Method For Establishing The Source Of Infection In A Case Of Fever Of Unclear Aetiology

Beschreibung

Verfahren zur Feststellung der Infektionsquelle bei Fieber unklarer Genese

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die für die Feststellung der lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genese gemäß Anspruch 1 , ein Verfahren zur in vitro Messung derartiger Genexpressionsprofile gemäß Anspruch 14 sowie die Verwendung der Genexpressionsprofile und/oder von den hierfür verwendeten Sonden zur Bestimmung der Genaktivität oder den davon abgeleiteten Proteinprodukten zum Screening von Wirkstoffen gegen Fieber mit unklarer Genese und/oder Peritonitis und/oder Pneumonie und/oder zur Beurteilung der Therapieeffekte von Wirkstoffen gegen Fieber mit unklarer Genese und/oder Peritonitis und/oder Pneumonie gemäß Anspruch 30 sowie einen Kit nach Anspruch 33.

Fieber unklarer Genese (Fever of unknow origin, FUO) ist klinisch definiert als ein Fieber, bei dem die Temperatur über einen Zeitraum von mehr als 3 Wochen höher als 38,8°C ist, ohne dass nach einer einwöchigen Untersuchungszeit eine eindeutige Diagnose der Ursache vorliegt. In Abhängigkeit des Ursprungs wurden vier Klassen des FUO beschrieben: FUO klassischen, nosokomialen, immunschwachen oder HIV- ' bezogenen Ursprungs (1). FUO wurde auch als "eine eher bekannte Krankheit mit einem ungewöhnlichen Erscheinungsbild als eine seltene Störung" geschildert (2).

Es gibt weder eine Goldstandard-Methode oder einen Diagnosetest, keine veröffentlichten Richtlinien noch auf Evidenz-basierende Empfehlungen zur Diagnose von FUO (3). Bis heute ist die Diagnose von FUO eine Herausforderung und wird unter Zuhilfenahme der Patientengeschichte, von Biopsien (z.B. Leber, Schläfeπarterie), chirurgischen und/ oder bildgebender Verfahren wie abdominale Computertomographie oder nukleare Bildverfahren (3) durchgeführt. All diese Methoden sind sehr kostspielig und wegen des Eingriffs (Biopsie, Chirurgie) unangenehm für den Patienten (1) Hinsichtlich der diagnostizierten Hauptursache können folgende 4 Untergruppen definiert werden: Infektion, bösartiger Tumor, autoimmune Störung und sonstige Ursachen, wobei die Infektion die meist verbreitete Ursache von FUO ist (1 ,4). Bei Patienten mit postoperativem Fieber wird nur bei 10% eine Infektion dokumentiert (5) In den meisten Falle ging die Temperatur des Patienten innerhalb von vier Tagen nach dem Eingriff zurück auf normal Trotzdem entwickelten einige Patienten am oder nach dem fünften postoperativem Tag eine Infektion, von denen 12% an einer Lungenentzündung erkrankten (5) Ebenso wird von PiIe und Kollegen erwähnt, das Fieber, welches zwei Tage nach dem Eingriff auftrat, mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer Infektion ausgelost wurde, z B eine Infektion der Harnwege und/ oder des inneren Unterleibs (Peritonitis), Lungenentzündung, eine durch einen intravenösen Katheder ausgeloste Infektion

Als dem FUO zugrunde liegende lokale Entzundungszustande kommen verschiedene Formen in Frage, wie beispielsweise Peritonitis, Pneumonie, Harnwegsinfektionen oder Endokarditis (2) Im folgenden wird beispielhaft auf Peritonitis und Pneumonie als zugrunde liegender Entzundungszustand eines FUO eingegangen

Lungenentzündung ist einer der schwersten Infektionskrankheiten auf der Intensivstation die dramatische Auswirkungen auf die Lebenserwartung des Patienten haben kann (6,7) Bei der Lungenentzündung oder Pneumonie handelt es sich um eine akute oder chronische Entzündung des Lungenparenchyms die meist durch eine Infektion mit Bakterien, Viren oder Pilzen verursacht wird Für die klinische Diagnostik wird zwischen der ambulant und nosokomial erworbenen Pneumonie unterschieden In den USA werden 2-3 Mio Falle von ambulant erworbener Pneumonie festgestellt, in Deutschland wird von etwa 750 000 Falle von ambulant erworbener Pneumonie in Deutschland ausgegangen (8) Insgesamt belaufen sich die Kosten für die Pneumoniebehandlung allein in den USA auf etwa 8 Mrd US$

Eine Pneumonie wird als nosokomial definiert, wenn die Pneumonie 48 Stunden nach Eiπlieferung des Patienten in das Krankenhaus diagnostiziert wird (9) Das größte Risiko zur Entwicklung einer nosokomial erworbenen Pneumonie bei Intensivpatienten entsteht durch den Einsatz von Beatmungsmaschinen Aus diesem Grund hat sich für diese Art Pneumonie der Begriff Ventilator-assozierte Pneumonie (VAP) durchgesetzt (10) Die Sterblichkeit bei VAP-Patienten hegt bei 30% (10) Wie Sauer et al berichten, konnten bei der Betrachtung von durch chirurgische Eingriffe ausgeloste Infektionen nur 30% der Infektionen nachgewiesen werden, die von einzelnen Erregern ausgelost wurden Sauer berichtet, dass die häufigste Infektionsursache bei Lungenentzündung Candida (Hefe) war Bei Patienten mit Lungenentzündung konnten Mischinfektionen mit mindestens zwei Erregern (47%), ein einzelner Erreger (24 %) oder keine Mikroben (29%) nachgewiesen werden Die Bestimmung einer möglichen Infektion und der Resistenz basiert auf klassischen mikrobiologischen Kultivierungsmethoden und auf Resistenztests gegenüber Antibiotika (11) und unterliegt aus diesem Grund auch den Beschrankungen solcher Methoden (nicht-kultivierbare Bakterien, eine längere Verzogerungsphase aufgrund des Gabe von Antibiotika, etc )

Eine Peritonitis ist eine lokale Infektion der Bauchfells hervorgerufen durch den Eintritt von Bakterien oder Pilzen in den Bachraum Peritoneale mesotheliale Zellen (PMC) im muskulären Teil der Membran werden von intermesothelialen Lucken (Stomata) unterbrochen und ermöglichen so den Kontakt mit den Hohlräumen (Lakunen) im Lymphgefäß und den Austritt der Bakterien aus der Bauchhohle (12) Nach Hall et al erklart die schnelle Beseitigung der Bakterien aus der Bauchhohle die initiale septische Phase einer Peritonitis Eine Infektion der Bauchhohle wird durch drei verschiedene Mechanismen bewältigt 1 Induktion einer Immunabwehr wie zum Beispiel die Freisetzung von Inflammationsmediatoren, 2 die Migration polymorphonuklearer Neutrophile und der Komplementkaskade und 3 die Herausbildung eines Abszesses

Peritonitis involviert üblicherweise gemischte mikrobielle Populationen (12), nichtsdestotrotz variiert der Ausgang einer Peritonitis in Abhängigkeit des Erregers, der die Peritonitis verursacht hat (13) So beschreiben Troidle et al , dass Gramnegative Infektionen zu einer höheren Mortalität fuhren und dass diese Patienten mit einer höheren Wahrscheinlichkeit einen Krankeπhausaufenthalt benotigten als bei Gram-positiven Erregern Verglichen mit Gram-negativer Peritonitis (9%) kommt es bei Gram-positiver Peritonitis in 32% der Falle zu einem Wiederauftreten der Infektion zu einem spateren Zeitpunkt mit demselben Erreger Trotz vieler Publikationen welche die Auswirkung der Erreger auf den Patienten darstellen (z B 12), stufen einige Autoren die Wirtsreaktion auf eine Infektion als wichtiger als die Infektion selber ein (14) Diese aus Tiermodellen ermittelten Beurteilungen beruhten allerdings auf einem physiologischem Bewertungssystem und setzten keine genomischen oder proteomischen Experimente ein

Neue molekularbiologische Methoden erlauben die Untersuchung der immunologischen Wirtsreaktion auf eine Infektion So sind aus dem Stand der Technik verschiedene Methoden und Ergebnisse bekannt, die die differentielle Genaktivitat als Antwort auf eine durch eine Infektion verursachte Erkrankung beschreiben (15-19)

Die grundsätzliche Verwendbarkeit von Genexpressionsprofilen, welche beispielsweise mittels der Microarray-Technik erhalten werden können, zur Diagnose von SIRS, generalisierten inflammatorischen Entzündungen, Sepsis und schwerer Sepsis ist in der PCT-Patentanmeldung der Anmeldeπn der vorliegenden Erfindung (20) oder (21), beschrieben, auf die hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird

In der deutschen Patentanmeldung (22) werden erstmals Genaktiviatsmarker zur Unterscheidung zwischen infektiösem und nicht infektiösem Multiorganversagen gezeigt Dann wird die Verwendung von 1297 verschiedene Genen für die in vitro Diagnose von Patienten, die an einem infektiösem bzw nicht infektiösem Multiorganversagen erkrankt sind, beschrieben

Ebenfalls konnten verschiedene organspezifische Studien zur differentiellen Genexpression hervorgerufen durch lokale Entzündungen gezeigt werden, wie beispielsweise durch Untersuchungen von Lungengewebe (19, 23-25) oder durch Untersuchungen der veränderten Genaktivitat von Lebergwebe als Reaktion auf eine fäkale Pentontis (26) Diese Untersuchungen bezogen sich aber immer auf gewebespezifische Genaktivitatsanderungen und somit nicht zur Feststellung eines FUO durch Messung der Genaktivitat in Korperflussigkeiten geeignet

In der Patentanmeldung (27) wird die Genexpression zur Einschätzung, des infektiösen bzw nicht-infektiosen Zustandes der identifizierten Infektionsquelle und nicht zur Feststellung der Infektionsquelle verwendet So wird beispielsweise bestimmt, ob eine Infektion im Kniegelenk vorliegt, indem eine Biopsie durchgeführt wird und die in der Gelenkflussigkeit enthaltenen Zellen analysiert werden Diese Erfindung lehrt nicht die Untersuchung der differentiellen Genaktivitat in Korperflussigkeiten zur Feststellung der zugrunde liegenden lokalen Entzündung eines FUO

In Reinhart et al (28) sowie aus der noch nicht vorveroffentlichten deutschen Patentanmeldung (29) der Anmeldern dieser Erfindung (28) wurden aus Vollblut gewonnene Genexpressionsprofile von Patienten, bei denen SIRS bzw Sepsis diagnostiziert waren, präsentiert Die differentielle Genaktivitat wurde benutzt um einzuschätzen, ob Genaktivitats-Klassifikatoren zwischen infektiösen und mcht- infektioseπ Entzundungserkrankungen differenzieren können In dieser Studie wurden die experimentell ermittelten Genaktivitats-Klassifikatoren anschließend mit den klinischen Parametern, die von den Patienten zur Verfugung standen, verglichen Es konnte gezeigt werden, dass die identifizierten Genaktivitats-Klassifikatoren eine gute Unterscheidungskraft zwischen infektiösen und nicht-infektiosen Zustanden besitzen, wenn die klinischen Daten auf eine Peritonitis als zugrundelegende lokale Entzündung verwiesen Allerdings war Unterscheidungskraft zwischen infektiösen und nicht-infektiosen Zustanden geringer, wenn die klinischen Daten eine Ventilator- assozierte Pneumonie (VAP) anzeigten Die in Reinart (2005) bzw in Referenz 29 beschriebenen Genaktivitatsklassifikatoren erlauben somit eine Unterscheidung zwischen infektiösen und nicht-infektiosen Zustanden Eine Möglichkeit zur Feststellung der zugrunde hegenden lokalen Entzündung eines FUO anhand von Genexpressionsprofilen wurde werde offenbart noch nahe gelegt

Es besteht somit ein dringender Bedarf an Möglichkeiten zur in vitro Diagnose der zugrunde liegenden lokalen Entzündung bei einem Fieber unklarer Genese Die Verfügbarkeit solcher in vitro Verfahren wird erheblich zu einer schnellen und für den Patienten wenig belastenden Diagnose eines FUO fuhren, adequate therapeutische Maßnahmen erlauben sowie die Kosten der Behandlung signifikant reduzieren

Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, dass sich anhand von Genaktivitatsprofilen die zugrunde hegende lokalen Entzündung eines FUO bestimmen werden kann Die Verwendung dieser Genaktivitaten ist mit den bisher zur Diagnose verwendeten klinischen Parametern nicht möglich, aber für die Einleitung einer spezialisierten intensivmedizinischen Therapie sehr bedeutungsvoll Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, durch die Verwendung von Genaktivitätsmarkern die Feststellung lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genese zu ermöglichen.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 , 14 und 33 gelöst.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Feststellung der lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genes.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von spezifischen Genexpressionsprofilen, die eine Lokalisierung der zugrunde liegenden lokalen Entzündung erlauben. Solche lokalen Entzündungen eines FUO sind beispielsweise Peritonitis, Pneumonie, Endokarditis oder Harπwegsinfektionen.

Insbesondere betrifft die Erfindung die Genxpressionsprofile von wenigstens 2 Polynukleotiden, ausgewählt aus den SEQ-IDs No 1 bis 191 aufgenommen werden, die spezifisch für Peritonitis oder Pneumonie als lokalen Entzündung eines „Fiebers unklarer Genese" sind. Hierbei können die in ihrem Expressionsverhalten vergleichbaren Genaktivitäten der Polynukleotide mit den SEQ-IDs No 1 bis 191 zu diagnostischen Genaktivitätsclustem zusammengefasst werden.

Diese Genaktivitätscluster setzen sich wie folgt zusammen:

Cluster 1 : SEQ-ID No.1 bis SEQ-ID No. 77 Peritonits spezifische Sequenzen mit signifikanter Genaktiviät (Tab. 3)

Cluster 2: SEQ-ID No. 78 bis SEQ-ID No. 191 Pneumonie spezifische Sequenzen mit signifikanter Genaktiviät (Tab.3)

Die Erfindung umfasst ebenfalls Genexpressioπsprofile von wenigstens 2 Polynukleotiden, ausgewählt aus den SEQ-ID No. 192 bis SEQ-ID No. 432 aufgenommen werden, die spezifisch für eine lokale Entzündung, nicht aber für Peritonitis oder Pneumonie, eines „Fiebers unklarer Genese" sind. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst ebenfalls Genexpressionsprofile von wenigstens 2 Polynukleotiden, die eine 80%-ige Homologie zu den SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 432 besitzen, für die Feststellung der lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genes.

Die Erfindung schließt ebenfalls die Verwendung dieser Genexpressionsprofile als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit „Fieber unklarer Genese" in klinische Studien ein.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung der in-vitro gewonnenen Genexpressionsprofile zur Erstellung von Genaktivitätsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung. Diese Genaktivitätsdateh können zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose eines Patienten, für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangementsysteme, eingesetzt werden.

Eine weitere Verwendung der in-vitro gewonnenen Genexpressionsprofile besteht in der Herstellung von klinischen Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zelluläreren Signalübertragungswegen eingesetzt werden. Solche Modellierungsmethodeπ und/oder -programme sind beispielsweise Ingenuity (Fa. Ingenuity Systems), Panther (Applied Biosystems) oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass zur Erstellung des Genexpressionsprofiles ein spezifisches Gen und/oder Genfragment verwendet wird, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 432 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpressionsprofile mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays oder real-time PCR basiert, ermittelt werden. Verfahren zur Hybridisierung sind dem Fachmann ausreichend bekannt. Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist ein Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass zur in vitro Messung von Geπexpressionsprofilen und/oder mindestens einem Genaktivitatscluster zur Feststellung der lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genese, dadurch gekennzeichnet, dass man in Patienten die Genaktivitat einer Mehrzahl von bestimmten, mit der Infektionsquelle in Zusammenhang stehenden Genen in einer Patientenprobe bestimmt

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass zur in vitro Messung von Genexpressionsprofilen und/oder mindestens einem Genaktivitatscluster zur Feststellung von Peritonitis oder Pneumonie als Infektionsquelle eines Fiebers unklarer Genese, in Patienten die Genaktivitat einer Mehrzahl von bestimmten, mit Peritonitis und Pneumonie als Infektionsquelle in Zusammenhang stehenden Gene in einer Patientenprobe bestimmt werden, wobei die für Peritonitis und Pneumonie der lokalen Entzündung spezifischen Gene und/oder Genfragmente ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 191 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass sich die spezifischen Sequenzen SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 191 aus folgenden diagnostischen Cluster zusammensetzen

Cluster 1 SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 77 Peritonitis spezifische Sequenzen mit signifikanter Genaktiviat

Cluster 2 SEQ-ID No 78 bis SEQ-ID No 191 Pneumonie spezifische Sequenzen mit signifikanter Genaktiviat

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet dass die Genfragmeπte 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet dass wenigstens 4 bis 100 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 200 unterschiedliche Gene und/oder Genfragmente verwendet werden

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Gene und/oder Genfragmente verwendet werden

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass in Tabelle 3 und Tabelle 4 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch synthetische Analoga, Aptamere, Spiegelmere sowie Peptido- und Morphohnonukleinsauren

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die synthetischen Analoga der Gene 20-100, insbesondere ca 70 Basenpaare umfassen

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitaten mittels Hybπdisierungsverfahren bestimmt wird

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitat mittels Microarrays bestimmt wird

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitat durch Hybπdisierungs-unabhangige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder chemische Hydrolyse und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben, bestimmt wird

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Probe ausgewählt wird aus Gewebe, Korperflussigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder eine Mischung davon

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zelhnhalte freizusetzen

In einer weitere Ausfuhrungsform der Erfindung werden die in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen und/oder von den hierfür verwendeten Sonden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 191 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden, zur Bestimmung der Genaktivitat oder den davon abgeleiteten Proteinprodukten zum Screening von Wirkstoffen gegen Fieber mit unklarer Genese und/oder Peritonitis und/oder Pneumonie und/oder zur Beurteilung der Therapieeffekte von Wirkstoffen gegen Fieber mit unklarer Genese und/oder Peritonitis und/oder Pneumonie verwendet

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass hybπdisierungsfahige synthetische Analoga der in den Tabellen 3 und 4 aufgelisteten Sonden verwendet werden

Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen

Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der eine Auswahl von Sequenzen die spezifisch für die Feststellung der lokalen Entzündung eines „Fiebers unklarer Genese"sιnd, und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe, für die Feststellung der Infektionsquelle und/oder der Infektionsursache eines Fiebers unklarer Genese, enthalt Eine weitere Ausfuhrungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass der Kit eine Auswahl von wenigstens 2 Polynucleotiden mit Sequenzen gemäß SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 191 und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe, für die Feststellung von Peritonitis und/oder Pneumonie als lokalen Entzündung des Fiebers unklarer Genese, enthalt

Ausfuhrungsbeispiel

Untersuchung zur Erstellung von Geπexpressionsprofilen zur Feststellung der lokalen Entzündung von Patienten, bei denen Fieber unklarer Genese (1 ,3) und eine schwere Infektion (30) diagnostiziert wurde

Messung der differentiellen Genexpression

Zunächst wurde die differentielle Genexpression zwischen zwei Patientengruppen untersucht von denen bekannt war, dass

ι) die erste (teilweise geblindeten) Gruppe Patienten waren, die im Rahmen ihrer intensivmedizinischen Betreuung an einer schweren Infektion [Sepsis, klassifiziert nach 30] erkrankt waren und bei denen ein „Fieber unklarer Genese" diagnostiziert wurde (Patientenqruppe 1) Von diese Patienten war nicht bekannt, welche die zugrunde hegende lokale Entzündung für das FUO war

ιι) die zweite Gruppe Patienten waren die im Rahmen ihrer intensivmedizinischen Betreuung eine akute generalisierte Entzündung [SIRS, klassifiziert nach 30] mit Organversagen entwickelten, bei denen jedoch zu keinem Zeitpunkt ihrer intensivmedizinischen Betreuung eine Infektion nachgewiesen wurde (Patientenqruppe 2)

Ausgewählte Charakteristika der zwei Patientengruppen sind in der Tabelle 1 dargestellt Dabei werden Angaben zum Alter, Geschlecht, und dem SOFA-Score als Maß für die Funktion der Organsysteme gemacht Gleichfalls sind die Plasmaproteinspiegel von Procalcitonin (PCT) und CRP sowie die Zahl der Leukozyten der Patienten angegeben

Als Referenzproben dienten die totale RNA aus Zelllinien SIG-M5

Alle Patientenproben wurden mit der Referenzprobe jeweils auf einem Microarray ko- hybπdisiert

Tabelle 1 Daten der Patientengruppen 1 und 2

Patienten mit schwerer Infektion SIRS + OD Patientengruppe 1 Patientengruppe 2

Anzahl Patienten 39 37

Sterblichkeit 16 (41 ,0 %) 2° (5,4 %)

Geschlecht [M/W] 31/8 18/19

Alter [Jahre] 69 (11) 75 (14)

SOFA Score 9 (2 5) 8* (2)

Anzahl OD 3 (1) 2 (1 )

PCT [ng/ml] 2 44 (3 20) [36] 3 34 (4 13) [30]

CRP [mg/l] 177 (124 4) [35] 91 6* (90 13) [36]

WBC [no/l] 14400 (9050) 1 1900* (7400)

median (IQR)

*p < 0 05 (Wilcoxon-Rangsummen-Test)

°p = 0 003 (Exakter Test von Fisher)

Experimentelle Beschreibung

Blutabnahme und RNA-Isolation

Das Vollblut der Patientengruppe 1 wurde postoperativ zum Zeitpunkt der Diagnose

„Fieber unklarer Genese' von den Patienten mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen Das Vollblut der Patientengruppe 2 wurde postoperativ mittels des PAXGene Kits gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) abgenommen Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA der Proben unter Anwendung des PAXGene Blood RNA Kit gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert

Zellkultivierung

Für die Zellkultivierung (Kontrollproben) wurden 19 Kryozellkulturen (SIGM5) (eingefroren in flussigem Stickstoff) genutzt Die Zellen wurden jeweils mit 2 ml Iscove's Medium (Biochrom AG) beimpft ergänzt mit 20% fetalen Kalber Serum (FCS) Die Zellkulturen wurden anschhessend für 24 Stunden bei 37° C unter 5% CO2 in 12-well Platten inkubiert Danach wurde der Inhalt von 18 Wells in 2 Teile mit jeweils dem gleichen Volumen geteilt, sodass schliesslich 3 Platten des gleichen Formats (insgesamt 36 Wells) zur Verfugung standen Die Kultivierung wurde anschhessend für 24 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgeführt Im Anschluss daran wurden die resultierenden Kulturen von 1 1 Wells jeder Platte vereint und zentπfugiert (1000 x g, 5 min, Raumtemperatur) Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 40 ml des o g Mediums gelost Diese 40 ml geloste Zellen wurden in zwei 250 ml Kolben zu gleichen Teilen aufgeteilt und nach 48 Stunden Inkubation und Zugabe von 5 ml des o g Mediums wiederum inkubiert Von den restlichen 2 ml der zwei verbleibendenden Platten wurden 80 μl in leere Wells der gleichen Platten gegeben, welche bereits vorher mit 1 ml des o g Mediums präpariert waren Nach 48 Stunden Inkubation wurde nur eine der 12 Well-Platten wie folgt prozessiert Aus jedem Well wurden 500 μl entnommen und vereint Die daraus resultierenden 6 ml wurden in einen 250 ml Kolben gegeben, welcher ca 10 ml frisches Medium enthielt Dieses Gemisch wurde mit 1000 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentπfugiert und in 10 ml des o g Mediums gelost Die anschhessende Zellzahlung ergab folgendes Ergebnis 1 ,5 x 107 Zellen pro ml, 10 ml Gesamtvolumen, Gesamtzahl der Zellen 1 ,5 x 108 Da die Zellzahl noch nicht ausreichend war, wurden 2,5 ml des o g Zellsuspeπsion in 30 ml des o g Mediums in einen 250 ml (75 cm2) Kolben gegeben (insgesamt 4 Kolben) Nach 72 Sunden Inkubationszeit wurden jeweils 20 ml frischen Mediums in die Kolben gegeben Nach folgender 24-stundιger Inkubation erfolgte die Zellzahlung wie oben beschrieben, die eine Gesamtzellzahl von 3,8 x 108 Zellen ergab Um die gewünschte Zellzahl von 2 x 106 Zellen zu errreichen wurden die Zellen in 47,5 ml des o g Mediums in 4 Kolben resuspendiert Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Zellen zentrifugiert und zweimal mit Phosphatpuffer ohne Ca2+ und Mg2+ (Biochrom AG) gewaschen

Die Isolation der totalen RNA erfolgt mittels des NucleoSpin RNA L Kits (Machery&Nagel) entsprechend den Angaben des Herstellers Die oben beschriebene Prozedur wurde wiederholt bis die erforderliche Zellzahl erreicht wurde Dies war erforderlich, um die erforderliche Menge von 6 mg totale RNA zu erreichen, was etwa einer Effizienz von 600 μg RNA pro 108 Zellen entspricht

Reverse Transkription / Markierung / Hybridisierung

Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA der Proben unter Verwendung des PAXGene Blood RNA Kits (PreAnalytiX) gemass den Vorgaben des Herstellers isoliert und auf ihre Qualität geprüft Von jeder Probe wurden 10 μg totale RNA aliquotiert und zusammen mit 10 μg total RNA aus SIGM5-Zellen als Referenz-RNA zu komplementärer DNA (cDNA) mit der reversen Transkπptase Superscπpt Il (Invitrogen) umgeschrieben und die RNA anschließend durch alkalische Hydrolyse aus dem Ansatz entfernt Im Reaktionsansatz wurde ein Teil des dTTP durch Aminoallyl-dUTP (AA-dUTP) ersetzt, um spater die Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes an die cDNA zu ermöglichen

Nach der Aufreinigung des Reaktionsansatzes wurden die cDNA der Proben und Kontrollen mit den Fluoreszenzfarbstoffeπ Alexa 647 und Alexa 555 kovalent markiert und auf einem Microarray der Firma SIRS-Lab hybridisiert Auf dem verwendeten Microarray befinden sich 5308 immobilisierte Polynukleotide mit einer Lange von 55 - 70 Basenpaaren, die jeweils ein humanes Gen repräsentieren und Kontrollspots zur Qualitätssicherung Ein Microarray unterteilt sich in 28 Subarrays mit einem Raster von 15x15 Spots

Die Hybridisierung und das anschhessende Waschen bzw Trocknen wurde in der Hybndisierungsstation HS 400 (Tecan) nach Angaben des Herstellers über 10,5 Stunden bei 42 0C durchgeführt Die verwendete Hybπdisierungslosung besteht aus den jeweiligen gelabelten cDNA-Proben, 3,5x SSC (1 x SSC enthalt 150 mM Natriumchlorid und 15 mM Natπumcitrat), 0,3% Natπumdodecylsulfat (V/V) 25% Formamid (V/V) und je 0,8 μg μl-1 cot-1 DNA, Hefe t-RNA und poly-A RNA Das anschliessende Waschen der Mikroarrays wurde mit nachfolgendem Programm bei Raumtemperatur in durchgeführt je 90 Sekunden spulen mit Waschpuffer 1 (2x SSC, 0,03% Natriumdodecylsulfat), mit Waschpuffer 2 (1x SSC) und abschließend mit Waschpuffer 3 (0,2x SSC) Danach wurden die Mikroarrays unter einem Stickstoffstrom mit einem Druck von 2,5 bar bei 30 0C über 150 Sekunden getrocknet

Nach der Hybridisierung wurden die Hybπdisierungssignale der Microarrays mit einem GenePix 4000B Scanner (Axon) ausgelesen und die Expressionsverhaltnisse der differenziert expπmierten Gene mit der Software GenePix Pro 4 0 (Axon) bestimmt

Auswertung

Für die Auswertung wurde die mittlere Intensität eines Spots als der Medianwert der zugehörigen Spotpixel bestimmt

Korrektur systematischer Fehler

Die Korrektur systematischer Fehler erfolgte nach dem Ansatz von Huber et al [31] Dabei wurden der Additive und der multiplikative Bias innerhalb eines Microarrays aus 70% der vorhandenen Genproben geschätzt Für alle weiteren Berechnungen wurden die Signale mittels arcus smus hyperbolicus transformiert

Für die Analyse wurden die normalisierten und transformierten relativen Verhaltnisse der Signale der Patientenproben gegen die allgemeine Kontrolle berechnet D h für das j-te Gen des n-ten Patienten ergab die Berechnung den Wert Gj, n = arcsιnh(Scy5(j,π)) - arcsιπh(Scy3(j n)), wobei [SCy3(j,n), SCy5(j n)] das zugehörige Signalpaar bezeichnet War für einen Patienten ein Spot nicht auswertbar (z B Fleck auf dem gescannten Bild), so wurde der zugehörige Wert als nicht vorhanden (.missing value') gekennzeichnet

Statistischer Vergleich

Für den Vergleich wurde der zweiseitige Zweistichproben Student-Test pro Gen verwendet Beide Stichproben enthielten die Werte der Patientengruppen Für die Auswahl der differenziert expπmierten Gene wurde der zugehörige p-Wert bewertet Für die Gruppe der ausgewählten Gene war der zugehörige p-Wert kleiner als 0 05 Die in den Tabellen 3 und 4 aufgeführten sind in dem dieser Anmeldung angefügten Sequenzprotokol im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 432) zugeordnet.

Die ermittelten Genaktivitäten aus Tabellen und 3 und 4 können somit zur Unterscheidung von infektiösen und nicht-infektiösen Zuständen verwendet werden. Diese Ergebnisse bestätigen die Verfahren und Ergebnisse aus dem Stand der Technik, wie beispielsweise in (20-22) gezeigt.

Entblindunq der Patientenqruppe 1 und Korrelation mit den ermittelten Genaktivitäten der Tabelle 3 und 4.

Aus der Entblindung der Patientengruppe 1 ergab sich, das diese Patientengruppe aus zwei Untergruppen bestand:

1) Patienten, bei denen ein FUO und eine schwere Infektion diagnostiziert wurde und bei denen die Follow-up Diagnose eine Peritonitis als zugrunde liegende lokale Entzündung identifiziert wurde (Patientengruppe 1 a).

2) Patienten, bei denen ein FUO und eine schwere Infektion diagnostiziert wurde und bei denen die Follow-up Diagnose eine Pneumonie als zugrunde liegende lokale Entzündung identifiziert wurde (Patientengruppe 1 b).

Ausgewählte Charakteristika der zwei Patientengruppen 1a und 1b nach der Follow- up Diagnose sind in der Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2: Daten der Patientengruppen 1a und 1b

Zur Feststellung der einem FUO zugrunde liegendem lokalen Entzündung von Patienten, wurden die ermittelten Genaktivitaten aus Tabelle 3 und 4 statistisch nach signifikanten Genaktivitatsclustern klassifiziert, die innerhalb der Patientengruppen 1 a und 1b eine ahnliche Aktivität aufwiesen Dabei wurde überraschend festgestellt, dass sich ausgehend von allen gemessenen Genaktivitaten eine Klassifizierung der Genaktivitaten in drei Cluster ergeben hat

Cluster 1 Für Peritonitis wurde ein Cluster an spezifischen Sequenzen mit signifikanter Genaktivitat entsprechend den SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 77 ermittelt, die Bestandteil des angefugten Sequenzprotokolls sind

Cluster 2 Für Pneumonie wurde ein Cluster an spezifischen Sequenzen mit signifikanter Genaktivitat entsprechend den SEQ-ID No 78 bis SEQ-ID No 191 ermittelt, die Bestandteil des angefugten Sequenzprotokolls sind

Cluster 3 Gemeinsamer Set an Sequenzen mit ähnlicher signifikanter Genaktivitat bei Patienten mit schweren Infektionen, die spezifisch für eine lokale Entzündung, nicht aber für Peritonitis oder Pneumonie, eines „Fiebers unklarer Genese"sιnd entsprechend den SEQ-ID No 192 bis SEQ-ID No 432 die Bestandteil des angefugten Sequenzprotokolls sind Die drei Genaktivitätscluster sind in Tabelle 3 (Cluster 1 und 2) und 4 (Cluster 3) dargestellt.

LEERSEITE

Tabelle 3 Genaktivitatscluster 1 und 2 zur Feststellung von Peritonitis (Cluster 1 ) oder Pneumonie (Cluster 2) als lokalen Entzündung eines FUO

Tabelle 4. Gemeinsamer Set an Sequenzen mit ahnlicher signifikanter Genaktivität bei Patienten mit schweren Infektionen, die spezifisch für eine lokale Entzündung, nicht aber für Peritonitis oder Pneumonie, eines „Fiebers unklarer Genese"sind

 Damit sind die ermittelten spezifischen Genaktivitätscluster 1 und 2 für die Feststellung von Peritonitis oder Pneumonie als lokale Entzündung für „Fieber unklarer Genese" für die Erfindung anwendbar.

Das Genaktivitätscluster 3 ist für die Feststellung einer lokalen Entzündung eines FUO, die nicht Peritonitis oder Pneumonie ist, für die Erfindung anwendbar.

Referenzen

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Ansprüche

1. Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen für die Feststellung der lokalen Entzündung eines „Fiebers unklarer Genese".

2. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die Genexpressionsprofile spezifisch für lokale Entzündungen eines „Fiebers unklarer Genese", wie Peritonitis, Pneumonie, Endokarditis oder Harnwegsinfektionen, sind.

3. Verwendung nach Anspruch 1 und 2, wobei die Genexpressionsprofile von wenigstens 2 Polynukleotiden, ausgewählt aus den SEQ-IDs 1 bis 191 oder aufgenommen werden, die spezifisch für Peritonitis und/oder Pneumonie als lokalen Entzündung eines „Fiebers unklarer Genese"sind.

4. Verwendung nach einem der Anspruch 1 bis 3, wobei die in ihrem Expressionsverhalten vergleichbaren Genaktivitäten der Polynucleotide mit den SEQ-IDs No 1 bis 191 zu diagnostischen Genaktivitätsclustem zusammengefaßt werden.

5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei sich einzelne diagnostische Cluster wie folgt zusammensetzen:

Cluster 1 : SEQ-ID No.1 bis SEQ-ID No. 77 Peritontis spezifische

Sequenzen mit signifikanter Genaktiviät Cluster 2: SEQ-ID No. 78 bis SEQ-ID No. 191 Pneumonie spezifische

Sequenzen mit signifikanter Genaktiviät

6. Verwendung nach Anspruch 1 und 2, wobei die Genexpressionsprofile von wenigstens 2 Polynucleotiden, ausgewählt aus den SEQ-IDs 192 bis 432 aufgenommen werden, die spezifisch für eine lokale Entzündung, nicht aber für Peritonitis oder Pneumonie, eines „Fiebers unklarer Genese"sind. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 als Ein- oder Ausschlußkriterium von Patienten mit „Fieber unklarer Genese"ιn klinische Studien

Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Erstellung von Geπaktivitatsdaten für die elektronische Weiterverarbeitung

Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die erhaltenen Genaktivitatsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung der individuellen Prognose eines Patienten, für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangementsysteme, eingesetzt werden

Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die ιn-vιtro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen zur Herstellung von klinischen Expertensystemen und/oder zur Modellierung von zellulareren Signalubertragungswegen eingesetzt werden

Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei zur Erstellung des Genexpressionsprofiles ein spezifisches Gen und/oder Genfragment verwendet wird, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No 1 bis SEQ-ID No 432, Genfragmenten davon mit wenigstens 20- 2000 Nukleotiden sowie Gene mit einer Sequenzhomologie von mindestens 80%

Verwendung nach Anspruch 11 , wobei die Genfragmente 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen

Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Genexpressionsprofile mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays oder real-time PCR basiert, ermittelt werden

Verfahren zur in vitro Messung von Genexpressionsprofilen und/oder mindestens einem Genaktivitatscluster zur Feststellung der lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genese, dadurch gekennzeichnet, dass man in Patienten die Genaktivitat einer Mehrzahl von bestimmten, mit der lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genese in Zusammenhang stehenden Genen in einer Patientenprobe bestimmt.

15. Verfahren nach Ansprich 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur in vitro Messung von Genexpressionsprofilen und/oder mindestens einem Genaktivitätscluster zur Feststellung von Peritonitis oder Pneumonie lokalen Entzündung eines Fiebers unklarer Genese, in Patienten die Genaktivität einer Mehrzahl von bestimmten, mit Peritonitis oder Pneumonie lokalen Entzündung in Zusammenhang stehenden Gene in einer Patientenprobe bestimmt werden, wobei die für Peritonitis oder Pneumonie lokalen Entzündung spezifischen Gene und/oder Genfragmente ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 191 , Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden sowie Gene mit einer Sequenzhomologie von mindestens 80%.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei sich die spezifischen Sequenzen SEQ-ID No.1 bis SEQ-ID No. 191 aus folgenden diagnostischen Cluster zusammensetzen:

Cluster 1 : SEQ-ID No.1 bis SEQ-ID No. 77 Peritontis spezifische Sequenzen mit signifikanter Genaktiviät

Cluster 2: SEQ-ID No. 78 bis SEQ-ID No. 191 Pneumonie spezifische Sequenzen mit signifikanter Genaktiviät

17. Verfahren nach Anspruch 14-15, dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen.

18. Verfahren nach Anspruch 14-15, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens 4 bis 100 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden.

19. Verfahren nach Anspruch 14-15, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche Gene und/oder Genfragmente verwendet werden.

20. Verfahren nach Anspruch 14-15, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche Gene und/oder Genfragmente verwendet werden.

21. Verfahren Anspruch 14-15, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden.

22. Verfahren Anspruch 14-15, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche Gene und Genfragmente verwendet werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 16 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch: synthetische Analoga, Aptamere, Spiegelmere sowie Peptido- und Morpholinonukleinsäuren.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetischen Analoga der Gene 20-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.

25. Verfahren nach Anspruch 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Genaktivitäten mittels Hybridisierungsverfahren bestimmt wird.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität mittels Microarrays bestimmt wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivität durch Hybridisierungs-unabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder chemische Hydrolyse und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben, bestimmt wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Gewebe, Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder eine Mischung davon.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.

30. Verwendung von in vitro aus einer Patientenprobe erhaltenen Genexpressionsprofilen und/oder von den hierfür verwendeten Sonden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 432 sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden, zur Bestimmung der Genaktivität oder den davon abgeleiteten Proteinprodukten zum Screening von Wirkstoffen gegen Fieber mit unklarer Genese und/oder Peritonitis und/oder Pneumonie und/oder zur Beurteilung der Therapieeffekte von Wirkstoffen gegen Fieber mit unklarer Genese und/oder Peritonitis und/oder Pneumonie.

31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass hybridisierungsfähige synthetische Analoga der in Anspruch 15 aufgelisteten Sonden verwendet werden.

32. Verwendung nach einem der Ansprüche 30 oder 31 , dadurch gekennzeichnet, dass die Genfragmente 20-200, vorzugsweise 20-80 Nukleotide umfassen.

33. Kit, enthaltend eine Auswahl von Sequenzen die spezifisch für die Feststellung lokalen Entzündung eines „Fiebers unklarer Genese"sind, und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe, für die Feststellung der Infektionsquelle und/oder der Infektionsursache eines Fiebers unklarer Genese.

34. Kit nach Anspruch 33, enthaltend eine Auswahl von wenigstens 2 Polynucleotiden mit Sequenzen gemäß SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 196 und/oder Genfragmenten davon mit wenigstens 20-2000 Nukleotiden zur Bestimmung von Genexpressionsprofilen in vitro in einer Patientenprobe, für die Feststellung von Peritonitis und/oder Pneumonie lokalen Entzündung des Fiebers unklarer Genese.

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