Method For Forming Disulfide Bridges

AplaGen GmbH

Arnold-Sommerfeld-Ring 2, 52499 Baesweiler

Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken

Im Stand der Technik sind verschiedene Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken bekannt. So ist es beispielsweise bei einer Standardmethode zur Zyklisierung von Peptiden durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken bekannt, K3[Fe(CN)e] als Oxidationsmittel einzusetzen. Dieses Reagenz gewährleistet saubere Zyklisierungspro- dukte bei hohen Ausbeuten; Nebenreaktionen werden vermieden. Darüber hinaus sind noch Zyklisierungen durch den Einfluss von Sauerstoff oder Jod bekannt. Diese Methoden haben jedoch den Nachteil, dass sie entweder zu langsam sind oder eine Vielzahl unerwünschter Nebenprodukte zur Folge haben. Eine andere bekannte Methode zur Zyklisierung von Peptiden ist der Einsatz von immobilisierten Ellmann's-Reagenz (5,5;- Dithiobis(2-Nitrobenzoesäure)) als Oxidationsmittel. Diese Methode ermöglicht die vollständige Oxidation bspw. eines linearen Peptids; Unreinheiten durch das Reagenz werden vermieden. Dieser Ansatz wurde erst kürzlich zu Cross-Linked-Ethoxylate-Acrylate- Resin (CLEAR)-Trägern erweitert. Diese sind sowohl mit organischen als auch mit wässrigen Lösungsmittelmischungen kompatibel.

Eine weitere im Stand der Technik bekannte Methode zur Ausbildung von Disulfidbrücken bspw. zur Zyklisierung von Peptiden ist der Einsatz von DMSO als Oxidationsmittel. Dieses Verfahren führt ebenfalls zu einer vollständigen Oxidation des linearen Peptids. Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass die Reaktion sehr langsam ver- läuft und dass der Überschuss an DMSO vor der weiteren Prozessierung entfernt werden muss, was sich bei diesem organischen Lösungsmittel schwierig gestaltet.

Aus obigen Ausführungen ergibt sich, dass mehrere Methoden zur Ausbildung von Disulfidbrücken bei Peptiden und Proteinen bekannt sind. Jede dieser Methoden hat jedoch entweder hinsichtlich der Ausbeute, der Reaktionsgeschwindigkeit oder der Reinheit Nachteile.

Die kontrollierte Ausbildung bzw. Förderung von Disulfidbrücken ist jedoch nicht nur für die Peptid- und Proteinchemie bedeutsam, sondern spielt auch im kosmetischen und therapeutischen Bereich eine wichtige Rolle, da auch die Struktur von keratinhaltigen Strukturen wie der Haut, der Nägel und des Haares durch disulfidbrückenhaltige Proteine bestimmt bzw. beeinflusst wird.

Die äußere Haut (Cutis) gliedert sich prinzipiell in 3 Hauptschichten: Oberhaut (Epidermis), Lederhaut (Dermis oder Corium) und Unterhaut (Subcutis).

Die Epidermis oder "Oberhaut" gehört zu den Epithelgeweben, es handelt sich um ein mehrschichtiges verhornendes Plattenepithel, das üblicherweise zwischen 0,03 bis 0,05 Millimeter, an den Handinnenflächen und den Fußsohlen aber bis zu mehrere Millimeter dick ist. Sie bildet als äußerste Hautschicht die eigentliche Schutzhülle gegenüber der Umwelt. Sie ist mehrschichtig und besteht zu 90 Prozent aus Keratinozyten, den eigentlichen Epidermiszellen, die durch so genannte Desmosomen zusammengehalten werden. In den obersten Schichten besteht die Epidermis aus verhornten Plattenepithelzellen. Man unterscheidet insgesamt fünf Schichten: Homschicht (Stratum corneum), Glanzschicht (Stratum lucidum), Körnerschicht (Stratum granulosum), Stachelzellschicht (Stratum spinosum) sowie die Basalschicht (Stratum basale). Eine typische Eigenschaft der Epidermis ist ihre Mechanosensitivität, die z.B. durch die Schwielenbildung an Händen und Füßen als Folge vermehrter Belastung sichtbar wird.

Der Keratinozyt ist der in der Epidermis (Oberhaut) hauptsächlich (über 90 Prozent) vorkommende Zelltyp. Dieser Zelltyp produziert Keratin und differenziert während er von der untersten Schicht der Oberhaut zu den obersten Schichten (also der Außenwelt zugewandt) gelangt. In der sogenannten Basalzellschicht befinden sich proliferierende Zellen direkt auf der Basalmembran, die für einen ständigen Nachschub neuer Keratinozyten sorgen.

Keratin ist ein Strukturprotein, das für Stabilität und Form der Zellen verantwortlich ist. Bestimmte Untergruppen dieses Proteins (die sog. trichozytischen Keratine) sind auch Hauptbestandteil von Haaren und Nägeln.

Die Festigkeit dieser Keratine wird durch Faserbildung verstärkt. Die einzelnen Aminosäureketten bilden eine rechtsgängige Alpha-Helix aus; je drei dieser Helices bilden eine linksgängige Superhelix (= Protofibrille). Elf dieser Protofibrillen vereinigen sich zu einer Mikrofibrille, welche sich wiederum ihrerseits zu Bündeln vereinigen und dadurch Makrofibrillen ausbilden, die die Zellen des Haares umgeben. Neben dem strukturbildenden Keratin werden im Rahmen der Verhornung von Plattenepithel (Epidermis) und bei der Entstehung von Keratin-basierten Hautanhangsgebilden (Haare, Nägel) auch viele andere zelluläre Moleküle der zunächst differenzierenden, später absterbenden Keratinozyten in die Keratinmatrix eingeschlossen. Ein wichtiges Protein ist dabei das sogenannte Filaggrin, das für die Quervernetzung mitverantwortlich ist. Während die Keratinozyten zugrunde gehen und dabei große Mengen dieser Proteine produzieren, kommt es in den oberen Schichten der Haut (Stratum lucidum und Stratum corneum) zu massiven Quervernetzungen. Eine wesentliche chemische Grundreaktion, die die Endfestigkeit des entstehenden Keratingebildes wesentlich beeinflusst, ist die Schließung von Disulfidbrücken zwischen den Sulfhydryl-reichen Proteinen der Keratinmatrix.

Diese kovalente Quervernetzung über Disulfid-Brücken verleiht dem Keratingebilde eine besondere Festigkeit. Je höher der Anteil an Disulfid-Brücken zwischen den einzelnen Helices ist, desto geringer ist die Biegsamkeit der Faser. Keratine in Hörn, Haar oder Nägeln sind weniger biegsam als die weichen Keratine aus der Haut. In den härtesten α-Keratinen wie dem Hörn der Nashörner sind bis zu 18 % der Aminosäuren an solchen Quervernetzungen über Disulfidbrücken beteiligt.

Wie ausgeführt, ist auch das Haar stark keratinhaltig. Das Haar kann grob in drei Schichten unterteilt werden, Cuticula, Codex und Medulla.

Die äußerste Schicht, Cuticula oder Schuppenschicht genannt, besteht aus flachen, übereinandergreifenden Zellen, die ähnlich wie bei einem Tannenzapfen zur Haarspitze orientiert sind. Sie besteht aus sechs bis zehn solcher Zelllagen. Die Schuppenschicht zeigt den Gesundheitszustand des Haares an. Beim gesunden Haar liegt die Schuppenschicht flach an und ergibt so eine glatte, durchscheinende Oberfläche. Das Licht wird optimal reflektiert und ergibt so den gesunden Glanz des Haares. Alkalisches Milieu öffnet die Schuppen, saure Umgebung verschließt sie. Die Schuppenschicht kann durch kosmetische Behandlungen wie Färben oder Dauerwellen stark strapaziert werden; das Haar wird dann stumpf und spröde.

Der Cortex („Rinde"), Faserschicht oder Faserstamm macht ca. 80 % des Haaranteils aus. Hier spielen sich sämtliche relevanten chemischen Prozesse ab, die bspw. bei kosmetischen Behandlungen erfolgen. Der Cortex besteht aus Faserbündeln, die aus einer großen Zahl feinster Keratinfasem, den Fibrillen, bestehen. Diese entstehen vermutlich dadurch, dass sich Cortexzellen aneinanderlagern. Die Verbindung zwischen den beiden Zellen wird durch den Zellmembrankomplex hergestellt, den man sich als eine Art Kittsubstanz vorstellen kann. Die Reißfestigkeit und Elastizität des Haares sind auf diese Verkittung zurückzuführen. Im Inneren des Haares befindet sich die Medulla (Haarmark). Sie besteht aus Zellwandungen, Abbauprodukten der Cortexzellen und Fetten.

Die zuvor beschriebenen Disulfidbrücken im Keratin werden bei insbesondere bei kosmetischen Anwendungen ausgenutzt, um keratinhaltige Strukturen, wie insbesondere Haare zu verformen.

Bei der dauerhaften Haarverformung (bspw. einer Dauerwelle oder einer Haarglättung) werden die Haare in der Regel zunächst mit einem Verformungsmittel auf der Basis einer keratinreduzierenden Verbindung behandelt, welche eine Öffnung der Disulfidbrücken des Haarkeratins bewirkt. Dadurch entstehen freie SH-Gruppen. Als Verformungsmittel werden in der Regel keratinreduzierende Mercaptoverbindungen, wie zum Beispiel Salze oder Ester von Mercaptocarbonsäuren, verwendet.

In diesem Zustand werden die Haare dann in die gewünschte Form gebracht, bspw. durch Aufwicklung auf Lockenwickler bzw. Glättung der Haare. Sobald sie in die neue Form gebracht wurden, erfolgt eine zweite chemische Modifizierung, welche vor allem darin besteht, aus den SH-Gruppen durch Oxidation wieder Disulfidbindungen zu bilden. Aufgrund der den Haaren aufgezwungenen Verformung werden die neuen Bindungen an anderen Stellen gebildet als die ursprünglichen Bindungen. Dies bewirkt, dass die Haarsträhnen in der ihr aufgezwungenen neuen Form fixiert werden und somit eine dauerhafte Verformung erreicht wird.

Für den Oxidationsschritt zur Ausbildung von neuen Disulfidbrücken wird oftmals Wasserstoffperoxid eingesetzt. Wasserstoffperoxid hat jedoch den Nachteil, dass es das Haar angreift und somit strapaziert.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein alternatives Verfahren zur Erzeugung von Disulfidbrücken bereitzustellen. Ferner liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen zwecks Ausbildung von Disulfidbrücken bereitzustellen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, welches sich dadurch auszeichnet, dass die Reaktion in einem flüssigen oder pastösen Gemisch durchgeführt wird, das wenigstens eine heterozyklische Verbindung enthält, die mindestens ein Stickstoffatom im Ring aufweist.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Oxidationsreaktion von zwei freien

Thiolgruppen hin zu einer Disulfidbrücke um ein Vielfaches beschleunigt. Die heterocyclischen Verbindungen werden dabei vorzugsweise in katalytischen Mengen zugegeben und bleiben während der Reaktion unverändert. Sie können bei Bedarf auch nach der Reaktion entfernt werden. Als Substanzen ist eine Vielzahl heterocylischer Verbindungen geeignet, die im Folgenden noch näher beschrieben werden. Überraschender Weise wurde ferner gefunden, dass die beschleunigende Eigenschaft dieser heterozyklischen Verbindungen hinsichtlich der Ausbildung von Disulfidbrücken durch weitere Zusatzstoffe noch verstärkt werden kann. Als Zusatzstoffe können Metallverbindungen, wie beispielsweise Metallionen bzw. Metallionen enthaltende oder freisetzende Verbindungen, wie beispielsweise Metallsalze oder Metallkomplexe eingesetzt werden.

Durch die Zugabe bereits geringer Mengen dieser Metallverbindungen (wenigstens eine) kommt es zu einer weiteren Beschleunigung der durch die heterozyklischen Verbindungen katalysierten Oxidation von SH-Gruppen-haltigen Verbindungen wie bspw. Peptiden, Proteinen oder keratinhaltigen Strukturen (wie bspw. Haut, Nägeln oder Haaren).

Entsprechend betrifft Anspruch 1 ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Reaktion in einem Medium durchgeführt wird, das wenigstens eine Verbindung enthält, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer

Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;

(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

in welcher der Substituent A

- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gege- benenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder

Mercapto steht.

Es hat sich überraschender Weise gezeigt, dass die oben definierten heterozyklischen Verbindungen die Ausbildung von Disulfidbrücken fördern und somit in der Reaktion als eine Art Katalysator wirken können. Ihre Wirkung wird durch Zugabe wenigstens einer erfindungsgemäßen Metallverbindung noch verstärkt. Es ist daher vorteilhaft, diese Verbindungen dem Reaktionsgemisch hinzuzufügen, um die Ausbildung von Disulfidbrücken bei unterschiedlichen SH-Gruppen tragenden Substanzen, wie insbesondere Peptiden und Proteinen sowie keratinhaltigen Strukturen, zu fördern.

Die wenigstens eine Metallverbindung kann eine Metallionen enthaltende oder freisetzende Verbindung sein. Sie ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe der Metallsalze, Metallsalzkomplexe und löslichen Metallverbindungen.

Erfindungsgemäß einzusetzende Metallverbindungen sind daher vorzugsweise Ionen bzw. solche freisetzende Verbindungen oder lonenkomplexe von Metallen. Auch hochaffine Chelatkomplexbildner, wie Ethylendiamintetraacetat (EDTA), behindern die verstärkenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen metallhaltigen Zusätze nicht und können als Hilfsmittel eingesetzt werden. Als Metalle sind insbesondere Übergangsmetalle, wie Eisen, Kobalt, Nickel, Kupfer, Zink, Mangan, Chrom oder Silber; Erdalkalimetalle, wie bspw. Calcium oder Magnesium oder aber Hauptgruppenmetalle, wie bspw. Aluminium geeignet. Auch die Ionen weiterer Übergangsmetalle zeigen einen verstärkenden Effekt.

Besonders geeignet sind die Salze des Kupfers, Chroms, Mangans, Kobalts, Nickels, Zinks, Magnesiums und Calciums. Ein besonders starker Effekt ist jedoch bei den Eisen(ll)- und Eisen(lll)-salzen zu beobachten, die daher vorzugsweise eingesetzt werden. Entsprechend kann die Metallverbindung ausgewählt sein aus der Gruppe der Kupfer(ll)salze, Chrom(lll)salze, Mangan(ll)salze, Kobalt(ll)salze, Nickel(ll)salze, Zink(ll)salze, Magnesium(ll)salze, Calcium(ll)salze sowie Eisen(ll)- und Eisen(lll)salze.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Metallverbindungen zeigen bereits in geringen Mengen einen vorteilhaften Effekt auf die Oxidationsreaktion. Vorzugsweise wird der Zusatz in einer Menge von wenigstens 1 μM, wenigstens 2 μM und besonders bevorzugt in einer Menge von wenigstens 3 μM und besonders bevorzugt in einer Menge von wenigstens 10 μM eingesetzt. Jedoch können auch deutlich höhere Mengen eingesetzt werden, wobei sich jedoch gezeigt hat, dass ab einer bestimmten Menge an metallhaltigem Zusatz die Reaktion nicht durch Erhöhung der Konzentration weiter beschleunigt werden kann. Das Konzentrationsoptimum kann je nach metallhaltiger Substanz und zu oxidierendem Stoff variieren. Es empfiehlt sich daher, das Optimum experimentell zu bestimmen. Dass der metallhaltige Zusatz bereits in geringen Mengen und in Gegenwart hochaffiner Komplexbildner eine beschleunigende Wirkung zeigt, ist insbesondere bei der Behandlung von keratinhaltigen Strukturen von Vorteil. Dies, da von kosmetischen Behandlungen bekannt ist, dass bspw. Kupfer und Eisen in größeren Mengen eine Verfärbung von keratinhaltigen Strukturen (insbesondere des Haares) bewirken können, was zu vermeiden ist.

Gemäß einer Ausführungsform weist die Verbindung gemäß Alternative (a) folgende Grundstruktur auf:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;

- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei, Stickstoffatome aufweist;

- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2JnCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, R5 zusammen mit R6 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt oder R4 und/oder R5 fehlen;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R6 fehlt.

Fehlen können die genannten Substituenten R2 bis R6 dann, wenn an der verknüpfenden Position im Ring ein Stickstoffatom sitzt, das eine Doppelbindung aufweist (siehe bspw. die Verbindungen 2,6-Dihydroxy-Pyridin-Hydrochlorid; Uracil-6- Carbonsäure, 4,6-Dihydroxypyrimidin).

Ein zentrales Merkmal der erfindungsgemäßen Substanzen gemäß der Alternative (a) ist das Vorhandensein des 6-gliedrigen, stickstoffhaltigen Heterozyklus sowie der Hydroxy- oder erfindungsgemäßen Oxogruppe (=O) am benachbarten Kohlenstoffatom. „Oxogruppe" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass der jeweilige Substituent mit dem Ringatom zusammen eine Oxogruppe bildet und entsprechend ein Sauerstoffatom über eine Doppelbindung an den Ring gebunden ist:

So haben umfangreiche Versuche gezeigt, dass Verbindungen ohne eine solche funktionelle Gruppe (Hydroxygruppe, Oxogruppe =0) regelmäßig nicht die Fähigkeit aufwiesen, die Ausbildung der Disulfidbrücken zu fördern (so bspw. Aminopyrazin, 2,4- Diaminopyrimidin, Melamin, Pyrazincarbonsäure und Pyrazinamid).

Wie sich aus der Definition der Substituenten ergibt, gibt es Verbindungen, die nur ein Stickstoffatom im Heterozyklus aufweisen und die vorteilhaften Wirkungen hinsichtlich der Förderung der Ausbildung der Disulfidbindungen aufzuweisen. Ein Beispiel für eine

Verbindung mit nur einem Stickstoffatom im Heterozyklus und einer erfindungsgemäßen Oxogruppe (=0) am benachbarten Kohlenstoffatom ist die Verbindung N-Methyl-2-Pyridon:

Ein weiteres Beispiel für eine Verbindung mit nur einem Stickstoffatom im Heterozyklus und mit einer Hydroxylgruppe am benachbarten Kohlenstoffatom ist die Verbindung 2,6- Dihydroxy-Pyridin-Hydrochlorid:

H

Wie im Anspruch festgelegt, ist der Heterozyklus im Falle des Vorhandenseins von Hydroxygruppen ungesättigt. Versuche haben gezeigt, dass in diesem Fall das Vorhandensein wenigstens einer Doppelbindung für die katalytische Wirkung augenscheinlich bedeutsam ist. Ohne darauf festgelegt sein zu wollen, wird spekuliert, dass dies darauf zurückzuführen sein könnte, dass Verbindungen dieser Struktur tautomerisieren können. Tautomere sind Strukturisomere, die sich lediglich in der Stellung einer Gruppe (bspw. Wasserstoff) und in der Stellung einer Doppelbindung unterscheiden. Im Falle der Hydroxy- und der Oxogruppe (=0) spricht man auch von Keto-Enol-Tautomerie. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die aromatisch vorliegenden Verbindungen, wie das 2,6-Dihydroxy-pyridin Hydrochlorid tautomerisieren können. Dies trifft insbesondere auf die Enolformen zu, die vorzugsweise in Richtung der Ketoform tautomerisieren können. Tautomere (Isomere) Formen der dargestellten Substanzen sind daher erfindungsgemäß mit umfasst.

Vorzugsweise weist der sechsgliedrige Heterozyklus zwei Stickstoffatome auf, die unterschiedlich positioniert sein können. Beispiele für aktive Verbindungen dieser Struktur sind Uracil-6-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6- hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6-Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion:

Ein Beispiel für Verbindungen, bei denen R5 und R6 zusammen eine Ringstruktur bilden, ist 7-Hydroxy-5-methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin:

Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Verbindung folgende Substruktur auf:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.

Aktive Beispiele dieser Ausführungsform sind bspw. Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat und Violursäure

Auch sind entsprechende Derivate dieser Stoffe geeignet.

Weitere Beispiele dieser Ausführungsform sind Uracilderivate der folgenden allgemeinen Formel:

wobei R4 und R6 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen, vorzugsweise für Wasserstoff oder einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C10 Alkylrest, besonders bevorzugt für einen C1 bis C4 Alkylrest oder Wasserstoff stehen.

Beispiele mit guter Aktivität sind Uracil und

Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung, die die Ausbildung von Disulfidbindungen fördert, um Purinderivate, deren Grundgerüst der folgenden allgemeinen Formel entspricht

wobei der Fünfring ungesättigt ist und entsprechend Doppelbindungen aufweist und wobei

R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C10-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substitu- ierten C6- oder CiO-Arylrest; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest stehen;

- R7, R8 und R9, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl oder eine funktionelle Gruppe stehen; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C10-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C8-Alkyl; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 6 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C6-Alkyl; insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -{CH2)n-COOX mit n = 1 bis 4 und X gleich Wasser- stoff oder C1- bis C3-Alkyl stehen.

Wie dargelegt, kann die cyclische Verbindung demnach auf einem Puringrundgerüst basieren. Das Puringrundgerüst kann als kondensiertes Ringsystem, zusammengesetzt aus den beiden Heterocyclen Pyrimidin und Imidazol, aufgefasst werden. Sein systematischer lUPAC-Name ist 7H-lmidazol[4,5-d]pyrimidin. Das 7H-Purin steht mit seinem Isomer, dem 9H-Purin, in einem tautomeren Gleichgewicht, wobei im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Verbindungen als umfasst gelten, welche auf beiden tautomeren Formen basieren:

7H Purin 9H Purin

Je nach Wahl der Substituenten am Pyrimidin-Ring kann dieser auch weniger Doppelbindungen aufweisen.

In einer ganz besonders bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung ist mindestens ein Rest R4, R6, R7 und R9 eine Alkylgruppe und mindestens einer, vorzugsweise zwei der Reste R4, R6, R7 und R9 stellen Wasserstoff oder eine C1- bis C3-Alkylgruppe, vorzugsweise Methyl, dar.

Besondere Beispiele dieser heterozyklischen Verbindungen auf der Basis von Purin sind 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8-Buttersäure und 3-lsobutyl-1-Methylxanthin:

Wie diese ausgewählten Beispiele zeigen, sind tautomere Verbindungen, denen anstelle des oben dargestellten 7H-Puringrundgerüsts das 9H-Puringrundgerüst zugrunde liegt, ebenfalls umfasst. Gemäß einer weiteren Ausführungsform bilden R2 und R3 zusammen einen gegebenenfalls substituierten Sechsring, der optional wenigstens ein Heteroatom aufweist. Bei dieser Ausführungsform handelt es sich vorzugsweise um Verbindungen, bei denen ein Aromat an den Grundheterozyklus ankondensiert wurde. Dies bevorzugt an einer Brücke aus zwei C-Atomen. Beispiele, in denen ein 5-Ring ankondensiert wurde (bspw. Imidazol), wurden bereits vorstehend erläutert (Verbindungen auf Basis des Puringrundgerüsts). Weitere Beispiele für ankondensierte Ringstrukturen sind Pyrazin und Chinoxalin.

Ein Beispiel für eine Verbindung mit einem Benzolring als ankondensierten 6-Ring ist 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on:

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform weist die Verbindung folgende Grundstruktur auf:

wobei die Ringe je nach Wahl der Substituenten ungesättigt sein und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen tragen können und

R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O) darstellt;

R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten C1- bis do-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C1O-

Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenen- falls substituierten C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3-Alkylrest stehen;

R5 für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) steht oder R5 fehlt;

R10 und R13, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder R10 und/oder R13 fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten Cr bis Cio-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder CiO-Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituierten Ci bis C6- Alkylrest stehen;

R11 und R12, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R11 und R12 bilden zusammen einen fünf oder sechsgliedrigen Ring aus, der optional weitere Heteroatome sowie Substituenten tragen kann.

Ausgesuchte Beispiele für unter diese Formel fallende Verbindungen sind bspw. (-)- Riboflavin, Lumazin und Alloxazin

Es hat sich als vorteilhaft für die Wirkung erwiesen, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der Alternative (a) keine exozyklischen Aminogruppen tragen. Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäß einzusetzenden Verbindungen daher keine exozyklischen Aminogruppen auf.

Die oben genannten Substituenten R2, R3, R4 und R5 können ferner unabhängig voneinander Wasserstoff, ein gegebenenfalls substituierter verzweigter oder unverzweigter d- bis C10-Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter C6- oder C10-

Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, ein gegebenenfalls substituierter verzweigter oder unverzweigter C1- bis C6-Alkylrest oder ein gegebenenfalls substituierter C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder ein gegebenenfalls substituierter C1 bis C3-Alkylrest, insbesondere Methylrest, sein.

R6 ist vorzugsweise Wasserstoff oder ein Alkylrest, C1 bis C8, vorzugsweise C1 bis C4, besonders bevorzugt Wasserstoff oder eine Methylgruppe.

Elektronenziehende Gruppen oder Atome, welche vorliegend auch als Substituenten an dem Heterocyclus verwendet werden können (siehe oben), sind bspw. elektronenziehende Gruppen oder Atome, welche als Substituenten die Elektronendichte an einem entsprechenden aromatischen heterozyklischen Ring erniedrigen (auch als deaktivierende Gruppen bezeichnet). Elektronenziehende Gruppen besitzen einen (-)-M- und/oder einen (-)-l-Effekt. Der Resonanz-Effekt (M- Effekt, mesomerer Effekt) wirkt im Allgemeinen nur, wenn die Gruppe direkt an dem ungesättigten heterozyklischen System gebunden ist. Er wirkt über π-Elektronen, im Gegensatz zum Feld-Effekt (I-Effekt, induktiver Effekt), welcher über den Raum, über Solvenz-Moleküle oder vorzugsweise über σ-Bindungen eines Systems wirkt.

Ein elektronenziehender Effekt kann entweder induktiv (d.h. durch den so genannten (- )-l-Effekt) und/oder mesomer (d.h. durch den so genannten (-)-M-Effekt) erfolgen. Die Einteilung von aromatischen Substituenten in Substituenten mit (+)-l- und (-)-l-Effekt sowie mit (+)-M-Effekt und (-)-M-Effekt ist dem Fachmann an sich bekannt. Für weitergehende Ausführungen wird auf Beyer/Walter, „Lehrbuch der Organischen Chemie", 1998, 23. überarbeitete und aktualisierte Auflage, Seiten 515 bis 518, verwiesen, dessen diesbezügliche Offenbarung in die vorliegende Erfindung eingeschlossen wird.

Einige, nicht-beschränkende Beispiele für Gruppen mit (-)-M-Effekt sind -SO2-, -SO2O-, -00-, -COO-, -CONH-, -CONR-, -SOR-, -CN, -NO2, -CHO, -CO-, -COSH, -COS", -SO3H und die erfindungsgemäße Oxogruppe (=O). Wie hieraus deutlich wird, können sich die Begriffe „elektronenziehende Gruppe" und „funktionelle Gruppe" überschneiden. Entsprechende Gruppen sind Beispiele für einsetzbare Substituenten. Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist die Verbindung gemäß Alternative (b) einen Substituenten A auf, der

für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituiertes C1- bis do-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder Cio-Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4

Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto; - insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-

Alkylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert ist; steht.

Besondere Beispiele dieser Pyrimidinderivate sind die folgenden Verbindungen:

Aminexil

Minoxidil Um die Anbindung der Substanz an den Trägerstoff zu ermöglichen, sind funktionelle Gruppen an der erfindungsgemäß zu verwendenden heterozyklischen Verbindung hilfreich. Daher können auch weitere, zuvor nicht explizit erwähnte Derivate der heterozyklischen Verbindungen erfindungsgemäß verwendet werden.

Die zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen können sowohl in reiner Form als auch als Mischungen verschiedener möglicher isomerer Formen, insbesondere von Stereoisomeren, wie E- und Z-, threo- und erythro-, sowie optischen Isomeren, wie R- und S-Isomeren oder Atropisomeren und von Tautomeren vorliegen. Die Erfindung umfasst sowohl die reinen Isomeren als auch deren Gemische.

Je nach Art der oben definierten Substituenten weisen die heterozyklischen Verbindungen saure oder basische Eigenschaften auf und können Salze, gegebenenfalls auch innere Salze bilden. Tragen die Verbindungen der Formel (I) Hydroxy, Carboxy oder andere, saure Eigenschaften induzierende Gruppen, so können diese Verbindungen mit Basen zu Salzen umgesetzt werden. Geeignete Basen sind beispielsweise Hydroxide, Carbonate, Hydrogencarbonate der Alkali- und Erdalkalimetalle, insbesondere die von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium, weiterhin Ammoniak, primäre, sekundäre und tertiäre Amine mit (C1-C4-)-Alkylresten sowie Mono-, Di- und Trialkanolamine von (CrC4)-Alkanolen. Tragen die Verbindungen der Formel (I) Amino, Alkylamino oder andere, basische Eigenschaften induzierende Gruppen, so können diese Verbindungen mit Säuren zu Salzen umgesetzt werden. Geeignete Säuren sind beispielsweise Mineralsäuren, wie Salz-, Schwefel- und Phosphorsäure, organische Säuren, wie Essigsäure oder Oxalsäure, und saure Salze, wie NaHSO4 und KHSO4. Die so erhältlichen Salze sind ebenfalls einsetzbar.

Weitere bevorzugte Gruppen der oben genannten Verbindungen werden nachfolgend diskutiert.

Beispiele für heterozyklische Verbindungen, die erfindungsgemäß zur Förderung der Ausbildung der Disulfidbrücken eingesetzt werden können, können ferner wie folgt beschrieben werden:

Die Reste R1', R2' sowie R3' sind entweder gleich oder verschieden; wenigstens einer der Reste stellt jedoch eine Alkylgruppe dar. Es versteht sich, dass Tautomere, bei de- nen u.a. die Doppelbindung wandert, ebenfalls durch die obige Formel erfasst werden. Entsprechende Strukturisomere werden daher ebenfalls von dieser Formel umfasst. Diese Verbindungen eignen sich wie dargelegt insbesondere zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken in aminosäurehaltigen Substanzen, insbesondere in Peptiden und Proteinen.

Wenigstens einer, vorzugsweise zwei der Reste R1', R2' sowie R3', die entweder gleich oder verschieden sind, stellt vorzugsweise entweder Wasserstoff oder eine C1 bis C5 Alkylgruppe dar. Insbesondere kurzkettige Alkylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, insbesondere die Methyl-Gruppe, haben sich als vorteilhaft erwiesen. Ferner kann wenigstens einer der Reste eine funktionelle Gruppe beinhalten. Ferner ist es auch möglich, dass an den verbleibenden Positionen am heterozyklischen 5-Ring Reste R4' (am Stickstoff) und R5' (am zwischen den Stickstoffatomen liegenden Kohlenstoff) vorliegen (insbesondere bei den tautomeren Formen). Diese sind beliebig gestaltbare, vor- zugsweise organische Reste. Gemäß einer Ausführungsform handelt es sich um funktionelle Gruppen, die die Anbindung der Substanz an bspw. einen Trägerstoff ermöglichen. Diese Variante wird nachfolgend noch im Detail beschrieben.

Besonders bevorzugte Beispiele der erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Verbindungen sind N-Methyl-2-Pyridon, 2,6-Dihydroxy-pyridin-

Hydrochlorid, Uracil-6-carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6- hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin,

4,6-Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion, 7-Hydroxy-5- methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat und Violursäure, Uracil, 1 -Methyl-Uracil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin,

Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7-Essigsäure, Theophyllin-8-Buttersäure, 3- lsobutyl-1-Methylxanthin, 1 ,2,3-Benzotriazin-4(3H)-on, (-)-Riboflavin, Lumazin,

Alloxazin, Minoxidil (= 6-(1-Piperidinyl)-2,4-pyrimidindiamin-3-oxid) und Aminexil (= 2,4-

Diaminopyrimidin-3-oxid).

Diese Substanzen lassen sich erfindungsgemäß besonders gut zur Ausbildung von Disulfidbrücken einsetzten. Besonders bevorzugt sind:

N-Methyl-2-pyridon, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat, Violursäure, 4,6-Dihydroxy- pyrimidin, Uracil-6-carbonsäure, Minoxidil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, 3- lsobutyl-1-methylxanthin, Koffein, Isokoffein, Lumazin, Alloxazin.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass sich insbesondere Peptide und Proteine, insbesondere Peptide mit einer Aminosäurelänge zwischen 5 und 100, vorzugs- weise 10 und 50, besonders bevorzugt zwischen 15 bis 40 Aminosäuren in Wasser selbst bei höheren Peptidkonzentration bei Raumtemperatur nach dem erfindungsge- mäßen Verfahren durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken zyklisieren lassen. Das Verfahren ist daher besonders zur Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken und daher insbesondere zur Zyklisierung von Peptiden geeignet. Ferner lassen sich Polypeptide und Proteine mit dem entsprechenden Verfahren zyklisieren. Ferner lassen sich auch Disulfidbrücken bei anders strukturierten SH-Gruppen tragenden Substanzen ausbilden. Die Ausbildung der Disulfidbrücken, bspw. bei einer Zyklisierung, erfolgt aufgrund der Zugabe der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung wie bspw. Koffein bzw. einer koffeinähnlichen Substanz (siehe obige Formeln) bei einigen Peptiden beinahe quantitativ. Dies ist jedoch nicht zwingend. Überraschender Weise ist es nicht erforderlich (jedoch möglich), ein Oxidationsmittel zur Beschleunigung der Reaktion zuzugeben, da der Luftsauerstoff in Anwesenheit der oben charakterisierten Substanz zur Ausbildung von Disulfidbrücken ausreichend ist.

Versuchsergebnisse haben ferner gezeigt, dass bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktionsgeschwindigkeit im Laufe der Reaktion zunehmen kann. Die positive Beeinflussung durch die erfindungsgemäße Zugabe der oben charakterisierten Substanz ist insofern überraschend, da es sich zumeist - im Gegensatz zu den im Stand der Technik eingesetzten Substanzen DMSO oder lod - nicht um Oxidationsmittel handelt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der Luftsauerstoff zur Oxidation ausreichend, wobei die Reaktionsgeschwindigkeit aufgrund der Zugabe der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindung in vorteilhafter Weise zunimmt. Die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit könnte auch einen autokatalytischen Mechanismus ggf. durch das zyklisierte Produkt nahe legen.

Vorteilhafterweise hat sich gezeigt, dass trotz der Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit und selbst bei Einsatz von hohen Peptidkonzentrationen, oft keine oder nur wenig Oligomerisierungsprodukte auftreten. Die im Falle einer Zyklisierung eines Peptids unerwünschte Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken wurde daher nicht beobachtet. Die einzusetzende Peptidkonzentration hängt jedoch von dem jeweils ein- gesetzten Peptid ab und sollte daher für jedes Peptid optimiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhafter Weise bei Raumtemperatur durchgeführt werden.

Der augenscheinlich autokatalytische Verlauf der Reaktion tritt sowohl in ungepufferten als auch in gepufferten Lösungen (bspw. Phosphatpuffer, pH 6 - 9) auf. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit deutlich erhöht werden kann, wenn der pH-Wert abgesenkt wird. Es ist daher vorteilhaft, den pH-Wert bei < = 7 einzustellen, vorzugsweise in einem pH Bereich von ca. 4 bzw. 5 bis 6,5, besonders bevorzugt ist ein pH Wert um die 6 (5.5 bis 6.5). Die Menge an Substanz, die dem Reaktionsgemisch zugegeben wird, um die Ausbildung der insbesondere intramolekularen Disulfidbrücken zu fördern, variiert je nach Verbindung und dem Stoff, bei dem Disulfidbrücken ausgebildet werden sollen. In der Regel reichen kleine katalytische Mengen. Die einzusetzende Menge liegt vorzugsweise bei wenigstens ca. 0,0001 mg/ml, besonders bevorzugt in einem Bereich von ca. 0,0001 , 0,001 oder 0,01 bis 20mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 15mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 10mg/ml, 0,001 oder 0,01 bis 5mg/ml, vorzugsweise 0,001 oder 0,01 bis 1 mg/ml und besonders bevorzugt in einem Bereich von 0,03 bis 0,5 mg/ml. Die Mengen variieren je nach gewählter Substanz (bspw. Koffein oder koffeinähnlicher Substanz) und zu behandelndem Peptid bzw. Protein und sollten daher jeweils individuell optimiert werden. Ein besonders geeigneter Konzentrationsbereich für Peptide mit einer Länge von ca. 15 bis 25 Aminosäuren (insbesondere im Falle von EPO-mimetischen Peptiden) liegt bei 0,05 bis 0,3mg/ml, besonders bevorzugt bei 0,075 bis 0,15 mg/ml. Die Mengen variieren jedoch wiederum je nach Peptid und können auch deutlich höher liegen; die Mengen sollten daher vorzugsweise für das jeweilige Peptid optimiert werden.

Die Reaktionsgeschwindigkeit kann weiter beschleunigt werden, wenn dem Reaktionsgemisch ein zusätzliches Oxidationsmittel zugegeben wird. Beispielsweise sei GIu- tathion in oxidierter Form (GSSG) genannt.

Überraschender Weise hat sich gezeigt, dass die Zyklisierung effektiv auch bei hohen Peptidkonzentrationen durchgeführt werden kann, ohne dass unerwünschte Oligomeri- sierungen auftreten. Hohe Peptidkonzentrationen sind daher bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei vielen Peptiden eher unproblematisch. Vielmehr hat sich bei einigen Peptiden später gezeigt, dass gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zykli- sierungsreaktion bei hohen Peptidkonzentrationen sogar besser abläuft. Je nach Peptid liegen geeignete Peptidkonzentrationen bei ca. 0,05 bzw.0,1 oder 0,5 bis 5 mg/ml, bevorzugt sind Konzentrationen in einem Bereich von 0,7 bis 1 ,5 mg/ml. Die genaue Konzentration hängt selbstverständlich von dem jeweiligen Peptid, seiner Länge sowie seiner Aminosäurezusammensetzung ab und variiert entsprechend. Die vorliegenden Angaben sind daher nicht beschränkend anzusehen. Für EPO-mimetische Peptide hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, eine Konzentration von ca. 0,7 bis 1 mg/mJ einzusetzen. Sie lassen sich besonders effektiv durch die Zugabe von Koffein zyklisie- ren.

Üblicher Weise wird eine Disulfidbrücke in einem Peptid oder Protein zwischen zwei Cysteinen ausgebildet. Jedoch kann erfindungsgemäß die Disulfidbrücke auch zwischen anderen natürlichen und nicht natürlichen Aminosäuren ausgebildet werden, sofern diese entsprechende Gruppen aufweisen, die zur Ausbildung einer Disulfidbrücke (-S-S-) geeignet sind. Thiolysin, Homocystein und andere Cysteinderivate sind neben Cystein als Beispiele für geeignete Aminosäuren zu nennen. Der Begriff Disulfidbrücke ist jedoch nicht mit dem Begriff Cysteinbrücke gleichzusetzen, sondern umfasst die Ausbildung entsprechender -S-S- Bindungen zwischen irgendwelchen natürlichen oder nicht-natürlichen SH-haltigen Aminosäuren oder anderen SH-Gruppen haltige Verbindungen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich daher auch Disulfidbrücken bei anderen SH-Gruppen haltigen Verbindungen, insbesondere Polymeren, ausbilden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können selbstverständlich auch mehrere Disulfidbrücken ausgebildet werden.

Besonders vorteilhaft kann das vorliegende Verfahren zur Zyklisierung von EPO-mime- tischen Peptiden (siehe bspw. WO 96/40479) eingesetzt werden. Neuartige EPO mimetische Peptide sind in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschrieben, deren Offenbarungsgehalt hinsichtlich der Peptide hiermit vollumfänglich zum Gegenstand dieser Anmeldung gemacht wird. Wie in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) ausführlich beschrieben ist, weisen diese neuartigen EPO mimetischen Peptide kein Prolin in der Position 10 des EPO mimetischen Konsensusmotivs auf (hinsichtlich der Nummerierung wird auf Johnson et al, 1997 verwiesen). Vielmehr ist das Prolin gegen eine nicht konservative Aminosäure, insbesondere eine basische Aminosäure wie insbesondere Lysin, ausgetauscht.

EPO mimetische Peptide zeigen eine besonders gute Aktivität in zyklisierter Form. Übli- cherweise werden daher zwei Peptidmonomere (die Monomere entsprechen Bindungsdomänen) mit einem EPO mimetischen Konsensus jeweils zyklisiert und zu einem Dimer verbunden, da die Bindung an den EPO-Rezeptor in dieser Form am effektivsten ist. Die EPO mimetischen Monomere weisen durchschnittlich 10 bis 25 Aminosäuren auf. Vorzugsweise werden sie, wie in der PCT/EP2005/012075 (WO 2006/050959) beschrieben, als kontinuierliche Dimere (bivalente Peptide) synthetisiert, um separate Dimerisierungsschritte zu vermeiden.

Im Stand der Technik sind verschiedene Methoden zur Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken zur Zyklisierung von EPO-mimetischen oder auch TPO-mimeti- sehen Peptiden bekannt. Kern der bekannten Lehren ist die Oxidation der Cystein- Reste (oder entsprechender anderer SH-Gruppen haltigen Aminosäuren) im EPO-mimetischen Konsensus. Als typisches Oxidationsmittel wurde bislang DMSO eingesetzt, was jedoch die eingangs geschilderten Nachteile aufweist.

Die Zyklisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hat gegenüber den im Stand der Technik bekannten Verfahren einige entscheidende Vorteile. So werden bessere Ausbeuten sowie eine größere Reinheit des Produkts als mit dem im Stand der Technik bekannten Verfahren erzielt. Ein weiterer entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Methode ist die einfache Trennbarkeit des erfindungsgemäßen Zyklisierungsrea- genz vom Reaktionsprodukt durch eine einfache HPLC. Gemäß einer weiteren Variante lässt sich die heterozyklische Verbindung (bspw. Koffein) durch Flüssig-Flüssig-Extrak- tion abtrennen. So lässt sich z.B. Koffein durch wiederholte Extraktion mit Dichlor- methan von einer wässrigen Peptidlösung abtrennen. Bei der Zyklisierung längerer Peptide ist auch die Anwendung von Grössenausschlusschromatographie (size exclu- sion chromatography, SEC) möglich. Die Aufreinigung ist daher erheblich vereinfacht.

Je nach SH-Gruppen haltiger Substanz bzw. Peptid und eingesetzten Reaktionsbedingungen kann die Reaktionszeit auf unter acht Stunden gesenkt werden (bspw. durch Absenkung des pH-Werts; Wahl eines zusätzlichen Oxidationsmittels). Üblicherweise liegt die Reaktionszeit < = vierundzwanzig Stunden, vorzugsweise unter zwanzig Stunden, besonders bevorzugt unter fünfzehn Stunden und ganz besonders bevorzugt zwischen fünf und zehn Stunden.

Neben den erwähnten EPO mimetischen Peptiden wurden jedoch auch andere Peptide erfolgreich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisiert. So unter anderem an dem von Oxytocin abgeleitetem Peptid, welches im Gegensatz zu Oxytocin eine Carbonsäure am C-Term anstelle eines Amides besitzt:

H-CYIQNCPLG-OH das ebenfalls durch Ausbildung einer intramolekularen Cysteinbrücke zyklisiert vorliegt.

Wie erwähnt, wird die intramolekulare Disulfidbrücke vorzugsweise zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet. Diese können natürlich oder nicht-natürlich sein, einzige Voraussetzung ist die Fähigkeit zur Ausbildung einer Disulfidbrücke durch Reaktion der SH- Gruppe. Cystein ist wohl die bekannteste Disulfidbrücken-ausbildende Aminosäure, die auch in der Natur überwiegend zur Ausbildung von Disulfidbrücken eingesetzt wird. Disulfidbrücken treten in der Natur insbesondere bei der Ausbildung intra- und intermolekularer Disulfidbrücken auf. So bewirken sie bspw. den Zusammenhalt zwischen den einzelnen Polypeptidketten von Proteinen (bspw. Insulin) in Form von intermolekularen Disulfidbrücken und bewirken innerhalb eines Proteins durch Ausbildung intramolekularer Disulfidbrücken regelmäßig eine Stabilisierung der Konformation. Die Proteine sind hier nur als ein Sonderfall SH-funktionalisierter Polymere zu sehen. Auch synthetische Fasern, die SH-Funktionen aufweisen können mit den erfindungsgemäßen Substanzen behandelt und z.B. stabilisiert werden.

Das Keratin der Wolle und des Haares enthält bspw. über 10% Cystein, weswegen dort auch viele Disulfidbrücken vorliegen. Werden diese Disulfidbrücken aufgebrochen (bspw. durch Laugen, Licht, Erwärmung etc.), nimmt die Reißfestigkeit der Fasern stark ab. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher auch dazu eingesetzt werden, um Disulfidbrücken in Fasern (Natur- und Synthetikfasern) auszubilden. Gleiches gilt für die Behandlung von Haaren, bei denen Disulfidbrücken ebenfalls eine große Bedeutung für die Strukturfestigkeit haben. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich daher auch zur Ausbildung von Disulfidbrücken in Haaren einsetzen, wodurch auch ein kosmetischer Anwendungsbereich eröffnet wird (bspw. Shampoos, Reagenzien zur Ausbildung von Dauerwellen etc.). So lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise als Mittel zur Schließung der Disulfidbrücken im Rahmen einer Dauerwellenbehandlung einsetzen. Hierzu ist es besonders vorteilhaft, wenn zusätzlich zu der oben näher charakterisierten heterozyklischen Substanz zur Förderung der Disulfidbrückenbildung ein Oxidationsmittel oder die beschriebene Metallverbindung zugegeben wird. Es hat sich gezeigt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit dadurch deutlich beschleunigt werden kann und die Disulfidbrücken entsprechend schneller geschlossen werden. Dies hat zur Folge, dass bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei Haaren, die Einwirkzeit und somit auch die Dauer der Behandlung für den Kunden in vorteilhafter Weise verkürzt werden kann. Ein besonders geeignetes Oxidationsmittel ist oxidiertes Glutathion (GSSG). Die dadurch erzielte Verbesserung der Schließung der Disulfidbrücken in quantitativer als auch zeitlicher Hinsicht, ist anschaulich in den experimentellen Beispielen beschrieben.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen in kosmetischen Zusammensetzungen. Mit diesen kosmetischen Zusammensetzungen können entsprechend die Ausbildung von Disulfidbrücken beispielsweise bei Haaren oder Nägeln gefördert werden.

Die kosmetischen Zubereitungen können neben der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindung geeignete Lösungsmittel sowie in derartigen

Formulierungen übliche Zusätze enthalten. Zu nennen sind beispielsweise Emulgatoren und Coemulgatoren, Tenside, Ölkörper, Konservierungsmittel, Parfümöle, kosmetische

Pflege und Wirkstoffe wie AHA-Säuren, Fruchtsäuren, Ceramide, Phytantriol, Collagen,

Vitamine und Pro-Vitamine, beispielsweise Vitamin A, E und C, Retinol, Bisabolol, Panthenol, natürliche und synthetische Lichtschutzmittel, Naturstoffe, Trübungsmittel,

Mikropigmente wie Titanoxid oder Zinkoxid, Überfettungsmittel, Perlglanzwachse,

Konsistenzgeber, Verdicker, Solubilisatoren, Komplexbildner, Fette, Wachse,

Silikonverbindungen, Hydrotrope, Farbstoffe, Stabilisatoren, pH-Wert-Regulatoren,

Reflektoren, Proteine und Proteinhydrolysate, Eiweißhydrolisate, Salze, Gelbildner, Konsistenzgeber, Silikone, Feuchthaltemittel, Rückfetter und weitere übliche Additive.

Des Weiteren können zur Einstellung der jeweils gewünschten Eigenschaften Polymere enthalten sein.

Zum Schutz der Haare vor Beeinträchtigung durch UV-Strahlung können in den kosmetischen Zubereitungen auch UV-Lichtschutzmittel enthalten sein. Haarkosmetische Zubereitungen umfassen insbesondere Stylingmittel und/oder Konditioniermittel in haarkosmetischen Zubereitungen wie Haarkuren, Haarschäume, Haargele, Haarsprays, Haarlotionen, Haarspülungen, Haarshampoos, Haaremulsionen, Egalisierungsmittel für Dauerwellen, Dauerwellenpräparate, Haarfärbe- und Bleichmittel, Festigerlotions oder ähnliche Produkte. Je nach Anwendungsgebiet können die haarkosmetischen Zubereitungen als (Erosol-) Spray, (Erosol-) Schaum, Gel, Gelspray, Creme, Lotion, Milch oder Wachs appliziert werden.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Mittel um ein Produkt für das Haar, das unter den Haarwaschmitteln und Produkten für das Haar ausgewählt ist, die ausgespült oder nicht ausgespült werden und vor, während oder nach einer Haarwäsche, Färbung, Entfärbung, Dauerwelle oder Entkräuselung aufgetragen werden.

Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Behandlung von Haaren zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Haare mit dem kosmetischen Mittel, enthaltend wenigstens eine der zuvor näher erläuterten heterozyklischen Verbindung in Kontakt gebracht werden und ggf. mit Wasser gespült wird. Die heterozyklische Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt aus den oben eingehend erläuterten Verbindungen und Verbindungsklassen.

Insbesondere wird mit der vorliegenden Erfindung auch ein Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken in keratinhaltigen Strukturen zur Verfügung gestellt, bei dem die keratinhaltige Struktur mit wenigstens einer Verbindung behandelt wird, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße

Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;

(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

in welcher der Substituent A

- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6

Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.

Geeignete heterozyklische Verbindungen sind oben beschrieben und sind auch mit dem Verfahren zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen einsetzbar. Wir verweisen daher auf unsere diesbezüglichen Ausführungen. Zudem reichen bereits geringe

Mengen des Disulfidbrücken fördernden Reagenz aus, um die vorteilhafte Wirkung zu erzielen. Hier hat insbesondere das Alloxan sowie ähnlich strukturierte Verbindungen derselben Klasse (siehe oben) eine besonders gute und gleichzeitig schonende Wirkung gezeigt. Die keratinhaltigen Strukturen können bspw. Fasern, wie bspw. Haare sein, oder jedoch die Haut oder Nägel. Ferner kann eine der oben beschriebenen

Metallverbindungen eingesetzt werden, um die Reaktion noch weiter zu beschleunigen.

Sofern das Verfahren zur Verformung von keratinhaltigen Strukturen, wie insbesondere Haaren, eingesetzt wird, ist es vorteilhaft, wenn in einem ersten Schritt zunächst die bestehenden Disulfidbrücken zumindest teilweise geöffnet werden und die Haare dann in die gewünschte Form gebracht werden. Geeignete Substanzen zur Öffnung der Disulfidbrücken sind dem Fachmann bekannt und auch oben im Zusammenhang mit dem Stand der Technik beschrieben. So können insbesondere keratinreduzierende Mercaptoverbindungen, wie zum Beispiel Salze oder Ester von Mercaptocarbonsäuren, verwendet werden. Im Anschluss daran werden dann neue Disulfidbrücken nach dem erfindungsgemäßen Verfahren geknüpft. Es hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Verbindungen schonender sind als die herkömmlich eingesetzten Oxidationsmittel, wie bspw. Wasserstoffperoxid. Gemäß einer Ausführungsform weist die heterozyklische, die Ausbildung von Disulfidbrücken fördernde Verbindung folgende Grundstruktur auf:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;

- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei, Stickstoffatome aufweist;

- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt;

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;

- R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 und/oder R5 fehlen;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 fehlt.

ie heterozyklische Verbindung hat vorzugsweise folgende Substruktur:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 oder R2 und/oder R3 fehlen;

- R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder

Arylrest steht oder R4 fehlt;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.

Wie ausgeführt sind besonders vorteilhafte Vertreter dieser Gruppe das Alloxan - Monohydrat bzw. Alloxanderivate.

Ferner kann das Verfahren wie dargelegt auch zur Ausbildung von Disulfidbrücken von synthetischen Substanzen eingesetzt werden, die lediglich entsprechende SH-Gruppen tragende funktionelle Gruppe aufweisen, aber bspw. nicht aus Aminosäuren aufgebaut sind (jedoch bspw. aus einem organischen Polymer).

Gemäß einer vorteilhaften Weiterentwicklung wird die Abtrennung der die Ausbildung von Disulfidbrücken fördernden Substanz erheblich erleichtert. Gemäß dieser Idee wird ein Trägerstoff mit der Disulfidbrücken fördernden Substanz beladen. Der Trägerstoff kann bspw. ein (hydrophiles) Harz sein. Die Bindung der Substanz an den Trägerstoff hat zur Folge, dass die Abtrennung der geträgerten Substanz bspw. durch einfaches

Abfiltrieren möglich ist. Daher kann es vorteilhaft sein, in dem obigen Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken Koffein bzw. Koffeinähnliche Substanzen (siehe obige Formeln) einzusetzen, die an einen Trägerstoff gebunden sind, um die Abtrennung zu erleichtern.

Um die Anbindung der Substanz an den Trägerstoff zu ermöglichen, sind funktionelle Gruppen an der Substanz hilfreich. Daher können auch Derivate der die Disulfidbrücken ausbildenden Substanz eingesetzt werden.

Beispiele für geeignete Koffein-Derivate sind:

Theophyllin-8-Buttersäure

und

Theophyllin-7-Essigsäure

Beide Derivate fördern die Ausbildung von Disulfidbrücken und damit auch die Zyklisie- rung von Peptiden in Lösung. Bindet man diese Substanzen über ihre funktionelle Gruppe kovalent an einen geeigneten Trägerstoff, so erhält man ein immobilisiertes Reagenz, das in der Lage ist, das Schließen von Disulfidbrücken zu beschleunigen. Nach der Reaktion kann das Reagenz durch einfaches Abfiltrieren von der Reaktionslösung entfernt werden. Wie anhand dieser Verbindungen deutlich wird, ist es erfindungsgemäß auch möglich, an die verbleibenden Positionen am heterozyklischen Ring auch unabhängig von den Resten R1' bis R3' Reste, wie hier im Falle von 8-(3-Carbo- xypropyl)-1 ,3-dimethylxanthin bspw. eine funktionelle Gruppe als R5' zur Kopplung an die Trägersubstanz, anzuhängen. Die erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Substanzen sind insbesondere in Kombination mit einer erfindungsgemäßen Metallverbindung besonders geeignet zur Zyklisierung von Peptiden, insbesondere EPO mimetischen Peptiden, durch Ausbildung von intramolekularen Disulfidbrücken.

Solche Disulfidbrücken werden zwischen SH-haltigen Gruppen ausgebildet. Insbesondere natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren, die freie SH-Gruppen aufweisen, sind geeignete Disulfidbrückenbildner.

Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern, können die Substanzen der obigen Formel bspw. zur Behandlung von SH-Gruppen haltigen Substanzen und Materialien eingesetzt werden, um die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern. So lassen sich die Substanzen bspw. zur Behandlung von Haaren oder Fasern (Natur- und Synthetikfasern) einsetzten. Dies trifft insbesondere auf cysteinhaltige Fasern zu. Die erfindungsgemäß einzusetzenden heterozyklischen Verbindungen können bspw. auch in flüssigen Formulierungen (bspw. in Form von Spülungen oder Shampoos oder anderen Mitteln zur Behandlung von Haaren wie bspw. Dauerwellenreagenzien) zum Einsatz kommen. Entsprechende Zusammensetzungen enthaltend wenigstens eine erfindungsgemäße heterozyklische Verbindung werden daher ebenfalls von der Erfindung umfasst. Gemäß einer Ausführungsform weist die heterozyklische, die Ausbildung von Disulfidbrücken fördernde Verbindung folgende Grundstruktur auf:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;

- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei, Stickstoffatome aufweist;

- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt; - R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein

Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;

- R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 und/oder R5 fehlen;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 fehlt.

Vorzugsweise weist die heterozyklische Verbindung die folgende Substruktur auf:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2JnCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;

- R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt; - R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.

Wie ausgeführt sind besonders vorteilhafte Vertreter dieser Gruppe das Alloxan - Monohydrat bzw. Alloxanderivate.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der zuvor beschriebenen heterozyklischen Verbindungen bzw. Zusammensetzungen enthaltend diese heterogenen Verbindungen zur Ausbildung von Disulfidbrücken, insbesondere von intra- oder intermolekularen Disulfidbrücken in Peptiden und Proteinen sowie keratinhaltigen Strukturen. Vorzugsweise werden diese Verbindungen in Kombination mit einer erfindungsgemäßen Metallverbindung eingesetzt.

Für diese Anwendung wird ferner eine entsprechende Zusammensetzung bereitgestellt, aufweisend wenigstens eine erfindungsgemäße heterozyklische Verbindung, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, sowie vorzugsweise eine erfindungsgemäße Metallverbindung. Weitere Ausführungsformen und vorteilhafte Ausgestaltungen einer entsprechenden Zusammensetzung sind oben im Zusammenhang mit dem Verfahren erläutert worden und gelten auch für die erfindungsgemäße Zusammensetzung.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird gemäß einer Ausführungsform als kosmetische und/oder therapeutische Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen wie Haut, Haaren oder Nägeln eingesetzt.

Wie oben im Detail erläutert, kann diese Zusammensetzung im Falle von Haaren bspw. zur Haarverformung bzw. Fixierung eingesetzt werden. Zur Behandlung von Nägeln wird die Zusammensetzung vorzugsweise auf den Nagel aufgetragen, um hier die Ausbildung von Disulfidbrücken zu fördern und so den Nagel zu härten bzw. zu festigen.

Darüber hinaus wurde überraschender Weise festgestellt, dass die heterozyklischen Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung eine Haarwuchs fördernde und stabilisierende Wirkung aufweisen. Ohne auf diese Erläuterung festgelegt zu sein, wird vermutet, dass diese haarwuchsfördernde bzw. stabilisierende Wirkung der erfindungsgemäßen Substanzen ebenfalls auf die Förderung der Ausbildung der Disulfidbrücken rückführbar ist.

Bei der Bildung des Haares kommt es nämlich noch während der intradermalen Phase der Bildung des Haarschaftes zur Quervernetzung der Disulfidbrücken. Während der intradermalen Phase bestimmt das Ausmaß der Aushärtung der Keratinmasse den

Widerstand gegen den Proliferationsdruck der die Keratinmasse generierenden basalen Keratinozyten. Im Rahmen der allgemeinen Mechano-Sensitivität der Haut reagieren die basalen Keratinozyten auf Gegendruck mit stärkerer Proliferation, was stabileres Haarwachstum zur Folge hat. Ist der Gegendruck schwächer, schwächt sich auch der Nachschub an Keratinmasse ab, was einen negativen Kreislauf in Gang setzen kann. Im Extremfall kann dies zur Entstehung von schütterem Haar oder Haarausfall (Alopezie) beitragen. Dieser Mechanismus wird - als negativer Loop - deutlich, z.b. bei der sogenannten „Traction Alopecia" oder Traktions-Alopezie. Hier kommt es durch chronischen Zug am Haar unter häufig unphysiologischer Belastung (Einflechtung von Gegenständen, Zug durch Gummibänder oder Flechtstrukturen des Haares) lokal zur dauerhaften Verminderung des Gegendruckes auf die proliferierenden Keratinozytenschicht; dies führt zu einem fokalen Haarausfall.

Die Disulfidbrücken-schließenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Substanzen greifen vermutlich in dieses wachstumsregulierende Wechselspiel ein, indem sie die frühe Aushärtung des Haarschaftes fördern und damit einen besseren Gegendruck ermöglichen, was das Haarwachstum fördert. Daher ist die Behandlung des Haares und der von außen leicht erreichbaren intradermalen Abschnitte des Haares mit den erfindungsgemäßen Substanzen - auch ohne dass bereits die Absicht der Verformung wie zuvor beschrieben besteht - dazu geeignet, dem vorzeitigen Haarausfall vorzubeugen bzw. ihn zu minimieren. Die erfindungsgemäßen Substanzen besitzen auf dem Wege der stabilen Disulfidquervernetzung auch eine den Haarwuchs fördernde und stabilisierende Wirkung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher in geeigneten externen kosmetischen oder therapeutischen Zubereitungen eingesetzt werden, um dem Haarausfall, z.b. der sogenannten androgenetischen Alopezie, entgegenzuwirken bzw. das Haarwachstum zu fördern und zu stabilisieren.

Ferner kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch auf die Haut aufgetragen werden, um die Ausbildung von Disulfidbrücken in den keratinhaltigen Hautschichten zu fördern. Dies ist insbesondere vorteilhaft zur Behandlung von Hautkrankheiten oder Symptomen von Hautkrankheiten, die mit einer Schwächung der Keratinstruktur einhergehen, wie bspw. die Hypokeratose oder die Epidermolyse.

Augrund der katalytischen Wirkung der erfindungsgemäß charakterisierten heterozyklischen Verbindungen auf die Ausbildung von Disulfidbrücken können diese bspw. auch zur Katalyse bei der Ausbildung von inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken zur Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken eingesetzt werden. Sie können daher zur Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen synthetischen oder natürlichen oder modifizierten natürlichen Molekülen dienen. Sie können daher bei der Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken für die Wirkstoffsuche Anwendung finden. Bei dynamischen kombinatorischen Bibliotheken werden die einzelnen Einheiten oftmals über Disulfidbrücken zu Makromolekülen vernetzt (siehe Fig. 15). Einzelheiten zu den Bibliotheken sind bspw. in "Dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides in water. S. Otto, R. L. E. Furlan and J. K. M. Sanders, J. Amer. Chem. Soc, 2000, 122, 12063-12064"; „Selection and amplification of hosts from dynamic combinatorial libraries of macrocyclic disulfides. S. Otto, R. L. E. Furlan and J. K. M. Sanders, Science, 2002, 297, 590-593"; "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries. Ramström, Lehn. Nat Rev Drug Discov. 2002" und WO01 /64605 beschrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll nachfolgend anhand einiger Beispiele verdeutlicht werden. Als Beispiele für die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisierbaren Peptide wurden EPO mimetische Peptide und Oxytocin gewählt.

Fig. 1

Gezeigt ist der Reaktionsverlauf der Zyklisierung eines EPO-mimetischen Peptids der folgenden Sequenz

GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am (BB57)

(0,7 mg/ml) zu dem entsprechenden zyklisierten Produkt in Anwesenheit von Koffein (0,3 mg/ml) mit Luft in Wasser bei Raumtemperatur. Wie die Kurve deutlich zeigt, nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit im Laufe der Reaktion zu, was einen autokatalytischen Mechanismus der Reaktion nahe legt. Die Abkürzung Am steht allgemein für eine Amidierung.

Fig. 2 Gezeigt ist die Zyklisierung desselben Peptids wie in Fig. 1 (0,7 mg/ml) zu seiner zyklisierten Form in Abwesenheit von Koffein. Wie deutlich erkennbar ist, ist die Reaktionsgeschwindigkeit erheblich herabgesetzt.

Im Falle von EPO-mimetischen Peptiden hat sich eine optimale Konzentration von Koffein in einem Bereich von 0,075 bis 0,15 mg/ml ergeben. Der Umsatz ist bereits nach zehn Stunden quantitativ.

Fig. 3

Dargestellt ist die Abhängigkeit der Geschwindigkeit der Umsetzung des in Fig. 1 ge- zeigten EPO-mimetischen Peptids von der Koffeinkonzentration. Wie dargestellt, sind sehr gute Ergebnisse in einem Konzentrationsbereich von 0,03 mg/ml bis 0,3 mg/ml erzielbar. Die optimalen Werte liegen in einem Bereich von 0,06 mg/ml bzw. 0.075 und 0,15 mg/ml. Fig. 4

Dargestellt ist die Abhängigkeit der Zyklisierungsgeschwindigkeit vom pH-Wert. Wie deutlich erkennbar ist, ist der autokatalytische Verlauf der Reaktion nicht auf eine Änderung des pH-Werts zurückzuführen, da dieser Effekt auch in den dargestellten gepuf- ferten Lösungen (Phosphatpuffer, pH 6 bis 9) auftritt. Jedoch hat sich gezeigt, dass die Ausbeute an zyklisierten Peptid bei höheren pH-Werten sinkt. Ferner hat sich überraschender gezeigt, dass die Reaktion schneller verläuft, je niedriger der pH-Wert der Lösung ist. Daher ist ein niedrigerer pH-Wert von unter 7 und vorzugsweise < = 6,5 bevorzugt.

Fig. 5

Dargestellt ist der Einfluss des milden Oxidationsmittels Glutathion (oxidierte Form) auf die Reaktionsgeschwindigkeit. Hier fand die Umsetzung des in Fig. 1 dargestellten Peptids (0,7 mg/ml H2O) in Anwesenheit von 0,1 mg/ml (0,5 Äquivalente) Glutathion, oxidierte Form (GSSG) und Koffein (0,3 mg/ml) statt. Innerhalb von fünf bis sechs Stunden war die Reaktion bereits vollendet. Die Umsetzung des Peptids nur mit GSSG (in Abwesenheit von Koffein) erfolgt nur langsam. Ferner hat sich gezeigt, dass unerwünschte Nebenprodukte entstehen (s. Abb. 6).

Fig. 6

Dargestellt sind Chromatogramme, die jeweils nach einer Stunde Reaktion aufgezeichnet wurden und die die Umsetzung des eingesetzten EPO-mimetischen Peptids mit 0,5 äquivalenten GSSG belegen.

Fig. 7

Dargestellt ist eine tabellarische Übersicht, die das erfindungsgemäße Verfahren mit den im Stand der Technik bekannten Methoden vergleicht. Die getesteten Peptide wiesen folgende Sequenz auf: EMP1 : Ac-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-Am APG1 : Ac-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am APG2: Ac-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQRG-Am

Die in wϊro-Experimente zeigten eine vergleichbare Aktivität der Peptide, die nach den verschiedenen Methoden zyklisiert wurden. Die erfindungsgemäße Methode zeichnet sich jedoch durch bessere Ausbeuten sowie Reinheiten im Verhältnis zu den anderen getesteten Zyklisierungsmethoden aus, wie Fig. 7 anschaulich belegt. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass das eingesetzte Zyklisie- rungsreagenz auf einfache Weise durch HPLC abgetrennt werden kann. Weitere Beispiele von nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zyklisierten EPO-mi- metischen Peptiden sind nachfolgend aufgeführt:

Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLT-Nal1-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Nal1-VCKKQRG-Am (APG3) Ac-C(Mob)-GGTYSCHFGKLT-Nal1-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-Nal1-VCKKQRG-Am (APG4)

Ac-C(tBu)-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am (APG5) (Sama)-GGTYSCHFGKLT-Nai -VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-NaI -VCKKQRG-Am (APG6)

Fig. 8 Gezeigt ist die Zyklisierung von dimeren EPO mimetischen Peptiden. Die Zyklisierung von di- oder multimeren Peptiden erfolgt vorzugsweise in mehreren Schritten. Fig. 8 zeigt das Syntheseschema anhand eines bivalenten (dimeren) EPO-mimetischen Peptids, das in 2 Schritten durch Ausbildung von zwei intramolekularen Disulfidbrücken zyklisiert wird. Nach diesem Verfahren wird die erste Disulfidbrücke nach dem erfin- dungsgemäßen Verfahren ausgebildet. Die zweite intramolekulare Disulfidbrücke wurde unter Einsatz einer optimierten lod-Oxidation durchgeführt. Zur Kupplung der Peptide an einen polymeren Carrier wurden ferner teilweise weitere Cystein-Reste ins Molekül eingebracht. Dieses Cystein wurde durch geeignete Schutzgruppen tBu or Mob) geschützt.

Die erste erfindungsgemäße Zyklisierung unter Einsatz von Koffein wird vorzugsweise bei pH 6 durchgeführt, während die zweite Zyklisierung gemäß dem gezeigten Beispiel in 80% Essigsäure erfolgte. Die Ausbeute der Synthese lag typischer Weise zwischen 60 und 90%.

Fig. 9

Einige der EPO mimetischen Peptide lassen sich nur sehr schwer zyklisieren. Ein Beispiel dafür ist das folgende Peptid:

Ac - GGTYSCHFG- Har- LT- l -Nal -VCK-Aad-Q-Aad- G-NH2

Har=Homoarginin

Aad = 2-Aminoadipinsäure, "Homoglutaminsäure" NaI: Naphtylalanin

Bei dieser Sequenz hat sich gezeigt, dass die Erhöhung der Konzentration an Zyklisie- rungsreagenz von Vorteil ist. So war die Zyklisierung mit 10mg/ml Koffein innerhalb von 24h erfolgreich. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Die Ausbeute lag nach ca. 21 h in Lösung bereits bei > 90%. Fig. 10 bis 12

Neben EPO mimetischen Peptiden wurde auch ein von Oxytocin abgeleitetes, reduziertes Peptid mit Koffein bzw. der Koffein-ähnlichen Substanz (siehe obige Formel) zyklisiert.

Bei der Reaktionsdurchführung wurde Oxytocin, reduziert (OyxR), Rohprodukt, in Wasser (bzw. H2O/ACN/TFA) gelöst und mit verschiedenen Konzentrationen von Koffein (und evtl. GSSG) an der Luft stehen gelassen. Der Reaktionsansatz wurde per HPLC in regelmäßigen Abständen vermessen, um die Gehalte an OxyR und dem Produkt Oxytocin (Oxy) zu bestimmen.

Die in Fig. 10 bis 12 gezeigten Tabellen und die dazugehörige Graphik geben eine zusammenfassende Übersicht über die Ergebnisse.

Erkennbar ist, dass die Produktausbeute mit der Peptidkonzentration korreliert. Geringere Peptidmengen führen bei Oxytocin zu besseren Ergebnissen.

Die Reaktionszeit bis zum vollständigen Umsatz von OxyR korreliert mit der Konzentra- tion an Koffein in der Reaktionslösung. Bis zu einer Konzentration von 0.5mg/ml Koffein gilt je mehr Koffein, desto schneller läuft die Oxidation ab. Die Peptidkonzentration hat nur einen untergeordneten Einfluss auf die Dauer der Reaktion.

GSSG scheint keinen Einfluss auf Geschwindigkeit oder Ausbeute zu haben.

OxyR, HPLC gereinigt, cyclisiert schon spontan „recht" schnell. Die Reaktionsgeschwindigkeit lässt sich mit Koffein jedoch nochmals deutlich verkürzen. Geringe Mengen ACN/TFA haben geringen Einfluss auf die Ausbeute, die Reaktionszeit wird etwas verlängert.

Fig. 13 und 14

Gezeigt sind die Ergebnisse der Zyklisierung des Peptids BB57 mit der Substanz Minoxidil:

Dazu wurden 0,7mg BB57 und 0,3mg Minoxidil (6-(1-Piperidinyl)-2,4-pyrimidindiamin 3- oxid, Minox) in 1ml destilliertem Wasser gelöst und an der Luft stehen gelassen. Der Umsatz von BB57 zu oxidiertem BB57C wurde mit HPLC (UV-Detektion bei 216nm) beobachtet. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 gezeigt.

Wie Fig. 13 zeigt, ist die Oxidation in Anwesenheit von Minoxidil nach ca. 29h abge- schlössen (bei einer Vergleichsmessung mit Koffein sind es ca. 24h). Minoxidil hat als weiterer Vertreter der erfindungsgemäßen heterozyklischen Verbindungen daher ebenfalls eine positive Wirkung auf die Ausbildung von Disulfidbrücken. Die Ausbeute in Lösung der Minoxidil-katalysierten Reaktion liegt über 95%. Daß es sich bei der Reaktion um eine katalytisch ablaufende Reaktion handelt, zeigt sich dadurch, daß die Konzentration von Minoxidil bei der Reaktion praktisch nicht abnimmt (Abnahme ≤ 2% bei 4.4 eq Minoxidil bezogen auf BB57, siehe Fig. 14).

Fig. 15

Gezeigt sind mögliche Verknüpfungsstrategien über Disulfidbrücken zur Erzeugung vernetzter Makromoleküle. Derartige Bausteine finden oft in dynamischen kombinatorischen Bibliotheken Anwendung.

Fig. 16

Ferner wurden Versuche durchgeführt, um zu demonstrieren, dass Haare, welche zuvor im Sinne einer Dauerwellenbehandlung reduziert wurden, sich mit einer Kombination der erfindungsgemäßen Substanz (hier Koffein) und einem zusätzlichen

Oxidationsmittel (hier oxidiertes Glutathion-GSSG) in Anwesenheit von Luft beschleunigt oxidativ schließen. Damit lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren in vorteilhafter Weise auch im kosmetischen Bereich und insbesondere im Friseurbereich zur Behandlung von Haaren anwenden.

Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt:

Je 5-6 mg Haare werden mit 400μl einer 10%gen Lösung einer Ammoniumthioglykolat- haltigen „Well-Lotion" (Produkt „Poly Lock - starke Dauerwelle", Schwarzkopf & Henkel,

Germany) 0,5h bei Raumtemperatur behandelt. Die Lösung wird entfernt und das Haar anschließend 6mal mit je 400μl H2O gewaschen. Je eine dieser so behandelten

Haarproben wird a) in H2O, bzw. einer wässrigen Lösung von b) 10mg/ml Koffein, c)

5mg/ml GSSG in H2O und d) 10mg/ml Koffein und 5mg/ml GSSG bei Raumtemperatur über 3 Tage behandelt.

Zur Bestimmung der freien, noch verbliebenen Thiolgruppen werden die Haare nach Abtrennung der Reaktionslösung mit Ellmansreagenz (5,5'-Dithiobis(2- nitrobenzoesäure), DTNB) umgesetzt. Als zusätzliche Referenzproben dienen unbehandeltes Haar sowie reduziertes Haar, welches ansonsten keiner weiteren Behandlung unterworfen wurde. Die Haarproben werden dazu mit je 200μl eines 10OmM Phosphatpuffers, pH 8.0 und 1mM EDTA, und 300 μl einer 1 mM DTNB-Lösung in demselben EDTA-haltigen Puffer gegeben. Die Lösung wird nach einigen Minuten in einem UV-Vis-Spektrometer vermessen.

Die UV-Vis-Spektren der Proben zeigen, dass die Reduktion der Haare durch die Behandlung mit der Ammoniumthiolglykolathaltigen „Well-Lotion" erfolgreich war (siehe Abb. 29, Kurven e und f, die einmal unbehandelte und einmal reduzierte Haare zeigen). Dies kann man daran erkennen, dass die Bande bei 412nm - ein Maß für die Zahl freier Thiolgruppen - am größten ist. Eine Behandlung in Anwesenheit von Luft mit a) H2O, b), mit einer koffeinhaltigen Lösung, c) der GSSG-haltigen Lösung führt jeweils nur zu einer teilweisen Oxidation der Thiolgruppen. Jedoch lässt sich bereits hier erkennen, dass das Koffein einen positiven Einfluss auf die Schließung der Disulfidbrücken hat. Die Kombination d) aus Koffein und dem Oxidationsmittel GSSG führte jedoch zu einer nahezu quantitativen Oxidation der Thiolgruppen bei Haaren. Dieser Versuch belegt daher, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Schließung von Disulfidbrücken auch erfolgreich an Haaren eingesetzt werden kann.

Fig. 17 bis 39

Gezeigt sind die Ergebnisse der Zyklisierung des Referenzpeptids BB57 mit verschiedenen Substanzen, die erfindungsgemäß die Ausbildung von Disulfidbrücken fördern können.

Die Versuche wurden wie zuvor dargelegt durchgeführt (siehe oben). Die getestete Substanz sowie die getesteten Mengen sind jeweils angegeben.

Die nachfolgenden Fig. 40 bis 59 belegen den verstärkenden Effekt des metallhaltigen Zusatzes. Die Aktivitäten der Zusatzstoffe wurden wiederum anhand der Zyklisierung der folgenden Beispielsubstanz BB57, eines Epo-mimetischen Peptides, welches 2 freie Cysteine enthält

GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-Am untersucht.

Dabei wurde die Ausbildung einer Disulfidbrücke verfolgt. Der Reaktionsverlauf wurde mit zwei unterschiedlichen Methoden verfolgt. Im Falle einer längeren Reaktionsdauer über mindestens 3 Stunden mittels RP-HPLC oder im Falle schnellerer Reaktionenzeit über den so genannten Ellmans-Test (Monitoren der freien Cysteine im Edukt) mittels UV/VIS-Spektroskopie. Als Referenz ist jeweils der Reaktionsverlauf der Katalyse mit der Substanz Koffein abgebildet. Dazu wurden 0,7mg/ml BB57 mit 0,3mg/ml Koffein versetzt und die Abnahme an Edukt sowie die Zunahme an Produkt mittels HPLC verfolgt.

Fig. 40 zeigt die Oxidation von BB57 zu BB57C mittels Koffein. Ein vollständiger Umsatz erfolgte nach ca. 15h. Diese Reaktion kann überraschenderweise durch die Kombination mit Eisen(ll)salzen noch weiter beschleunigt werden. Bei geringer Zugabe von Eisen(ll)sulfat (3μM) verkürzte sich die Reaktionszeit bis zum vollständigen Umsatz auf etwa 10h. Die Ergebnisse sind in Fig. 41 gezeigt. Es traten direkt zu Beginn im HPLC Chromatogramm Intermediate auf, die sich jedoch im weiteren Reaktionsverlauf in das Produkt umwandelten.

Durch Zugabe von einer leicht größeren Menge (30μM) Metallsalz zu einer Lösung aus 0,7mg/ml Peptid und 0,3mg/ml Koffein konnte die Beschleunigung noch weiter verstärkt werden. In den folgenden Beispielen sind die Effekt der Metallionen aus Eisen(ll)sulfat, Eisen(lll)chlorid und Cu(ll)sulfat zu sehen.

Fig. 42 zeigt die Oxidation von BB57 zu BB57C mittels Koffein und der Zugabe von Eisen(ll)ionen (30μM). Das Monitoring erfolgte mittels des Ellmans-Tests. Die Cyclisierungszeit durch Koffein wird mit Eisen(ll) auf etwa eine Stunde verkürzt.

Fig. 43 zeigt die Oxidation von BB57 zu BB57C mittels Koffein und der Zugabe von verschiedenen Eisen(lll)ionen (30μM). Das Monitoring erfolgte wieder mittels des Ellmans-Tests. Die Cyclisierungszeit durch Koffein wird auch mit Eisen(lll)-salzen auf etwa eine Stunde verkürzt.

Fig. 44 zeigt Oxidation von BB57 zu BB57C mittels Koffein und der Zugabe von Kupfer(ll)ionen (30μM). Das Monitoring erfolgte wieder mittels des Ellmans-Tests. Die Cyclisierungszeit wird auch durch die Zugabe von Kupfersalzen verkürzt.

Fig. 45 zeigt die Oxidation von BB57 mit und ohne Fe(ll)salz, Eisen(ll)sulfat (3μM), verfolgt mittels des Ellmans-Tests. Das Steigerungspotential wird hier durch das Beispiel mit der Substanz Alloxan-monohydrat noch weiter verdeutlicht. Mit Alloxan (5μg/ml) werden 0,66mg/ml BB57 innerhalb von etwa 2h nahezu vollständig cyclisiert. Durch die Zugabe von Eisen(ll)ionen in Form von Eisen(ll)sulfat (3μM) kann diese Reaktionszeit auf unter eine Stunde verkürzt werden.

Eine Vergleichsmessung alleine mit Eisen(ll)sulfat (30μM) ergab keinerlei Aktivität hinsichtlich einer beschleunigenden Wirkung auf die Cyclisierung von BB57. Nur die Kombination der hetrocyclischen Substanzen mit den Metallionen ergibt den beschriebenen Beschleunigungseffekt. Die diesbezüglichen Ergebnisse sind in Fig. 46 gezeigt.

Fig. 47 zeigt die Beschleunigung der Oxidation von BB57 mit Alloxan und der Zugabe von Eisen(lll)ionen (30μM). Das Monitoring erfolgte mittels Ellmans-Test. Wie auch zuvor bei Koffein gezeigt, wird durch Eisen(lll)ionen auch ein Beschleunigungseffekt in Kombination mit Alloxan vermessen.

Wenn die Reaktion nicht wie bei allen anderen beschriebenen Beispielen in deionisiertem Wasser, sondern in Leitungswasser durchgeführt wird, kommt es zu einem ähnlichen Beschleunigungseffekt. Es reichen folglich also Spuren von Ionen aus, um diese zusätzliche Beschleunigung zu erzielen, sofern die lonenkonzentration im Wasser ausreichend hoch ist (Trinkwasseranalytik gemäß Firma Enwor, Kreis Aachen). Die Ergebnisse der Beschleunigung der Oxidation von BB57 mit Alloxan in Leitungswasser sind in Fig. 48 gezeigt. Das Monitoring erfolgte mittels des Ellmans- Tests.

Auch die Ionen weiterer Übergangsmetalle zeigen einen verstärkenden Effekt. In den nachfolgenden Beispielen wurden die Effekte der Salze Kupfer(ll)sulfat, Chrom(lll)chlorid, Mangan(ll)sulfat, Kobalt(ll)chlorid, Nickel(ll)chlorid, Zink(ll)sulfat, Magnesium(ll)sulfat und Calcium(ll)chlorid auf die Beschleunigung der Oxidation von BB57 durch Alloxan, bzw. Koffein verfolgt. Ein besonders starker Effekt ist bei den Eisen(ll)- und Eisen(lll)-salzen zu beobachten.

Fig. 49 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Kobalt(ll)chlorid. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.

Fig. 50 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Nickel(ll)chlorid. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.

Fig. 51 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Zink(ll)sulfat. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.

Fig. 52 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Mangan(ll)sulfat. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.

Fig. 53 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Chrom(lll)chlorid. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz. Fig. 54 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Calcium(ll)chlorid. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.

Fig. 55 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und dem Metallionen von Magnesium(ll)chlorid. Monitoring über Ellmans Reagenz.

Fig. 56 zeigt die Oxidation von BB57 durch Alloxan und der Metallionen von Silber(l)nitrat. Monitoring über Ellmans Reagenz.

Stabile Metallionenkomplexe haben ebenfalls eine beschleunigende Wirkung, wie am Beispiel von Kaliumhexacyanoferrat in den folgenden beiden Beispielen gezeigt werden konnte.

Fig. 57 und 58 zeigen die Cyclisierung von BB57 mit Alloxan sowie Alloxan in Kombination mit Kaliumhexacyanoferrat(ll) oder Kaliumhexacyanoferrat(lll) (30μM). Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.

Durch die Zugabe von Ethylendiamintetraacetat, EDTA, als Komplexbildner wird der starke Effekt der Eisenionen leicht abgeschwächt. Dennoch verbleibt ein starker Beschleunigungseffekt. Fig. 59 zeigt die Cyclisierung von BB57 mit Alloxan in Kombination mit Eisenionen (3μM) mit und ohne 2 Äquivalenten EDTA. Das Monitoring erfolgte über das Ellmans Reagenz.

In Versuchen an menschlichen Haaren wurden ferner die oxidativen Eigenschaften der vorgestellten Kombinationen aus heterocylischen Verbindungen, am Beispiel von

Koffein und Alloxan, mit Eisenionen gezielt untersucht. Dazu wurden für jeden

Messpunkt bei 5mg Haaren zuerst die Disulfidbrücken mit Ammoniumthioglykolat/

Ammoniumthiolactat (handelsübliche Formulierung für Dauerwellen) reduziert, um diese zu öffnen. Anschließend wird die Reduktionslösung entfernt und die Haare wurden mehrfach mit Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Haare den verschiedenen

Oxidationsmischungen ausgesetzt, um die Disulfidbrücken erneut zu schließen. Nach

Abfiltrierung dieser Lösungen wurde der Gehalt an Thiolgruppen mittels des Ellmans-

Reagenz bestimmt. Dadurch kann eine Aussage über die Geschwindigkeit und Effizient des Oxidationsschrittes und damit der erneuten Schließung der Disulfidbrücken getroffen werden.

Anhand der anfolgenden Beispiele wurde die besondere Effektivität der heterocyclischen Reaktionsbeschleuniger in Kombination mit der erfindungsgemässen metallhaltigen Verbindung gezeigt. In einigen Versuchen werden anstelle größerer Mengen einer einzelnen Salzkomponente, auch Kombinationen verschiedener Metallzusätze verwendet. Die Gehalte in der nachfolgend beschriebenen Mischung „künstliches Trinkwasser" basiert auf den Maximalwerten aus der Trinkwasserverordnung der BRD, wobei die folgende Kombination von Metallionen verwendet wurde: 0,2mg/L Eisen (Fe3+), 5mg/L Zink (Zn2+), 2mg/L Kupfer (Cu2+) und einigen Härtekomponenten 100mg/L Calcium (Ca2+) und 50mg/L Magnesium (Mg2+).

Fig. 60 zeigt die Oxidation von Haaren mit Koffein, Koffein mit Eisen(lll)chlorid und Koffein mit der zuvor beschriebenen Mischung „künstliches Trinkwasser". Bei dem gegenüber Alloxan schwächeren Katalysator Koffein ist der Einfluss der Salzzugabe auf die Reaktion innerhalb der ersten 10 Minuten zu sehen.

Fig. 61 zeigt die Oxidation von Haaren mit Alloxan, Alloxan mit Eisen(lll)chlorid und Alloxan mit der zuvor beschriebenen Mischung „künstliches Trinkwasser". Bei der Oxidation mit Alloxan und den Zusätzen Eisen(lll)clorid und künstlichem Trinkwasser ist bei der Kontrolle nach 10 Minuten ein geringerer Vorteil durch die Salzzugaben zu sehen, was die außerordentlichen Eigenschaften des Alloxans auf keratinhaltige Strukturen belegt.

Fig. 62 zeigt die Oxidation von reduziertem Haar mit Koffein bzw. Alloxan jeweils in Kombination mit einer Mischung aus Salzen, die dem maximalen Gehalt in Trinkwasser entsprechen. Der Monitoring-Vergleich von Koffein und Alloxan an Haaren zeigt, dass beiden Reagentien in Kombination mit künstlichem Trinkwasser das Haar vollständig oxidieren, allerdings braucht die Reaktion mit Koffein länger.

Fig. 63 zeigt die Oxidation von reduziertem Haar mit verschiedenen Mengen Alloxan in Kombination mit unterschiedlichen Mengen an Eisen(lll)ionen. Das Monitoring erfolgte mittels des Ellmans-Reagenz. Dieses Beispiel mit unterschiedlichen Mengen Alloxan und Eisen(lll)chlorid zeigt, dass geringe Mengen Alloxan, eine 0,1%ige Lösung in Kombination mit geringen Mengen Eisenionen ausreicht, um nach 10 Minuten eine nahezu vollständige Rückoxidation der Thiole im Haar zu erreichen. Diese geringen Mengen sind besonders vorteilhaft, da dadurch die Struktur des Haares wenig belastet wird. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher schonender als herkömmliche Verfahren, die bspw. auf Basis von Wasserstoffperoxid arbeiten.

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem Medium durchgeführt wird, das wenigstens eine

Verbindung enthält, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

(a) eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem

Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;

(b) eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

in welcher der Substituent A für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.

2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine

Metallverbindung zugegeben wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Metallverbindung eine Metallionen freisetzende oder enthaltende Verbindung ist, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe von Metallsalzen, Metallsalzkomplexen und löslichen Metallverbindungen.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallverbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der Kupfer(ll)salze, Chrom(lll)salze, Mangan(ll)salze, Kobalt(ll)salze, Nickel(ll)salze, Zink(ll)salze, Magnesium(ll)salze, Calcium(ll)salze sowie Eisen(ll)- und Eisen(lll)salze.

5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung gemäß Alternative (a) folgende Grundstruktur aufweist

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;

- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei Stickstoffatome aufweist;

- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe

(=0) darstellt;

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich

Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine

Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, R5 zusammen mit R6 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt oder R4 und/oder R5 fehlen;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 zusammen mit R5 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere

Substituenten trägt, oder R6 fehlt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgende Substruktur enthält

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R2 zusammen mit R3 einen fünf- oder sechsgliedrigen Ring darstellt, der ebenfalls Heteroatome aufweisen kann und optional weitere Substituenten trägt, oder R2 und/oder R3 fehlen; - R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Uracilderivat der folgenden allgemeinen Formel darstellt:

wobei R4 und R6 unabhängig voneinander für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest stehen, vorzugsweise für Wasserstoff oder einen verzweigten oder unverzweigten C1 bis C10 Alkylrest, besonders bevorzugt für einen C1 bis C4 Alkylrest oder Wasserstoff stehen.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Verbindung um Purinderivate handelt, deren Grundgerüst der folgenden allgemeinen Formel entspricht

in der der Fünfring ungesättigt ist und entsprechend Doppelbindungen aufweist und in welcher die Substituenten

R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten d- bis Cio-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substitu- ierten C6- oder C10-Arylrest; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenen- falls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3-Alkylrest stehen;

R7, R8 und R9, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl oder eine funktionelle Gruppe stehen; vorzugsweise Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C10-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder Cio-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C8-Alkyl; besonders bevorzugt Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)n-COOX mit n = 1 bis 6 und X gleich

Wasserstoff oder C1- bis C6-Alkyl; insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Rest -{CH2)n-COOX mit n = 1 bis 4 und X gleich Wasserstoff oder C1- bis C3-Alkyl, stehen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass R2 und R3 zusammen einen Sechsring bilden, der optional wenigstens ein Heteroatom aufweist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung folgende Grundstruktur aufweist:

wobei die Ringe je nach Wahl der Substituenten ungesättigt sein und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen tragen können,

R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O) darstellt; R4 und R6, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten C1- bis Cio-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-

Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Cr bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten C1 bis C3-Alkylrest stehen;

R5 für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) steht oder R5 fehlt;

R10 und R13, jeweils unabhängig voneinander, für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten Arylrest stehen oder R10 und/oder R13 fehlen; vorzugsweise für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten verzweigten oder unverzweigten C1- bis C10-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-Arylrest stehen; besonders bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten C1- bis C6-Alkylrest oder einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest; insbesondere für Wasserstoff oder einen mit wenigstens einer Hydroxylgruppe substituierten C1 bis C6-

Alkylrest stehen;

R11 und R12, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie eine

Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=O), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R11 und R12 bilden zusammen einen fünf oder sechsgliedrigen Ring aus, der optional weitere Heteroatome sowie Substituenten tragen kann.

11. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung gemäß Alternative (b) einen Substituenten A aufweist, der

- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituiertes C1- bis C10-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6- oder C10-Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4

Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto;

bevorzugt für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Cr bis C6-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten C6-Arylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie

Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto;

insbesondere Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Ci bis C3- Alkylrest oder gesättigtes Heterocyclyl mit 5 oder 6 Ringgliedern und 1 Heteroatom, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert ist;

steht.

12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch ge- kennzeichnet, dass die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-Methyl-2-Pyridon, 2,6-Dihydroxy-pyridin-Hydrochlorid, Uracil-6- carbonsäure, 2,4-Dihydroxy-6-methylpyrimidin, 2,4-Dimethyl-6-hydroxypyrimidin, 2-lsopropyl-6-methyl-4-pyrimidinol, 4,6-Dihydroxy-2-methylpyrimidin, 4,6- Dihydroxypyrimidin, 1 ,2-Dihydro-3,6-pyridazindion, 7-Hydroxy-5- methyl[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pyrimidin, Barbitursäure, Alloxan-Monohydrat,

Alloxanderivate und Violursäure, Uracil, 1-Methyl-Uracil, 3-Methylxanthin, Theobromin, Theophyllin, Koffein, Isokoffein, Xanthin, Theophyllin-7- Essigsäure, Theophyllin-8-Buttersäure, 3-lsobutyl-1-Methylxanthin, 1 ,2,3- Benzotriazin-4(3H)-on, (-)-Riboflavin, Lumazin, Alloxazin, Minoxidil und Aminexil.

13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine intramolekulare Disulfidbrücke in aminosäurehaltigen Substanzen, insbesondere in Peptiden, Proteinen oder keratinhaltigen Strukturen, ausgebildet wird, wobei die Reaktion in einem wässrigen Medium durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine intramolekulare Disulfidbrücken zwischen zwei Aminosäuren ausgebildet wird, die eine SH-Gruppe aufweisen, vorzugsweise zwischen zwei Cysteinresten.

15. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsgemisch ein Oxidationsmittel, vorzugsweise Glutathion in oxidierter Form, zugegeben wird.

16. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide eine Länge zwischen 5 und 100, 5 und 50 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 10 und 40, besonders bevorzugt zwischen 15 und 25 Aminosäuren, aufweisen.

17. Verwendung wenigstens einer heterozyklischen Verbindung wie in einem oder mehreren der Ansprüche 1 sowie 5 bis 12 definiert zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die heterozyklische Verbindung zur Zyklisierung von Peptiden und/oder Proteinen eingesetzt wird, wobei die Peptide vorzugsweise eine Länge zwischen 5 und 250, 5 und 100, 5 und 50, vorzugsweise 10 bis 40, besonders bevorzugt zwischen 15 und 25 Aminosäuren, aufweisen.

19. Verwendung nach Anspruch 17 oder 18 in Kombination mit einer Metallverbindung wie sie in einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist.

20. Verwendung nach einem oder mehren der Ansprüche 17 bis 19 zur Ausbildung einer intramolekularen Disulfidbrücke zwischen wenigstens zwei SH-Gruppen tragenden Aminosäuren.

21. Verwendung nach einem oder mehreren der Ansprüche 17 bis 20 zur Behand- lung von SH-Gruppen tragenden Substanzen, Strukturen und Produkten zur

Ausbildung von Disulfidbrücken.

22. Verwendung nach Anspruch 21 zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen wie Haut, Nägeln, Haaren und Fasern, insbesondere cysteinhaltigen Fasern.

23. Verwendung einer heterozyklischen Verbindung wie in einem der Ansprüche 1 sowie 5 bis 12 definiert, zur Katalyse bei der Ausbildung von inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken zur Herstellung dynamischer kombinatorischer Bibliotheken.

24. Verfahren zur Ausbildung von Disulfidbrücken in keratinhaltigen Strukturen, wobei die keratinhaltige Struktur mit wenigstens einer Verbindung in Kontakt gebracht wird, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

a. eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;

b. eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

in welcher der Substituent A

- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6

Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Metallverbindung eingesetzt wird, wie sie in den Ansprüchen 2 bis 4 definiert ist.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine heterozyklische Verbindung wie sie in einem oder mehreren der Ansprüche 5 bis 12 definiert ist, eingesetzt wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26 zur Behandlung von Haaren, aufweisend die folgenden Schritte:

Öffnung der bestehenden Disulfidbrücken Optional Spülen der Haare Formgebung der Haare - Ausbildung neuer Disulfidbrücken durch Einsatz wenigstens einer heterozyklischen Verbindung, wie sie in wenigstens einem der Ansprüche 1 sowie 5 bis 12 definiert ist; Optional Spülen der Haare.

28. Zusammensetzung, enthaltend wenigstens eine Verbindung, die die Ausbildung von Disulfidbrücken fördert, wobei diese Verbindung aus folgender Gruppe ausgewählt ist:

a. eine Verbindung, die in ihrer Struktur einen gesättigten oder ungesättigten sechsgliedrigen Heterozyklus mit wenigstens einem

Stickstoffatom aufweist, wobei dieser Heterozyklus am zum Stickstoffatom benachbarten Kohlenstoffatom wenigstens eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) aufweist, wobei im Falle des Vorhandenseins einer Hydroxygruppe der Heterozyklus ungesättigt ist;

b. eine Verbindung der folgenden allgemeinen Formel

in welcher der Substituent A

- für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Arylrest oder ein gesättigtes oder ungesättigtes Heterocyclyl mit 3 bis 10 Ringgliedern und 1 bis 3 Heteroatomen, wie

Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel, steht, wobei das Heterocyclyl unsubstituiert oder einfach oder mehrfach substituiert ist durch Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Cyano, Nitro, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und/oder Mercapto steht.

29. Zusammensetzung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Metallverbindung aufweist, wie sie in einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist.

30. Zusammensetzung gemäß Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine heterozyklische Verbindung aufweist, wie sie in den Ansprüchen 5 bis 12 definiert ist.

31. Zusammensetzung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die heterozyklische Verbindung folgende Grundstruktur aufweist:

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der Substituenten R1 bis R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann;

- V, W, X, Y und Z entweder Kohlenstoffatome oder Stickstoffatome darstellen, wobei der Heterozyklus insgesamt nicht mehr als drei, vorzugsweise zwei,

Stickstoffatome aufweist;

- R1 entweder eine Hydroxygruppe oder eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0) darstellt; - R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein

Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;

- R4 und R5, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), eine Carboxygruppe, -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen oder R4 und/oder R5 fehlen;

- R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht, oder R6 fehlt.

32. Zusammensetzung nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die heterozyklische Verbindung folgende Substruktur enthält

wobei der Heterozyklus je nach Wahl der der Substituenten R2, R3, R4 und R6 gesättigt oder ungesättigt ist und entsprechend ein oder mehrere Doppelbindungen aufweisen kann; wobei

- R2 und R3, jeweils unabhängig voneinander für Wasserstoff, einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest, einen gegebenenfalls substituierten Rest -(CH2)nCOOX mit n gleich 0 bis 10 und X gleich Wasserstoff oder Alkyl, einen elektronenziehenden Substituenten, eine funktionelle Gruppe wie insbesondere eine Hydroxygruppe, eine erfindungsgemäße Oxogruppe (=0), -CONH2 oder ein Oxim (=N-OH) stehen, oder R2 und/oder R3 fehlen;

- R4 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R4 fehlt; - R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl- oder Arylrest steht oder R6 fehlt.

33. Zusammensetzung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass Alloxan- Monohydrat oder ein Alloxanderivat als heterozyklische Verbindung eingesetzt wird.

34. Verwendung einer Zusammensetzung zur Förderung der Ausbildung von Disulfidbrücken, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung wenigstens eine heterozyklische Verbindung aufweist, wie sie in wenigstens einem der Ansprüche 1 sowie 5 bis 12 definiert ist und/oder eine Zusammensetzung ist, wie sie in wenigstens einem der Ansprüche 28 bis 33 definiert ist.

35. Verwendung nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung zusätzlich wenigstens eine Metallverbindung, wie sie in einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 4 definiert ist, aufweist.

36. Verwendung nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine kosmetische und/oder therapeutische

Zusammensetzung zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen wie Haut, Haaren oder Nägeln ist.

37. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 28 bis 33 zur Herstellung eines kosmetischen und/oder therapeutischen Präparats zur Behandlung von keratinhaltigen Strukturen, wie insbesondere der Haut und Hautanhangsgebilden wie Haaren und Nägeln.

38. Verwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Präparat zur Stabilisierung von keratinhaltigen Strukturen durch Ausbildung von

Disulfidbrücken eingesetzt wird.

39. Verwendung nach Anspruch 37 oder 38 zur Herstellung eines kosmetischen und/oder therapeutischen Präparats zur Behandlung von schütterem Haar, Haarausfall, zur Förderung des Haarwachstums und/oder zur Stabilisierung und

Kräftigung des Haares.

40. Verwendung nach Anspruch 37 oder 38 zur Herstellung eines therapeutischen Präparats zur Behandlung von Hautkrankheiten oder Symptomen von Hautkrankheiten, die mit einer Schwächung der Keratinstruktur einhergehen, insbesondere der Hypokeratose oder der Epidermolyse.

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