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Specifically disclosed is a polynucleotide encoding any one of the following polypeptides (1) to (3): (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence depicted in SEQ ID NO:2; (2) a polypeptide which comprises an amino acid sequence having the deletion, substitution or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence depicted in SEQ ID NO:2, and which has a polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase activity; and (3) a polypeptide which has a 90% or more homology (identity) on total average with the amino acid sequence depicted in SEQ ID NO:2, and which has a polyketide synthase-nonribosomal peptide synthetase activity.","lang":"en","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}],"fr":[{"text":"La présente invention concerne un procédé permettant la détection de la capacité génétique de production d'acide cyclopiazonique d'une souche appartenant au genre Aspergillus ou analogue de manière rapide et très précise; un transformant (souche) incapable de produire de l'acide cyclopiazonique ou du cycloacétoacétyl L-tryptophane (CAT) qui est un précurseur de l'acide cyclopiazonique; et autres. La présente invention concerne en particulier un polynucléotide codant l'un quelconque des polypeptides suivants (1) à (3) : (1) un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés décrite dans SEQ ID NO:2; (2) un polypeptide qui comprend une séquence d'acides aminés présentant la délétion, la substitution ou l'addition d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés dans la séquence d'acides aminés décrite dans SEQ ID NO:2, et qui possède une activité de synthétase de peptide non ribosomal de type polycétide synthase; et (3) un polypeptide qui possède une homologie (identité) de 90 % ou plus sur la moyenne totale avec la séquence d'acides aminés décrite dans SEQ ID NO:2, et qui possède une activité de synthétase de peptide non ribosomal de type polycétide synthase.","lang":"fr","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}],"ja":[{"text":"遺伝的な迅速かつ高精度にアスペルギルス属等に属する菌株におけるシクロピアゾン酸生産能の検出方法、及び、シクロピアゾン酸及びその前駆体であるサイクロアセトアセチルL-トリプトファン(CAT)を生産しない形質転換体(株)等の提供を目的とする。 以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド: (1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、 (2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、 (3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。","lang":"ja","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}]},"abstract_lang":["en","fr","ja"],"has_abstract":true,"claim":{"ja":[{"text":"以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド: (1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、 (2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、 (3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド: (1)配列番号1で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、 (2)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"アスペルギルス・オリゼのゲノムに含まれるゲノムDNAである、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"cDNAである、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"以下のポリペプチドから成るポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ: (1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、 (2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、 (3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"シクロピアゾン酸非生産形質転換体がサイクロアセトアセチルL-トリプトファン非生産菌である、請求項6記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"シクロピアゾン酸非生産形質転換体がポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼを発現しない菌である、請求項6又は7記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"遺伝子操作が請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドを破壊するものである、請求項6~8のいずれか一項に記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"遺伝子操作を非相同組換えに関わるKu遺伝子が破壊された菌株に対して行う、請求項9記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"微生物がアスペルギルス・オリゼ株である、請求項6~10のいずれか一項に記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌であるアスペルギルス・オリゼ株を使用する、請求項11記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Aspergillus oryzae A4177K株である、請求項12記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"請求項6~13のいずれか一項記載の製造方法により得られた、シクロピアゾン酸非生産形質転換体。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"アスペルギルス・オリゼ株である、請求項14記載のシクロピアゾン酸非生産形質転換体。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別することを特徴とする、シクロピアゾン酸生産能の判別方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’側領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸非生産菌を識別することを特徴とする、シクロピアゾン酸非生産株の識別方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"アスペルギルス菌株がアスペルギルス・オリゼである、請求項16又は17記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域が配列番号1で示される塩基配列における4,217番目~11721番目である、請求項16~18のいずれか一項に記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとその3’下流領域にあるテロメア配列との間に含まれるポリヌクレオチド領域が配列番号3で示される塩基配列を有する、請求項16記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をポリメラーゼ連鎖反応によって検出する、請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をサザン解析によって検出する、請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}]},"claim_lang":["ja"],"has_claim":true,"description":{"ja":{"text":"本発明は、新規なポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子、遺伝子組み換えによるシクロピアゾン酸非生産菌形質転換体の作製方法、及び、該遺伝子3’領域及びその3’下流領域に含まれる塩基配列の存在を検出することによるアスペルギルス菌又はペニシリウム菌のシクロピアゾン酸生産能の検出方法等に関する。 アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)及びアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)等の麹菌(アスペルギルス)は、醤油、酒、味噌などの伝統的な食品の醸造や酵素の生産等のために工業的に広く用いられている、また近年の麹菌(アスペルギルス・オリゼ)の全ゲノム配列の決定やマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析などの進展に伴い、遺伝子工学的な改変、特に染色体レベルの改変により酵素等の生産性や増殖速度の改良などの効果が期待される糸状菌である。 このように、アスペルギルスは食品製造や酵素の製造などの、タンパク質生産の宿主微生物として利用されている他に、その二次代謝物質は、医薬品やその前駆体として利用されている。しかし、このような二次代謝産物質には、マイコトキシンとして知られるカビ毒が含まれる。 このようなマイコトキシンの一種であるシクロピアゾン酸は、ペニシリウム・シクロピウムにおいて初めに見つかった、ATP依存性のカルシウムトランスポーターを阻害する神経毒である。その毒性はLD50=36mg/kg(ラット経口投与)であることが知られており、1960年にイギリスにおいて七面鳥10万匹以上が飼料中のカビ毒で死んだ、七面鳥X病事件の原因毒素の一つであると考えられている。シクロピアゾン酸を生産するカビとしては、上記ペニシリウム・シクロピウムの他にペニシリウム・カマンベルティ、アスペルギルス・フラバス、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・タマリ等の菌において、一部の株が知られている。 醤油、味噌、日本酒などの製造に用いられるアスペルギルス・オリゼや、チーズの製造に用いられるペニシリウム・カマンベルティなどにおいて、それらの一部の株がシクロピアゾン酸を生産することが知られている。そのため、醸造食品の安全性を確保するために、シクロピアゾン酸生産菌を判別し排除する必要がある。一方、これらの伝統的な醸造・発酵食品は様々な規模で生産されているのが現状であり、技術力や設備の異なる製造業者が、それぞれの判断で使用する菌株を選んでいる実情がある。そのため、できるだけ簡便かつ正確なシクロピアゾン酸生産菌の判別方法が望まれている。 従来知られた、最も簡単な判別方法としては、シクロピアゾン酸が存在するとコロニーが赤くなる寒天培地で被検株を培養することで判別する方法であるが(特許文献1)、この方法では、寒天培地という培養条件での生産性を判断するため、実際の醸造過程でシクロピアゾン酸が生産されるかは不明である。一方、より正確な方法として、ペニシリウム属とクラビセプス属においては、シクロピアゾン酸生合成を触媒する酵素の一つである、4-ジメチルアリルトリプトファンシンターゼの遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応(以下、「PCR」とも標記する)を用いて検出することで、シクロピアゾン酸生産菌を判別する方法として有効であることを報告している(非特許文献1)。しかし、アスペルギルス属に関しては、非生産菌の中にもこの遺伝子の相同遺伝子である、ジメチルアリル‐シクロアセトアセチル‐L‐トリプトファンシンターゼを保持している株が存在することが我々の研究から明らかとなったため、同様の方法はアスペルギルス属においては必ずしも利用できない。 また、シクロピアゾン酸のようなマイコトキシンが生産されない物質生産宿主を得るために、突然変異や遺伝子操作技術による遺伝子の破壊などによる、マイコトキシンの非生産株の造成方法が報告されている(特許文献2,3)。しかしながら、これらの方法における作製された株の評価では、最終産物である分子にのみ注目しているため、その前駆体が合成されているような株であっても、マイコトキシン非生産株として認識してしまう場合がある。しかし、たとえばマイコトキシンの一種であるアフラトキシンの前駆体であるステリグマトシスチンはアフラトキシンよりは弱いものの、強い毒性物質である。従って、物質生産や食品製造に用いられるカビとしては、最終産物であるマイコトキシンのみならず、その前駆体、望ましくは合成における、より初期の段階を不活性化した、マイコトキシン生産性を失った株を使用することで、より安全性を高めることが期待される。 従来、麹菌は相同組換え頻度が低く、従来の方法では染色体の任意の領域に対する大領域欠失株を作製することは極めて困難であった。例えば一つのベクターを染色体上の任意の領域に組込む場合においても相同組換えの頻度が1~2%と低いために形質転換体を数十から百株程度取得し、その中から目的の株を取得する必要があった。本発明者らは最近の研究により、非相同組換えに関与する遺伝子を破壊することで遺伝子ターゲッティング頻度(相同組換え頻度)が非常に向上することを明らかにした(特許文献4)。 本発明の主な目的は、アスペルギルス菌又はペニシリウム菌において遺伝的にシクロピアゾン酸生産能をもつ株の迅速かつ高精度な検出方法を提供することにある。また本発明は、シクロピアゾン酸生産菌の正確かつ容易な検出を可能にする、PCR用プライマーを提供することである。本発明の主な目的は更に、アスペルギルス菌又はペニシリウム菌において、シクロピアゾン酸生合成経路の初発反応過程を触媒する酵素の遺伝子を破壊した形質転換菌を作製することで、シクロピアゾン酸及びその前駆体であるサイクロアセトアセチル‐L‐トリプトファン(CAT)を生産しない形質転換体(株)を提供することにある。 本発明者は上記課題を解決すべく研究を行った結果、シクロピアゾン酸生合成経路の初発段階を触媒する酵素である、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子を同定し、シクロピアゾン酸生産株とシクロピアゾン酸非生産株との間で、該遺伝子及びその3’下流領域の塩基配列を比較検討することによって、シクロピアゾン酸生合成における該遺伝子の役割を明らかにして本発明を完成した。 即ち、本発明は、以下の各態様に関するものである。 [態様1]以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド: (1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、 (2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、 (3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。 [態様2]以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド: (1)配列番号1で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、 (2)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 [態様3]アスペルギルス・オリゼのゲノムに含まれるゲノムDNAである、態様1又は2記載のポリヌクレオチド。 [態様4]cDNAである、態様1又は2記載のポリヌクレオチド。 [態様5]以下のポリペプチドから成るポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ: (1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、 (2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、 (3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。 [態様6]遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法。 [態様7]シクロピアゾン酸非生産形質転換体がサイクロアセトアセチルL-トリプトファン非生産菌である、態様6記載の方法。 [態様8]シクロピアゾン酸非生産形質転換体がポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼを発現しない菌である、態様6又は7記載の方法。 [態様9]遺伝子操作が態様1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドを破壊するものである、態様6~8のいずれか一項に記載の方法。 [態様10]遺伝子操作を非相同組換えに関わるKu遺伝子が破壊された菌株に対して行う、態様9記載の方法。 [態様11]微生物がアスペルギルス・オリゼ株である、態様6~10のいずれか一項に記載の方法。 [態様12]相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌であるアスペルギルス・オリゼ株を使用する、態様11記載の方法。 [態様13]相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Aspergillus oryzae A4177K株である、態様12記載の方法。 [態様14]態様6~13のいずれか一項記載の製造方法により得られた、シクロピアゾン酸非生産形質転換体。 [態様15]アスペルギルス・オリゼ株である、態様14記載のシクロピアゾン酸非生産形質転換体。 [態様16]態様1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別することを特徴とする、シクロピアゾン酸生産能の判別方法。 [態様17]態様1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’側領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸非生産菌を識別することを特徴とする、シクロピアゾン酸非生産株の識別方法。 [態様18]アスペルギルス菌株がアスペルギルス・オリゼである、態様16又は17記載の方法。 [態様19]ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域が配列番号1で示される塩基配列における4,217番目~11721番目である、態様16~18のいずれか一項に記載の方法。 [態様20]ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとその3’下流領域にあるテロメア配列との間に含まれるポリヌクレオチド領域が配列番号3で示される塩基配列を有する、態様16記載の方法。 [態様21]ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をPCRによって検出する、態様16~20のいずれか一項に記載の方法。 [態様22]ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をサザン解析によって検出する、態様16~20のいずれか一項に記載の方法。 本発明によって、アスペルギルス菌において、シクロピアゾン酸生合成経路の初発段階を触媒する酵素である、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ(PKS-NRPS)遺伝子が初めて同定された。更にシクロピアゾン酸非生産菌においては、該PKS-NRPS遺伝子の4,217番目の塩基以降の3’末端側は欠失しており、また終止コドンも含まれておらず、該塩基の3’側にテロメアリピート配列が付加していることが判明した。 その結果、判定対象となる菌株において、本発明のPKS-NRPSをコードするポリヌクレオチドの3’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別し、シクロピアゾン酸非生産菌を識別することが可能となる。 アスペルギルス菌株のサザン解析による配列の比較を示す電気泳動の写真を含む。 NBRC4177株のゲノムDNA(第3染色体末端)のPCRによる解析結果を示す電気泳動の写真を含む。 アスペルギルス菌株のサザン解析による、制限酵素断片(約2kb)の存在の有無を示す電気泳動の写真を含む。 アスペルギルス菌株の第3染色体上のシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子とその位置関係を示す。 PCR法によりシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子破壊の結果を示す電気泳動の写真を含む。「Wt」は野生株、並びに、「TF1」及び「TF2」は各遺伝子破壊株の具体例を示す。 推定されているシクロピアゾン酸合成経路の中間体を示す。 各遺伝子破壊株におけるシクロピアゾン酸合成経路の中間体の蓄積量の相対値を示したグラフである。 Primer set 1によるDNA断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 Primer set 2,3によるDNA断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 Primer set 4,5,6によるDNA断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 Primer set 7によるDNA断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 Primer set 1~7により増幅されるDNA断片(塩基配列)の推定領域を示す。 Primer set P-1,2,3,4によるDNA断片の増幅の結果を示す電気泳動の写真を含む。 本明細書の実施例に記載されているように、本発明者は、アスペルギルス・オリゼのシクロピアゾン酸生産株においては、第3染色体のシクロピアゾン酸生合成に関与するDACT-S遺伝子とテロメア配列の間にシクロピアゾン酸生産に関与する新規な遺伝子(ポリヌクレオチド)があることを初めて発見し、アスペルギルス・フラバスの配列を参考にして設計したPCRプライマーにより増幅される配列の塩基配列の解読と、抽出したRNAを逆転写することで作製したcDNAを鋳型とした3’-RACEの増幅産物の塩基配列を解読することにより、その塩基配列を決定した。更に、該塩基配列に基づき、該遺伝子がポリケタイドシンターゼ(PKS)及びノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ(NRPS)の触媒活性ドメインを有するポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ(PKS-NRPS)であることを明らかした。一方、シクロピアゾン酸非生産株においては、PKS-NRPSをコードするポリヌクレオチドの3’側領域が途中からテロメアリピート配列が付加することにより、60%以上も欠けていることを見出した。 [ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ遺伝子及び蛋白質] 従って、本発明により見出された新規なポリヌクレオチドは、以下のポリペプチドをコードするものである。 (1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、 (2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、 (3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。 尚、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルシンテターゼは一般的に複数のドメインを含む多機能タンパク質であることが知られており、発明者らが見出した配列番号2に示されたアミノ酸配列からなるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼは、本明細書の表1で示されるような複数の機能ドメインを含むと予想され、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するためには機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。従って、上記(2)で示されるポリペプチドの具体例としては、配列番号2で示されるアミノ酸のうち、このようなドメインを構成するアミノ酸以外の領域のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていることが好ましい。更に、このような欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸としては、同族アミノ酸(極性β非極性アミノ酸、疎水性β親水性アミノ酸、陽性β陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など)同士の置換が好ましい。 更に、該ポリヌクレオチドの好適例として、以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。 (1)配列番号1で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、 (2)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。 ここで、ハイブリダイゼーションは、Molecular cloning third.ed.(Cold Spring Harbor Lab. Press,2001)に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987))に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 本明細書において、ポリヌクレオチド間のハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。従って、「ストリンジェントな条件下」とは、具体的には、例えば、温度60℃~68℃において、ナトリウム濃度150~900mM、好ましくは600~900mM、pH6~8であるような条件を挙げることが出来る。 このような配列番号1に示されたコード領域を含むポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドとしては、例えば、該DNAの全塩基配列との相同性の程度が、全体の平均で、90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上である塩基配列を含有するポリヌクレオチド等を挙げることができる。 本発明のポリヌクレオチドは、シクロピアゾン酸を生産するアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する菌株を出発原料として用いて、本明細書に記載されて配列情報等に基づき作製可能な適当なプローブ又はプライマーPCRを用いて、コロニーハイブリダイズにより取得したり、プライマーPCRにより増幅して調製することも出来る。当業者に公知の任意の方法で容易に調製することができる。アスペルギルス属に属する菌の例としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・フラバス、及びアスペルギルス・タマリ等を挙げることができる。また、ペニシリウム属に属する菌の例としてペニシリウム・カマンベルティ等を挙げることが出来る。 尚、PCRは、例えば、サーマルサイクラーとしてPerkin Elmer社製9600など一般のサーマルサイクラー、及び、耐熱性DNAポリメラーゼとしては、ExTaq DNA Polymerase(宝酒造製)などの一般の市販品を用いて当業者に公知の適当な反応条件を適宜選択して実施することができる。 従って、このような菌株から調製されたポリヌクレオチドは、ゲノムDNA又はそのmRNAからの逆転写によって調製されたcDNAである。更に、当業者に周知の化学合成によって、本発明の各遺伝子を調製することも出来る。 本発明の蛋白質としては、以下のポリペプチドを挙げることができる。 (1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、 (2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、 (3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上、好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。 配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体であるこのような蛋白質は、当業者に公知の任意の方法、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びPCR法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。 尚、塩基配列間及びアミノ酸配列間の同一性は、例えば、Karlin及びAltschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268,1990及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877,1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムやFASTAプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。 [シクロピアゾン酸非生産形質転換体の作製] 本明細書中で示されるように、更に、該遺伝子破壊株(ノックアウト株)を相同組換えによって作製したところ、シクロピアゾン酸生合成経路における初発段階で生成される中間物質であるサイクロアセトアセチルL-トリプトファン(CAT)が合成されなくなり、その結果、シクロピアゾン酸も生産されなくなることを確認した。 従って、本発明は、遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法にも係る。このような形質転換体の好適具体例として、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ(PKS-NRPS)を発現・生産しない菌を挙げることが出来る。 このようなPKS-NRPSを生産しない形質転換体は、当業者に公知の任意の遺伝子操作の手段で作製することができる。 例えば、当業者に公知の相同組換え等を用いてPKS-NRPSをコードする遺伝子(ポリヌクレオチド)を破壊することによりPKS-NRPSを発現させなくすることが可能である。しかしながら、既に記載したように、アスペルギルス菌は相同組換え頻度が低い。従って、このような方法で本発明の形質転換体を作製する場合には、非相同組換えに関与するKu70及び Ku80等のKu遺伝子が抑制された形質転換菌を使用することが好ましい。このようなKu遺伝子の抑制は当業者に公知の任意の方法で実施することが出来る。例えば、本発明者等により開発された方法(特許文献4)によりKu遺伝子破壊ベクターを使用してKu遺伝子を破壊したり、又は、Ku遺伝子のアンチセンス発現ベクターを利用するアンチセンスRNA法によって、Ku遺伝子を不活化することが可能である。こうして得られる形質転換菌は、このようなKu遺伝子の抑制に関する遺伝子操作が施される前の元の菌と比較して、相同組み換え頻度が顕著に上昇している。具体的には、少なくとも10倍、好ましくは、少なくとも約60倍上昇している。 このような相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌の例として、特許文献4に記載されているAspergillus sojae ASKUPTR8株(wh, ΔpyrG, ku70::ptrA)、及び、Aspergillus oryzae RkuN16ptr1株を上げることが出来る。尚、Aspergillus sojae ASKUPTR8株は、日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6に所在の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成16年12月2日付で寄託され、受領番号FERM P-20311が付されている。その後、平成17年11月17日付で特許手続上の微生物の寄託等の国際的承認に関するブタペスト条約に基く国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-10453が付与されている。 更に、本明細書の実施例で使用している、Ku70遺伝子破壊株であるAspergillus oryzae A4177K株を挙げることが出来る。この株は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2丁目5番地8に所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに平成19年10月16日付で寄託され、受領番号NITE AP-434が付されている。 [シクロピアゾン酸生産能の判別方法] 本明細書中で具体的に示されるように、アスペルギルス・オリゼ等のシクロピアゾン酸非生産菌においては、配列番号1で示される、シクロピアゾン酸生合成の初発段階を触媒する酵素、ポリケチドシンテターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ(PKS-NRPS)をコードする遺伝子の4,217番目の塩基以降の配列は欠失しており、また終止コドンも含まれていない。その代わりに、該塩基の3’側にテロメアリピート配列が付加している。PKS-NRPSには重要な活性ドメインが複数存在し、欠失した4,217番目の塩基以降の領域にも、活性に必要なドメインが含まれているため、このような3’末端側を欠失した遺伝子の発現産物はPKS-NRPSとしての機能できないものと推定される。 一方で、シクロピアゾン酸生産菌における解析結果から、この遺伝子の終止コドンからテロメアまでの領域は17~18kbであるが、シクロピアゾン酸非生産菌ではこの領域も失われている。又、PKS-NRPS遺伝子が破壊されることによって、シクロピアゾン酸生合成経路における初発段階で生成される中間物質であるサイクロアセトアセチルL-トリプトファン(CAT)が合成されなくなり、その結果、シクロピアゾン酸も生産されなくなる。 尚、ペニシリウム・カマンベルティ等のペニシリウム属に属する菌についても、シクロピアゾン酸生産に関して、アスペルギルス・オリゼと類似の遺伝子群(クラスター)を有しているものと考えられる。 以上のことから、このようなクロピアゾン酸生産菌にのみ特異的に存在する配列、即ち、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無はシクロピアゾン酸生産菌と非生産菌を判別するための指標(標的配列)として有用である。 従って、判定対象となる菌株において、本発明のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能の判別をすることができる。 特に、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’側領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列が検出されない場合には、該菌株においてはポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドが発現されないので、このような菌株をシクロピアゾン酸非生産菌として識別することが可能となる。 判定対象となる菌株は、アスペルギルス・オリゼ及びアスペルギルス・フラバス等の任意のアスペルギルス菌株、並びに、ペニシリウム・カマンベルティ等のペニシリウム属を挙げることができる。 ここで、「ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域」の一具体例として、配列番号1で示される塩基配列における4,217番目~11,721番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド領域を挙げることが出来る。又、「ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域」の一例として、配列番号3で示される塩基配列のような、シクロピアゾン酸生産菌のPKS-NRPS遺伝子の3’下流領域にあるテロメアに隣接した配列をあげることができる。 上記の領域に含まれており当業者に公知の方法で検出可能である限り、検出の対象となる部分塩基配列の場所及び長さに特に制限はなく、その測定方法等に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、PCRによるDNA増幅によって部分塩基配列を検出するような場合には、通常、該部分塩基配列は100~10,000の塩基対を有するものである。 本発明方法において、部分塩基配列は当業者に公知の任意の測定方法で検出することができる。例えば、該塩基配列に基づき適宜設計したプライマー又はプローブを使用したRT-PCR法及びリアルタイムPCR法等の各種PCR法等、サザンブロット(解析)法、in situ ハイブリダイゼーション法、並びにマイクロアレイ法(DNAチップ)法等の当業者に公知の方法で行うことが出来る。 検出対象である上記塩基配列をターゲットとした、増幅用プライマー及びハイブリダイゼーション用のプローブは、本明細書に記載された各配列の塩基情報又は公的データベースから入手可能な塩基配列情報等に基づき当業者が適宜設計できる。これらは、その用途に応じて、適当な長さ、例えば、増幅用プライマーであれば、通常、10~100個、好ましくは20~40個程度の連続した塩基配列から成る。又、ハイブリダイゼーション用のプローブであれば、通常、200~3,000個、好ましくは500~1,000個程度の連続した塩基配列から成る。 従って、本発明のアスペルギルス菌株におけるシクロピアゾン酸生産能の判別方法において、シクロピアゾン酸生産菌と非生産菌を判別するための指標(標的配列)として有用な部分塩基配列の代表例として、本明細書の実施例に記載されているプライマーセット1~7、及びプライマーセットP-1~P-3を用いたPCRにより増幅される塩基配列を挙げることができる。尚、図12に示されるように、プライマーセット1~7により増幅される部分塩基配列は、全体又はその一部が配列番号1で示されるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における4,217番目からテロメアまでの領域に含まれ、又、プライマーセットP-1~P-3により増幅される部分塩基配列は、図13に示されるように、配列番号1で示されるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における4,217番目~11,721番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド領域に含まれる。 本発明の方法は、上記のプライマー又はプローブを含む、適当な測定キットを用いて行うことができる。このようなプライマー又はプローブは当業者に公知の任意の放射性物質、蛍光物質、色素等の適当な標識物質によって標識されていても良い。このような測定キットは利用する測定原理等に応じて、適当な構成をとることが出来、更に、その構成・使用目的などに応じて、当業者に公知の他の要素又は成分、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液、反応プレート(容器)等が含まれる。 以下、実施例に則して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、以下の実施例における各遺伝子操作の手段・条件等は、特に断わりがない限り、例えば、特開平8-80196号公報、又はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施することが出来る。又、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。 [被検株のシクロピアゾン酸生産性の解析] アスペルギルス・オリゼの標準株として、ゲノム情報が解読されたRIB40株がシクロピアゾン酸生産性株であるかを調べるために、既知のシクロピアゾン酸生産株であるアスペルギルス・オリゼNBRC4177株をポジティブコントロールとして、CYA寒天培地(3 .0g NaNO 3 , 1.0g K 2 HPO 4 , 0.5g KCl, 0.5g MgSO 4 ・7H 2 O, 0.01g FeSO 4 ・7H 2 O, 5.0g Yeast Extract, 30.0g Sucrose, 15.0g Agar, 1000ml Distilled water)にて一週間培養時に蓄積するシクロピアゾン酸量を調べた。検出は、LC/MS(液体クロマトグラフィー/質量分析装置)(アジレント社製1100シリーズ高速液体クロマトグラフィー、及びアプライドバイオシステム社製QSTAR Elite質量分析装置)を用いて行った。抽出は培地と菌体を直径6mmのスポットとして3サンプル回収し、1%のギ酸を含む酢酸エチル、ジクロロメタン、メタノールを3:2:1で混合した溶液800μlで抽出した。12,000rpm 5分間の遠心操作を2回行うことにより固形物を除き、サンプルとした。分離カラムはODSカラム(財団法人 化学物質評価研究機構 L-column 粒子径 5μm、内径 2.1mm、長さ100mm)を用い、溶離液は、0.1vol% 蟻酸水をA液、0.1vol% 蟻酸-アセトニトリルをB液とし、0分から5分までをA液95%、B液5%で流し、25分までにA液5%、B液95%に達するように濃度勾配をかけ、その後35分から36分でA液95%、B液5%とする方法でサンプル10μlを分離した。流速は毎分0.2mlで行った。質量分析は、Electrospray ionization(ESI)をイオン化法として用い、イオンスプレー電圧は5500 V、ヒーターガス温度は450℃、ネブライザーガス(GS1)は50psi、ターボガス(GS2)は50psi、カーテンガス(Nitrogen)は30psiとし、正イオン検出モードより検出した。 その結果、シクロピアゾン酸生産菌であるNBRC4177株において強いピークとして検出されたm/z=337.1のピークは、RIB40株では検出されなかった。従って、RIB40株はシクロピアゾン酸非生産株であることが分かった。 [ゲノムDNAの調製] アスペルギルス・オリゼRIB40株、NBRC4177株及びNISL3010株を24時間CYA液体培養し、ろ過により回収した菌体を液体窒素により凍結後、乳鉢と乳棒を用いて破砕した。破砕した菌体より、2%SDS、0.1M NaCl、10mM EDTAを含む50mMトリス‐HCl緩衝液を用いて、ゲノムDNAを抽出し、リボヌクレアーゼAによりRNAを分解した後、フェノール・クロロホルム処理により精製した。 [サザン解析] 麹菌ゲノム情報(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/MicroTop?GENOME_ID=ao)は、アスペルギルス・オリゼRIB40株についてのゲノム解読情報であり、この情報を参考に、DCAT-S遺伝子の上流側の塩基配列を調べ、プローブ領域として、フォワードプライマー、5’-AGG GCT TGG TTA TGA AAA GTG TCC C-3’(配列番号4)とリバースプライマー 5’-CGC CTG ACG ATA CTG CAA ATG TC-3’(配列番号5)にはさまれた領域を選んだ。また、ゲノムDNAを切断する酵素として、プライマー領域よりもセントロメア側に切断配列が存在するBamHI,BglII(タカラ社製)を選択し、ゲノムの切断を行った。サザン解析はジゴキシゲニン(ロシュ社)を用いた方法を用い、製造者により推奨される方法に従い、行った。その結果、BamHI,BglIIで切断したゲノムでの解析では、RIB40株ではテロメアが存在するために、3.3kbと2.7kbのバンドしか得られないが、NBRC4177株とNISL3010株においては、約15kbと5kbのバンドが得られた(図1)。従って、これら2株はRIB40よりも、下流の領域でテロメアが付加していると考えられた。そこで、アスペルギルス・オリゼの近縁種として知られる、アスペルギルス・フラバスのゲノム情報を参考に、この下流の領域を標的配列とするPCRプライマーとして、フォワードプライマー12539:5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号6)に対して、リバースプライマー13452:5'-GCACAAACCGTGAAATGATCCTTTTCACTG-3'(配列番号7)、リバースプライマー14433:5'-CTCCACGAGTGCGGGGAGTGGGCCAATAG-3'(配列番号8)、リバースプライマー15463:5'-GGCCGCACGTGACTTCAGTCATGTGATC-3'(配列番号9)、リバースプライマー16612:5'-CGGATTGTCCCACGCTCATAGTGTTTTGC-3'(配列番号10)、リバースプライマー17850:5'-GTCGACCGTTTCCTGTCTTTACCACAC-3'(配列番号11)、を用いて、NBRC4177株のゲノムDNAを鋳型にPCRを行ったところ、リバースプライマー17850以外において、DNAの増幅が観察された(図2)。また、RIB40株、NISL3010株、NBRC4177株のゲノムDNAをSalIとBglIIにより切断し、プローブとしてフォワードプライマー, 5'-CGGGTCTGCAGGCACGCATAAAGACTG-3'(配列番号12)と、リバースプライマー, 5'-ATCGCATGTGCTGTATGGATCCGACTATCC-3'(配列番号13)で増幅される領域の断片を用いたサザン解析を行ったところ、両方の制限酵素において、約2 kbの断片がNISL3010株とNBRC4177株においてのみ検出された(図3)。そこで、この結果を参考に、テロメア付加部位を予想し、インバースPCRによるテロメア付加領域をクローニングすることを試みた。その結果、NBRC4177株においてはRIB40株よりも、約17~18kb 下流において、テロメアが付加していることが明らかとなった。テロメア付加部位周辺の塩基配列は配列番号2に示したとおりである。 また、ノーザン解析から、RIB40株においてテロメアが付加しているPKS遺伝子は、NBRC4177株においては発現しており、その転写産物は約10kbであることが示唆された。そこで、これまでに得られた結果からコーディング領域を11.7kbと推定し、3’-RACE解析を行った。逆転写はGeneracer kit (インビトロジェン)を用い、cDNAを鋳型としたPCRには、プライマー 5’-CAGATCAAGGTCGGGATTTCAGC-3’(配列番号14)と、キット附属のプライマーを用いた。得られた産物をTA-クローニングキット(インビトロジェン)によりクローニングし塩基配列を解読した。この配列をもとに、さらにPCRプライマーを合成し、塩基配列の決定を行うことを繰り返し、配列番号1に示される全長の塩基配列を解読した。この遺伝子の塩基配列から推定されるアミノ酸配列をPfam プログラム(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)で解析したところ、PKSとNRPSの触媒ドメインを持つ、PKS-NRPSハイブリッド型酵素をコードすることが明らかとなった。尚、Pfam プログラムによる上記アミノ酸配列の解析により明らかとなった各ドメイン及びその位置(開始・終止アミノ酸及び塩基の番号)を以下の表1に示す。 [アスペルギルス株のシクロピアゾン酸非生産形質転換体の作製] 第3染色体上のシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる遺伝子として、DCAT-S遺伝子(cpaB:AO090026000002)の周辺に位置する他の遺伝子であるcpaC(AO090026000003)及びcpaD(AO090026000004)が予想される(図4)。従って、本発明で同定されたPKS-NRPS遺伝子(cpaA:AO090026000001)、及びそれら遺伝子の系統的な破壊を行った。 各遺伝子破壊に先立ち、シクロピアゾン酸生産株における、遺伝子破壊効率を上げるために、上記特許文献4に記載の方法と発明者らの以前の報告(Takahashi et al., Mol. Gen. Genet. (2006) 275: 461-470)に準じて、アスペルギルス・オリゼ NBRC4177株における非相同組換えに関わるタンパク質Ku70の遺伝子を破壊した株、A4177K株を作製し、さらに形質転換用選択マーカーとしてオロチジン-5-リン酸デカルボキシラーゼをコードするPyrG遺伝子を用いるために、PyrG遺伝子の一部が欠損したDNA断片配列を用いて、5’-ホスホオロチジン酸耐性を指標とし、プロトプラストPEG法を用いる当業者に公知の手段で形質転換を行い、一部欠損したPyrG配列を保持する株、A4177KP株を取得した。これらKu70およびPyrG遺伝子の破壊に用いたDNA断片は、前述のAspergillus oryzae RkuN16ptr1株のゲノム配列よりPCRにより増幅したDNA断片を用いた。また、遺伝子破壊のためのDNAフラグメントは、玉野らの報告(Tamano et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., (2007) 71: 926-934)に準じて行った。 以下、cpaA遺伝子の遺伝子破壊断片を作製した方法を具体的に挙げる。Aspergillus oryzae NBRC4177株のゲノムを鋳型として、Primer cpaAのLUおよびLLを用いて、cpaA遺伝子の上流側配列を含む断片をPCRにより増幅した。同様に、cpaA遺伝子の下流側配列を含む断片をPrimer cpaAのRUおよびRLを用いて増幅した。さらに、選択マーカーpyrG遺伝子の断片をPrimer cpaAのPUおよびPLで増幅した。Primer cpaAのPUおよびPLは、上記で増幅したcpaA遺伝子の上流側配列断片と下流側配列断片に相補的な配列を有しているため、これら3つの断片を相互にプライマーとしたPCR反応を行うことにより、3つの断片が融合した1つの断片を得た。この断片は、cpaA遺伝子の上流及び下流の部分配列がpyrG遺伝子の両端に存在する構造をしているため、置換破壊を行う遺伝子破壊断片となる。同様の手順で、上記のシクロピアゾン酸生合成遺伝子クラスターに含まれる各遺伝子の破壊断片を、以下のプライマー配列を用いて作製した。 Primer cpaA LU: 5'-TGCTCGCCGTTAGCCTTTCGTTTCAC-3'(配列番号15) LL: 5'-AGCGGCAGAACTGGCAGCAGATAATAGAG-3'(配列番号16) PU: 5'-TGCTGCCAGTTCTGCCGCTACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'(配列番号17) PL: 5'-TTAACACGCTTTCGTCGCTAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'(配列番号18) RU: 5'-AGCGACGAAAGCGTGTTAACCAAGGTATG-3'(配列番号19) RL: 5'-TTTGAGCGCAATCGGGATGAGTAATGTAG-3'(配列番号20) Primer cpaB LU: 5'-CTGCCAAAGCCCTTCTACGTGCTGAGTC-3'(配列番号21) LL: 5'-GTACGTCTGTTGT GGCAGCCTTGATTGCGTCAAACATGAG-3'(配列番号22) PU: 5'-TGACGCAATCAAGGCTGCCACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'(配列番号23) PL: 5'-GGATTGCCAGTGGAGTGGCAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'(配列番号24) RU: 5'-CTGAGGTGCAGTT GCCACTCCACTGGCAATCCTCGAGGAG-3'(配列番号25) RL: 5'-GCAGCAGCACTGAACGCTTCGAAGGTATG-3'(配列番号26) Primer cpaC LU: 5'-TCTTTCCACCGTCGCCTATCTTGCTTTG-3'(配列番号27) LL: 5'-GTACGTCTGTTGTTTCCAGGACATCGCCAGATGTGTGAG-3'(配列番号28) PU: 5'-ATCTGGCGATGTCCTGGAAACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'(配列番号29) PL: 5'-CCCTCATTCAAGGCAGCGGAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'(配列番号30) RU: 5'-CTGAGGTGCAGTTCCGCTGCCTTGAATGAGGGCTACGTC-3'(配列番号31) RL: 5'-CCCCCACAGCAAGGTCGAGTAATCTGAC-3'(配列番号32) Primer cpaD LU: 5'-CGGTTGCTTGCGAAGGGATTTTCAGATG-3'(配列番号33) LL: 5'-GTACGTCTGTTGTTGGCGCTAAGAGCTGTTGCTGTCGTCTC-3'(配列番号34) PU: 5'-GCAACAGCTCTTAGCGCCAACAACAGACGTACCCTGTGATGTTC-3'(配列番号35) PL: 5'-GCGCTTGGCATTTTCGTTCAACTGCACCTCAGAAGAAAAGGATG-3'(配列番号36) RU: 5'-CTGAGGTGCAGTTGAACGAAAATGCCAAGCGCAAAGTCATC-3'(配列番号37) RL: 5'-CTCTGATCCAGGGGCTAGCTCCCAATC-3'(配列番号38) こうして得られた遺伝子破壊断片を用いて、アスペルギルス・オリゼ4177K株を宿主とした形質転換をおこない、遺伝子破壊株を取得した。遺伝子破壊の確認は、用いた遺伝子破壊断片よりも外側の配列から増幅するプライマーを用いたPCRにより、選択マーカーの遺伝子に相当する増幅断片長の変化を指標に行った。PCRによる遺伝子破壊の確認についての模式図と各遺伝子破壊株について確認を行った結果を図5に示した。確認に用いたプライマーの配列は、以下の通りである。 Primer cpaA CU: 5'-CGGCGAGATAGTGGCTGCCTATGCTC-3'(配列番号39) CL: 5'-CAGGGTCAAGCCCCAGAACATTCATG-3'(配列番号40) Primer cpaB CU: 5'-GGCACCCGAAAGCTGAGCAATGGAG-3'(配列番号41) CL: 5'-TGGCGCGTGGCAACAAGGTCTATG-3'(配列番号42) Primer cpaC CU: 5'-AGGCCCGAGATGAGCAATCTTGGGAATC-3'(配列番号43) CL: 5'-ACCGCGTTTGTGCGAGACCGTACTTGAC-3'(配列番号44) Primer cpaD CU: 5'-GCGTCTCTGGCATTCGTACCATCTATG-3'(配列番号45) CL: 5'-ATACTGGAGACACAGCGCACACGATAC-3'(配列番号46) である。 更に、取得した各遺伝子破壊株の代謝物解析をLC/MSにより行った。ペニシリウム・カマンベルティにおいて推定されているシクロピアゾン酸合成経路の中間体は、サイクロ‐アセトアセチル‐L‐トリプトファン、ベータ・シクロピアゾン酸、アルファ・シクロピアゾン酸であり(図6)、それぞれの精密分子量は270.1004、338.1630、336.1474である。LC/MS解析では、プロトン付加した分子を検出するため、各分子量に1.0078を加えた値のピークについて調べ、各遺伝子破壊株における蓄積量の相対値を示したものが、図7のグラフである。グラフから明らかなように、PKS-NRPS遺伝子を破壊した株(DcpaA)においては、一切のシクロピアゾン酸生合成中間体は蓄積していない。これに対して、それ以外の遺伝子を破壊した株では、シクロピアゾン酸生合成中間体が蓄積していることが確認された。従って、PKS-NRPS遺伝子を破壊することで、シクロピアゾン酸の中間体も生産されないより安全な株が得られることが分かった。 [シクロピアゾン酸生産能の判別方法] 実施例1の結果から、アスペルギルス・オリゼにおいては、シクロピアゾン酸生産菌と非生産菌の間では、第3染色体末端領域の塩基配列が異なり、シクロピアゾン酸生産菌は、非生産菌においては欠失が生じているPKS-NRPS遺伝子を完全長保持していること、さらにテロメアまでに、約17~18kbの配列が存在することがわかった。そこで、このようなシクロピアゾン酸生産菌のみが有している領域を増幅標的配列としたPCRプライマーを実施例1と同様に、アスペルギルス・フラバスのゲノム情報より作製し、複数のアスペルギルス・オリゼ株(シクロピアゾン酸生産菌としてNISL3010株及びNBRC4177株、並びに、シクロピアゾン酸非生産菌としてRIB40株)について、PCRによる増幅試験を行った。 まず、アスペルギルス・オリゼ株をCYA培地で24時間液体培養し、ろ過により回収した菌体を液体窒素により凍結後、乳鉢と乳棒を用いて破砕した。破砕した菌体より、2%SDS、0.1M NaCl、10mM EDTAを含む50mMトリス‐HCl緩衝液を用いて、ゲノムDNAを抽出し、リボヌクレアーゼAによりRNAを分解した後、フェノール・クロロホルム処理により精製した。各株よりゲノムDNAを抽出し、それらを鋳型としてPCR解析を行った。尚、反応溶液は、ゲノムDNA 1μl、プライマーセット 2μl、Ex taq バッファー 5μl、25mM dNTP 5μl、Ex-Taq 0.8μl 蒸留滅菌水 36.2μlで行った。PCR反応は、バイオラッド社製PTC220を用い、94℃2分の後、94℃20秒、60℃20秒、72℃20秒を30サイクル繰り返した。反応産物は、0.8%アガロースゲルなどで電気泳動したのち、エチジウムブロマイドで染色することで、紫外線照射により増幅産物をバンドとして可視化した。尚、使用したPCRプライマー配列は以下の通りである。 Primer set 1 forward primer: 5'-GTCGCCACTTCTGCTCCCATCAAC-3'(配列番号47) reverse primer: 5'-GGGCACAAGACTGCGATTGTGTCTC-3'(配列番号48) Primer set 2 forward primer: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号49) reverse primer: 5'-GCACAAACCGTGAAATGATCCTTTTCACTG-3'(配列番号50) Primer set 3 forward primer: 5'-CCGGTGAAGAGCTTCAAGGAATATATG-3'(配列番号51) reverse primer: 5'-CAGTACGCAAATCGGAATCAAGTTGCAGAG-3'(配列番号52) Primer set 4 forward primer: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号53) reverse primer: 5'-CTCCACGAGTGCGGGGAGTGGGCCAATAG-3'(配列番号54) Primer set 5 forward primer: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号55) reverse primer: 5'-GGCCGCACGTGACTTCAGTCATGTGATC-3'(配列番号56) Primer set 6 forward primer: 5'-GGGAGGAACAATTGTATTGCTGGCTTTG-3'(配列番号57) reverse primer: 5'-CGGATTGTCCCACGCTCATAGTGTTTTGC-3'(配列番号58) Primer set 7 forward primer: 5'-ACTCATGATGCGGCGATGTTCTCTCA-3'(配列番号59) reverse primer: 5'-GGGCACAAGACTGCGATTGTGTCTC-3'(配列番号60) 上記の各プライマーセットにより増幅させたDNA断片は、0.8%のアガロースゲルにより分離し、エチジウムブロマイドによる染色後、紫外線照射によりバンドとして可視化した。その結果を図8~11に示した。これらの結果から、シクロピアゾン酸生産菌であるNISL3010株及びNBRC4177株では上記の各プライマーセットによって塩基配列が増幅されたものの、シクロピアゾン酸非生産菌であるRIB40株では全く増幅されないことが確認された。又、上記の各プライマーセットによって増幅される塩基配列の推定領域を図12に示した。但し、アスペルギルス・フラバスの配列情報をもとにしているため、アスペルギルス・オリゼにおける増幅領域の位置は0~1,000塩基程ずれる可能性がある。図12に示されるように、プライマーセット1~7により増幅される部分塩基配列は、その全体又はその一部が配列番号1で示されるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における4,217番目からテロメアまでの領域に含まれていることが判る。 更に、アスペルギルス・オリゼ株のシクロピアゾン酸生産菌としてNISL3010株及びNBRC4177株、並びに、シクロピアゾン酸非生産菌としてRIB40株、さらに、実施例1に記述の方法でシクロピアゾン酸非生産菌であることを確認した、RIB83株及びRIB430株を用いて、同様の実験を行った。反応溶液は、ゲノムDNA 1μl(200ng)、プライマーセット 2μl、Ex taq バッファー 5μl、25mM dNTP 5μl、 Ex-Taq 0.2μl 蒸留滅菌水 36.5μlで行った。PCR反応は、バイオラッド社製PTC220を用い、94℃2分の後、94℃20秒、60℃20秒、72℃4分を30サイクル繰り返した。反応産物は、0.8%アガロースゲルなどで電気泳動したのち、エチジウムブロマイドで染色することで、紫外線照射により増幅産物をバンドとして可視化した。尚、使用したPCRプライマー配列は以下の通りである。その結果を図13に示した。これらの結果から、シクロピアゾン酸生産菌であるNISL3010株及びNBRC4177株では上記の各プライマーセットによって塩基配列が増幅されたものの、シクロピアゾン酸非生産菌であるRIB40、RIB83株及びRIB430株産菌株では全く増幅されないことが確認された。又、図13に示されるように、プライマーセットP-1~P-3により増幅される部分塩基配列は、配列番号1で示されるポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの塩基配列における4,217番目~11,721番目の塩基配列からなるポリヌクレオチド領域に含まれていることが判る。 Primer set P-1 +4985 forward primer: 5'-TTTCCCTGGTGGAGCTTGACGAGCC-3' (配列番号61) +7659 reverse primer: 5'-CTCATGCATAGAGACAGCGTGTTCC-3' (配列番号62) Primer set P-2 +5704 forward primer: 5'-GAGCCCGATGAGTTACTTGCTGCTG-3' (配列番号63) +9485 reverse primer: 5'-CCTCCGTTCATGATGGCATTGAGAGTCTG-3' (配列番号64) Primer set P-3 +8939 forward primer: 5'-GCTATTTGCAGCTCCAAGCGCAAAG-3' (配列番号65) +11103 reverse primer: 5'-TTGCGACTGGAGGGCAAATTCGGCG-3' (配列番号66) Primer set P-4 (コントロールプライマー: Tominaga et al., Appl. Environ. Microbiol. (2006) 72: 484-490. 参照) control forward primer: 5'-CCAAGAACATGATGGCTGCT-3' (配列番号67) control reverse primer: 5'-CTTGAAGAGCTCCTGGATGG-3' (配列番号68) 以上の結果から、上記の各PCRプライマーセットを用いてシクロピアゾン酸生産菌において検出されたバンドはシクロピアゾン酸非生産菌においては検出されず、本発明方法によりアスペルギルス菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別することが可能であり、それによって、シクロピアゾン酸生産菌と非生産菌が判別できることが示された。 本発明によって、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ(PKS-NRPS)を発現しないアスペルギルス菌等の形質転換体(株)を作製することが可能となった。その結果、マイコトキシンの一種であるシクロピアゾン酸及びその前駆体であるサイクロアセトアセチルL-トリプトファン(CAT)を生産する恐れのない安全なアスペルギルス菌等を産業上利用することが可能となった。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}},"description_lang":["ja"],"has_description":true,"has_docdb":true,"has_inpadoc":true,"has_full_text":true,"biblio_lang":"ja"},"jurisdiction":"WO","collections":[],"usersTags":[],"lensId":"158-800-567-603-634","publicationKey":"WO_2009_051152_A1","displayKey":"WO 2009/051152 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\n(1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
\n(2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
\n(3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。"],"number":1,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["以下のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド:
\n(1)配列番号1で示される塩基配列から成るポリヌクレオチド、
\n(2)配列番号1で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。"],"number":2,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["アスペルギルス・オリゼのゲノムに含まれるゲノムDNAである、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。"],"number":3,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["cDNAである、請求項1又は2記載のポリヌクレオチド。"],"number":4,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["以下のポリペプチドから成るポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ:
\n(1)配列番号2に示されたアミノ酸配列から成るポリペプチド、
\n(2)配列番号2に示されたアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド、又は、
\n(3)配列番号2に示されたアミノ酸配列と全体の平均で、90%以上の相同性(同一性)を有し、且つ、ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼ活性を有するポリペプチド。"],"number":5,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["遺伝子操作によりアスペルギルス属又はペニシリウム属に属する微生物のシクロピアゾン酸非生産形質転換体を作製する方法。"],"number":6,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["シクロピアゾン酸非生産形質転換体がサイクロアセトアセチルL-トリプトファン非生産菌である、請求項6記載の方法。"],"number":7,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["シクロピアゾン酸非生産形質転換体がポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼを発現しない菌である、請求項6又は7記載の方法。"],"number":8,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["遺伝子操作が請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドを破壊するものである、請求項6~8のいずれか一項に記載の方法。"],"number":9,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["遺伝子操作を非相同組換えに関わるKu遺伝子が破壊された菌株に対して行う、請求項9記載の方法。"],"number":10,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["微生物がアスペルギルス・オリゼ株である、請求項6~10のいずれか一項に記載の方法。"],"number":11,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌であるアスペルギルス・オリゼ株を使用する、請求項11記載の方法。"],"number":12,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["相同組み換え頻度が上昇した形質転換菌が、Aspergillus oryzae A4177K株である、請求項12記載の方法。"],"number":13,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["請求項6~13のいずれか一項記載の製造方法により得られた、シクロピアゾン酸非生産形質転換体。"],"number":14,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["アスペルギルス・オリゼ株である、請求項14記載のシクロピアゾン酸非生産形質転換体。"],"number":15,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域、又は、該ポリヌクレオチドの終止コドンからテロメアまでの領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸生産能を判別することを特徴とする、シクロピアゾン酸生産能の判別方法。"],"number":16,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["請求項1又は2記載のポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’側領域に含まれるポリヌクレオチドの部分塩基配列を検出し、該部分塩基配列の有無に基づきアスペルギルス菌株又はペニシリウム菌株におけるシクロピアゾン酸非生産菌を識別することを特徴とする、シクロピアゾン酸非生産株の識別方法。"],"number":17,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["アスペルギルス菌株がアスペルギルス・オリゼである、請求項16又は17記載の方法。"],"number":18,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドの3’領域が配列番号1で示される塩基配列における4,217番目~11721番目である、請求項16~18のいずれか一項に記載の方法。"],"number":19,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["ポリケタイドシンターゼ・ノンリボゾーマルペプチドシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとその3’下流領域にあるテロメア配列との間に含まれるポリヌクレオチド領域が配列番号3で示される塩基配列を有する、請求項16記載の方法。"],"number":20,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をポリメラーゼ連鎖反応によって検出する、請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。"],"number":21,"annotation":false,"title":false,"claim":true},{"lines":["ポリヌクレオチドの部分塩基配列の存在の有無をサザン解析によって検出する、請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。"],"number":22,"annotation":false,"title":false,"claim":true}]}},"filters":{"npl":[],"notNpl":[],"applicant":[],"notApplicant":[],"inventor":[],"notInventor":[],"owner":[],"notOwner":[],"tags":[],"dates":[],"types":[],"notTypes":[],"j":[],"notJ":[],"fj":[],"notFj":[],"classIpcr":[],"notClassIpcr":[],"classNat":[],"notClassNat":[],"classCpc":[],"notClassCpc":[],"so":[],"notSo":[],"sat":[]},"sequenceFilters":{"s":"SEQIDNO","d":"ASCENDING","p":0,"n":10,"sp":[],"si":[],"len":[],"t":[],"loc":[]}}