en función del tiempo en segundos. Las curvas de Ia figura corresponden a Ia sustracción entre Ia señal obtenida para el anticuerpo MGD3 y Ia señal obtenida para el anticuerpo control negativo. La línea base corresponde a Ia señal de inyección del tampón HBS, seguida por Ia inyección de los medios condicionados realizada entre los 300 y 1200 segundos. En esta fase de asociación se observa Ia captura progresiva de las dos formas solubles de Dectin-1 por el anticuerpo. Una vez finalizada Ia inyección, el sistema continúa inyectando tampón y puede observarse Ia disociación de Dectin-1 y de HA-Dectin-1a-Flag del complejo formado con el anticuerpo MGD3.

Los resultados indican que el anticuerpo MGD3 de Ia invención captura de forma específica a las proteínas solubles Dectin-1 y HA-Dectin- 1a-Flag presentes en el medio de cultivo condicionado por el crecimiento de los transfectantes HEK293T. Estos resultados indican que este anticuerpo puede ser utilizado, en biosensores basados en Ia técnica SPR, como componente fundamental de ensayos de rastreo y caracterización de Ia interacción entre Dectin-1 y diferentes ligandos.

REIVINDICACIONES

1.- Anticuerpo anti-Dectin-1 humano caracterizado porque se une y reconoce específicamente el dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO2) ya sea un anticuerpo monoclonal o policlonal.

2.- Anticuerpo según las reivindicación 1 caracterizado porque es monoclonal y es producido por el hibridoma MGD3 (depositado en Ia colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal CeII Culture- el 6 de Febrero de 2008 con Ia referencia 08020601 ).

3.- Secuencia de nucleótidos caracterizada por ser codificante del dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO1 ) y por ser seleccionada del siguiente grupo: d) una secuencia de nucleótidos análoga a Ia SEQ ID NO1 , e) un fragmento de Ia secuencias de a, y f) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) y b).

4.- Secuencia de aminoácidos aislada de Ia proteína humana Dectin-1 caracterizada porque se corresponde con el dominio 71-247 de ésta (SEQ ID NO2) y por ser seleccionada del siguiente grupo: d) una secuencia de aminoácidos análoga a Ia SEQ ID NO2 e) un fragmento de Ia secuencia de a, y f) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a) y b).

5.- Uso de Ia secuencia de nucleótidos según Ia reivindicación 3 en Ia producción de anticuerpos anti-Dectin-1 humanos, ya sean monoclonales o policlonales.

6.- Uso de Ia secuencia de aminoácidos según Ia reivindicación 5 en Ia producción de anticuerpos anti-Dectin-1 humanos, ya sean monoclonales

0 policlonales.

7.- Hibridoma caracterizado porque produce un anticuerpo específico del dominio 71-247 de Ia proteína humana Dectin-1 (SEQ ID NO2).

8.- Hibridoma según Ia reivindicación 7 caracterizado porque es el hibridoma MGD3 productor del anticuerpo MGD3 (depositado en Ia colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal CeII Culture- el 6 de Febrero de 2008 con Ia referencia 08020601 ).

9.- Uso de hibridoma según las reivindicaciones 7 y 8 para Ia producción del anticuerpo monoclonal anti-Dectin-1 humano, preferentemente el anticuerpo monoclonal .MGD3.

10.- Uso del anticuerpo según reivindicaciones 1 y 2 para Ia elaboración de una composición biotecnológica, farmacéutica diagnóstica o terapéutica útil para Ia realización de: - ensayos de detección, identificación y/o cuantificación de Ia proteína Dectin-1 humana,

- tratamiento de enfermedades infecciosas, autoinmunes y/o inflamatorias, y

- diagnóstico de enfermedades infecciosas, autoinmunes y/o inflamatorias.

11.- Composición biotecnológica, farmacéutica diagnostica o terapéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo según las reivindicaciones

1 y 2.

12.- Uso de Ia composición según Ia reivindicación 11 y del anticuerpo según Ia reivindicación 1 y 2 en un procedimiento ex vivo de detección, identificación y/o cuantificación de Ia proteína Dectin-1 humana.

13.- Uso de Ia composición según Ia reivindicación 11 y del anticuerpo según Ia reivindicación 1 y 2 en un procedimiento terapéutico de una enfermedad humana donde Ia proteína Dectin-1 humana presenta un papel etiopatogénico.

14.- Uso según Ia reivindicación 13 caracterizado porque Ia enfermedad es una enfermedad inflamatoria, infecciosa y/o autoinmune.

15.- Uso de Ia composición según Ia reivindicación 11 y del anticuerpo según Ia reivindicación 1 y 2 en un procedimiento ex vivo para el diagnóstico de una enfermedad autoinmune, infecciosa y/o inflamatoria.

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