Use Of Creatine Kinase For Preventing Or Treating Addiction To Opiates

  • Published: Aug 16, 2012
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UTILISATION DE LA CREATINE KINASE POUR LA PREVENTION OU LE TRAITEMENT D'UNE ADDICTION ASSOCIÉ AUX OPIACÉS

5 DESCRIPTION

Domaine technique

La présente invention se rapporte à l'utilisation de la créatine kinase pour l'obtention d'un médicament 10 destiné à la prévention ou au traitement d'une addiction ou d'une pathologie addictive.

La présente invention trouve notamment une application dans le domaine des pathologies addictives associées à une augmentation du taux de morphine et de 15 ses dérivés, en particulier du taux de morphine endogène et de ses dérivés.

Dans la description ci-dessous, les références entre crochets ( [ ] ) renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.

20

Etat de la technique

La créatine kinase (CK, EC 2.7.3.2), également appelée phosphocréatine kinase ou créatine phosphokinase (CPK) , est une enzyme exprimée par

25 différents tissus incluant le cerveau et les muscles où elle est présente sous une forme cytoplasmique et mitochondriale . Il existe plusieurs isoenzymes (présents sous forme de dimères non covalents) : la CK- MM présente dans les muscles, la CK-MB trouvée dans les

30 cellules myocardiaques , et la CK-BB qui se trouve dans le cerveau. On trouve également de la CK mitochondriale (mtCK) . Cette enzyme catalyse la conversion réversible de la créatine en phosphocréatine via l'utilisation de l'adénosine triphosphate (ATP, figure 1). Cette enzyme est primordiale pour la production d'ATP à partir des stocks de phosphocréatine . La phosphocréatine, par l'intermédiaire de l'ATP, constitue ainsi un réservoir d'énergie rapidement utilisable pour les muscles et autres organes incluant le cerveau. La CK (isoformes MM et MB ; dimères) est libérée dans le sang lors de lésions tissulaires provoquant une lyse cellulaire (par exemple lors d'atteinte musculaire telle que la rhabdomyolysis , un effort musculaire, l'infarctus du myocarde, etc..) . Le dosage des isoenzymes dans le sang permet de distinguer l'origine de la destruction cellulaire. Ainsi, l'augmentation de CK-MB sanguine a été utilisée en dosage sanguin pour diagnostiquer l'infarctus du myocarde.

Les alcaloïdes sont des molécules organiques hétérocycliques azotées basiques, d'origine naturelle, pouvant avoir une activité pharmacologique . Bien que beaucoup d'alcaloïdes soient toxiques (comme la strychnine ou 1 ' aconitine) , certains sont employés en médecine pour, par exemple, leurs propriétés analgésiques (comme la morphine, la codéine) , dans le cadre de protocoles de sédation (anesthésie) souvent accompagnés d'hypnotiques, ou comme agent antipaludéen (quinine, chloroquinine) ou agent anticancéreux (taxol, vinblastine, vincristine) .

Les opiacés sont des molécules chimiques qui agissent en se liant aux récepteurs opioïdes Mu, Delta ou Kappa, qui sont exprimés dans le système nerveux central et périphérique et le tractus gastro¬ intestinal. Ces récepteurs médient à la fois les effets bénéfiques et les effets secondaires des opiacés (alcaloïdes) et opioïdes (peptides) . Les opiacés sont parmi les plus anciennes drogues connues. Les effets analgésiques (antidouleurs) des opiacés sont dus à une perception diminuée de la douleur, une réaction diminuée à la douleur, ainsi qu'une tolérance augmentée à la douleur. Les principaux effets secondaires des opiacés sont la sédation, la dépression respiratoire, et la constipation. Les opiacés peuvent provoquer la suppression de la toux, qui peut être à la fois une indication pour l'administration d'opiacés ou d'un effet secondaire imprévu. Une dépendance psychique et physique peut se développer avec l'administration continue d'opiacés, ce qui conduit à un syndrome de sevrage à l'arrêt brusque. Les opiacés sont bien connus pour leur capacité à produire un sentiment d'euphorie, motivant ainsi certains à les utiliser à des fins récréatives. Il existe cinq grandes classes d'opiacés: (A) les opiacés naturels sont des alcaloïdes contenus dans la résine du pavot à opium (Papaver somniferum) mais également chez d'autres organismes vivants (mammifères et invertébrés) , à savoir principalement la morphine et des dérivés morphiniques par exemple la codéine et la thébaïne, mais pas la papavérine et la noscapine qui ont un mécanisme d'action différent. Les éléments suivants pourraient être considérés comme les opiacés naturels: les feuilles de Mitragyna speciosa (également appelé Kratom) contiennent quelques opiacés naturels, actifs via les récepteurs Mu et Delta. La Salvinorine A, trouvée naturellement dans la plante Salvia divinorum, est un agoniste des récepteurs opioïdes kappa ; (B) les opiacés semi-synthétiques créés à partir des opiacés naturels tels que 1 ' hydromorphone, 1 ' hydrocodone, l'oxycodone,

1' oxymorphone, la désomorphine, la nicomorphine, la dipropanoylmorphine, la benzylmorphine, 1 ' éthylmorphine et la buprénorphine ; (C) les opiacés entièrement de synthèse tels que le fentanyl, la péthidine, la méthadone, le tramadol et le dextropropoxyphène ; (D) les opioïdes endogènes peptidiques produits naturellement dans le corps (comme les endorphines, les enképhalines , dynorphines, et les endomorphines ) ; et

(E) leurs dérivés synthétiques ou semi-synthétique

(DDPE, etc..) .

Il est connu de l'art que l'administration chronique d' alcaloïdes ou d' autres drogues d' abus telles que l'alcool, la nicotine, etc. conduit à une tolérance voire une dépendance (addiction) de l'organisme humain ou animal.

La morphine est un alcaloïde opiacé naturel utilisé comme médicament contre la douleur (analgésique) . Principal alcaloïde issu du pavot à opium (Papaver somniferum) , la morphine est considérée comme la référence à laquelle sont comparés tous les autres analgésiques en termes d'efficacité. Elle est le plus souvent utilisée sous la forme d'un sel, de sulfate ou de chlorhydrate, d'efficacités identiques. À ce jour, la morphine est le médicament analgésique le plus efficace et le plus couramment utilisé pour soulager divers types de douleur physique. Toutefois son emploi pose de nombreux problèmes dus à la dépendance qu'elle peut induire. Aussi est-elle listée comme stupéfiant au niveau international (Cil). La morphine endogène (ME), structuralement identique à la morphine du pavot à opium, ainsi que plusieurs de ses dérivés ont été caractérisés dans différents tissus et cellules de mammifères (cellules chromaffines et neutrophiles polymorphonucléaires ) [Herbert et al., Nat . Prod. Rep . , 17 : 317-322, 2000 ; Stefano et al., Trends Neurosci . , 23 : 436-442, 2000 ; Zhu et al., J. Immunol., 175(11) : 7357-7362, 2005 ; Glattard et al., PLoS One, 5(1) : e8791, 2010] [1, 2, 24, 25], et sont présents, par exemple, dans des vésicules de sécrétion de certains neurones [Bianchi et al., Brain Res., 627 : 210-215,

1993 ; Bianchi et al., Adv. Neuroimmunol . , 4 : 83-92,

1994 ; Guarna et al., J. Neurochem., 70 : 147-152, 1998 ; Muller et al., PLoS One, 3 : Epub www.plosone . org/doi/pone.0001641, 2008] [3-6] . On retrouve également de la morphine endogène dans différents fluides biologiques incluant le liquide céphalorachidien, le sang et l'urine. Tout comme chez les plantes, la voie de synthèse de la morphine chez les mammifères dérive de celle de la dopamine (figure 2) [Boettcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 102 : 8495-8500, 2005 ; Goumon et al., An. R. Acad. Nac. Farm., 75 : 389-418, 2009] [7, 8]. Le catabolisme de la morphine (endogène et exogène) par la superfamille des UDP-glucuronosyltransférases (UGT) aboutit à la formation de la morphine-3-glucuronide (M3G, dénuée d'activité analgésique) et de la morphine- 6-glucuronide (M6G qui possède une activité analgésique supérieure à celle de la morphine, 1 à 600 fois) [Lotsch et Geisslinger, Clin. Pharmacokinet . , 40 : 485-499, 2001] [9]. Cependant, d'autres dérivés endogènes sont également retrouvés : la normorphine, la nocodéine-3- 6- diglucuronide, l' hydrocodone, l' hydromorphone, etc.. Il a été mis en évidence une corrélation entre le taux de morphine sérique et le sepsis (infection systémique grave) qui indique que la morphine endogène représente un biomarqueur sérique des infections [Demande de Brevet en Europe No. 07301692.5] [10]. D'autre part, de récents résultats indiquent qu'une immunoréactivité apparentée à la morphine est distribuée dans tout le cerveau de la souris et avec une densité de marquage plus forte localisée dans les régions cérébrales impliquées dans la motricité et la mémoire [Laux et al., J. Comp. Neurol., 519(12) : 2390-416, 2011 ; Charron et al., Brain, PMID : 21742735, 2011] [11, 12].

Il est en outre connu de l'art que plusieurs pathologies sont associées à une augmentation des taux de morphine endogène ou de ses dérivés par rapport à la normale. Il s'agit par exemple de la maladie de Parkinson, l'anorexie, la boulimie, l'alcoolisme, la schizophrénie, les infections septiques, les stress chirurgicaux, le zona, ou encore le stress lié au lipopolysaccharide (LPS) [Arun et al., Indian J. Med. Res., 107 : 231-238, 1998 ; Glattard et al., PLoS One, 1 : e8791, 2010 ; Goumon et al., Neurosci. Lett., 293 : 135-138, 2000 ; Lee et Spector, J. Pharmacol. Exp. Ther., 257 : 647-650, 1991 ; Madbouly et al., Br . J. Surg., 97 : 759-764, 2010 ; Marrazzi et al., Life Sci., 60 : 1741-1747, 1997] [20-25] .

En ce qui concerne un lien thérapeutique potentiel avec une diminution des taux de morphine endogène, différentes études ont montré que l'utilisation d'antagonistes des récepteurs opioïdergiques Mu inhibant les effets de la morphine endogène (naloxone, naltrexone) est bénéfique vis-à-vis de prurits cutanés, l'obésité, problèmes sexuels, l'alcoolisme, la schizophrénie et la maladie de Parkinson [Batki et al., Am. J. Addict., 16(4) : 253-259, 2007 ; Green et al., J. Subst. Abuse Treat., 34(1) : 61-71, 2008 ; Goodman et al., ChemMedChem. , 2(11) : 1552-1570, 2007 ; Meyer, J. Clin. Psychopharmacol., 28(6) : 722-723, 2008] [26- 29] .

En milieu hospitalier, le blocage de l'action des opiacés (codéine, morphine, héroïne, oxycodone, etc..) lors de sevrage, d'overdose ou d' addiction est réalisé par injection d'antagonistes non spécifiques (i.e., naloxone, naltrexone, etc..) des récepteurs opioïdergiques (Mu, Delta, Kapa) . Cette démarche a pour inconvénient de bloquer tous les types de récepteurs opioïdes mais également l'action des alcaloïdes et des opioïdes endogènes (i.e. peptides incluant la β- endorphine, les endomorphines , etc..) sur leurs récepteurs, ce qui provoque de nombreux effets secondaires et en particulier une hyperalgésie, des œdèmes pulmonaires et des arythmies cardiaques [Van Dorp et al., Expert Opin. Drug Saf., 6(2) : 125-32, 2007] [19]. L'idéal serait donc d'identifier des molécules capables de lier et bloquer spécifiquement l'action des opiacés sans agir sur leurs récepteurs.

La liaison de la morphine ou de ses dérivés à des protéines a déjà été décrite [Misra et al., Nature, 232 : 48-50, 1971 ; Mullis et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 208 : 228-231, 1979 ; Nagamatsu et al., Drug Metab. Dispos., 11 : 190-194, 1983 ; Olsen et al., Clin. Pharmacol. Ther., 17(6) : 677-684, 1975] [19-22]. En effet, la morphine a été caractérisée pour se lier faiblement à la sérum albumine, ainsi que l'alpha-1- glycoprotéine acide [Leow et al., Ther. Drug Monit., 15(5) : 440-447, 1993] [23], et il a récemment été décrit que la protéine de liaison de la phosphatidyléthanolamine (la phosphatidylethanolamine- binding protein, PEBP) était capable de lier uniquement la M6G et la M3G à faible affinité, mais ne possédait aucune affinité pour la morphine [Atmanene et al., Med. Sci. Monit., 15 : BR178-187, 2009; Goumon et al., J. Biol. Chem., 281(12) : 8082-9, 2006] [13, 16]. D'autres études ont indiqué qu'une protéine de 50-53kDa pouvait spontanément lier la morphine radioactive de manière covalente (protéine non caractérisée, sans mise en évidence biochimique) [Nagamatsu et Hasegawa, Biochem. Pharmacol., 43 : 2631-2635, 1992] [14]. Il a également été décrit que cette liaison morphine-protéine était diminuée en présence de sélénium [Nagatmasu et Hasegawa, Drug Chem. Toxicol., 16 : 241-253, 1993] [15] .

Il existe donc un réel besoin de mettre en évidence des molécules susceptibles de lier et bloquer spécifiquement l'action des opiacés, notamment de la morphine et de ses dérivés, sans passer par un blocage des récepteurs opioïdes, palliant les défauts, inconvénients et obstacles de l'art antérieur, et d'améliorer ainsi la prise en charge des sevrages, overdoses ou addictions ou pathologies addictives, notamment associés aux opiacés, tout en réduisant leurs coûts . Description de l'invention

Les Inventeurs ont été les premiers à avoir observé que bien qu'un fort immunomarquage soit retrouvé dans des tissus suggérant la présence de grandes quantités de morphine endogène, seuls des traces d' opioïdes sont retrouvés dans les tissus et fluides lorsque lesdits opioïdes sont extraits à l'aide de protocoles utilisant des étapes de précipitation protéique. Ils ont, à partir de cette observation, émis l'hypothèse que la morphine endogène, mais également la morphine exogène, pourrait a priori former des complexes avec des protéines dans le sang et les tissus.

Les Inventeurs ont alors mis en évidence de manière tout à fait inattendue des complexes alcaloïdes- créatine kinase B (CK-BB) de très haute affinité, non covalents. Ces complexes, qui peuvent être détectés par Western blot dans des conditions particulières utilisant un anticorps anti-morphine, sont résistants aux détergents, agents réducteurs et traitements à la chaleur. Les traitements à la naxolone, naltrexone, ainsi qu'à l'urée suivis d'un chauffage, dissocient ces complexes opiacé-créatine kinase B. Ils ont en outre mis en évidence que des complexes similaires peuvent être formés entre les alcaloïdes et la créatine kinase M (musculaire) .

La présente invention a donc pour objet une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une addiction ou d'une pathologie addictive, et des souffrances résultant de ladite addiction ou pathologie addictive, ou de pathologies ayant une élévation des taux de morphine endogène.

Ainsi, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une créatine kinase ou d'un dérivé de celle-ci comme médicament ou pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une addiction ou d'une pathologie addictive, et des souffrances résultant de ladite addiction ou pathologie addictive, ou de pathologies ayant une élévation des taux de morphine endogène.

Selon l'invention, il s'agit en particulier d'une addiction ou d'une pathologie addictive associée aux opiacés, de préférence aux opiacés endogènes ou exogènes naturels de l'opium, plus préférentiellement à la morphine et ses dérivés.

Par « créatine kinase » au sens de la présente invention, on entend la CK-MM présente dans les muscles, la CK-MB trouvée dans les cellules myocardiaques , la CK-BB qui se trouve dans le cerveau et la mtCK ( sarcomérique et ubiquitaire) qui se trouve dans les mitochondries des cellules de mammifère, ainsi que les monomères de CK (CK-B et CK-M) .

Par « dérivés de la créatine kinase » au sens de la présente invention, on entend des fragments de la créatine kinase ou tout fragment ayant une séquence en acides aminés identiques, proches ou modifiés (e.g. « rétro inverso » résistants à la protéolyse) et conservant la capacité de lier les opiacés. Par exemple, il peut s'agir de fragments C-terminaux de la créatine kinase conservant la capacité de lier les opiacés .

Par « addiction » au sens de la présente invention, on entend une pathologie chronique à évolution progressive caractérisée par un attachement nocif à une substance addictive telle que l'alcool, la nicotine, les alcaloïdes, etc. Par « pathologie addictive » au sens de la présente invention, on entend toute pathologie associée à une augmentation du taux de substance addictive telle que l'alcool, la nicotine, les alcaloïdes, etc. par rapport aux taux normaux. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation du taux de morphine endogène et/ou de ses dérivés par rapport au taux normaux, par exemple, dans la maladie de Parkinson, l'anorexie, la boulimie, l'alcoolisme, la schizophrénie, les infections septiques, les stress chirurgicaux, ou encore le stress lié au lipolysaccharide (LPS) et toutes autres pathologies impliquant les opiacés endogènes et/ou exogènes .

Par « opiacés » au sens de la présente invention, on entend des molécules chimiques endogènes ou exogènes qui agissent en se liant aux récepteurs opioïdes, qui se trouvent principalement dans le système nerveux central et périphérique et le tractus gastro¬ intestinal. Par exemple, il s'agit des alcaloïdes (exogènes) naturels de l'opium tels que la morphine et ses dérivés (e.g. codéine, thébaïne) , des opiacés semi- synthétiques créés à partir des opiacés naturels (e.g. hydromorphone, désomorphine, nicomorphine, dipropanoylmorphine, benzylmorphine, éthylmorphine, buprénorphine) , des opiacés entièrement de synthèse (e.g. fentanyl, péthidine, méthadone, tramadol, dextropropoxyphène) , des opioïdes endogènes peptidiques produits naturellement dans le corps (e.g. endorphines, enképhalines , dynorphines, endomorphines ) , ainsi que leur dérivés peptidiques synthétiques ou semi- synthétiques . La présente invention a encore pour objet une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci comme médicament de capture des opiacés, de préférence des opiacés endogènes ou exogènes naturels de l'opium, plus préférentiellement de la morphine et de ses dérivés, dans les tissus (e.g. cérébral, hépatique, pulmonaire) ou fluides corporels humain ou animal, et ainsi permet de diminuer leur taux circulant.

Le médicament peut être sous toute forme qui peut être administrée à un animal ou à un humain. L'administration peut être réalisée directement, i.e. sous forme pure ou sensiblement pure, ou après mélange du principe actif (créatine kinase ou un dérivé de celle-ci) avec un véhicule et/ou un milieu pharmaceutiquement acceptable. Le médicament peut par exemple être destiné à une administration par voie orale (formulation liquide e.g. solution, sirop, suspension, émulsion, gouttes ; forme effervescente e.g. comprimé, granulé, poudre ; poudre orale ou système de multiparticules e.g. bille, granulé, mini comprimé et microgranule ; forme orodispersible e.g. comprimé orodispersible, cachet lyophilisé, pellicule mince, comprimé à croquer, comprimé et capsule, chewing-gum médical) , une administration par voie buccale ou sublinguale (e.g. comprimé buccal ou sublingual, préparation muco-adhésive, pastille, goutte oro-muqueuse, spray) , ou une administration par voie parentérale (e.g. solution injectable).

La présente invention a encore pour objet une composition pharmaceutique pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une addiction ou d'une pathologie addictive, comprenant une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci à titre de principe actif et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Il peut s'agir en particulier d'une addiction ou d'une pathologie addictive associée aux opiacés, de préférence aux alcaloïdes naturels de l'opium, plus préférentiellement à la morphine et ses dérivés, ou encore aux alcaloïdes naturels endogènes, de préférence la morphine endogène et ses dérivés.

La présente invention a encore pour objet un procédé d'analyse d'opiacés dans un échantillon comprenant :

a) la mise en contact dudit échantillon avec une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci; et

b) la détection des éventuels complexes formés entre ladite créatine kinase ou ledit dérivé de celle- ci et au moins un opiacé présent dans l'échantillon.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé d'analyse peut comprendre en outre une étape c) dans laquelle les résultats de détection obtenus à l'étape b) sont comparés par rapport à un contrôle négatif et/ou positif.

Par « contrôle positif » et « contrôle négatif » au sens de la présente invention, on entend un échantillon témoin respectivement comprenant ou ne comprenant pas au moins un opiacé. Ce témoin permet de comparer le résultat de détection obtenu à l'étape b) du procédé de l'invention et de déceler un faux positif ou faux négatif, le cas échéant.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé d'analyse peut comprendre en outre une étape cbis ) dans laquelle les résultats de détection obtenus à l'étape b) sont comparés à un étalon de mesure ; ce qui permet une analyse qualitative et/ou quantitative des opiacés .

Par « étalon de mesure » au sens de la présente invention, on entend une ou plusieurs analyse (s) réalisée (s) sur des solutions fabriquées pour les besoins de l'analyse selon l'invention comprenant une teneur connue en opiacé (s) . A partir des résultats d'analyse obtenus sur ces solutions fabriquées, il est possible de déterminer la présence d'opiacé (s) dans l'échantillon et même sa (leur) concentration par comparaison, par exemple au moyen d'une courbe étalon réalisée à partir des étalons de mesure.

Selon l'invention, les étapes c) et cbiS ) peuvent être mises en œuvre toutes les deux, avant, pendant ou après les étapes a) et b) du procédé de l'invention. Selon l'invention, les étapes c) et cbiS ) peuvent être mises en œuvre simultanément ou successivement, y compris aux étapes a) et b) , par exemple sur une plaque multipuits permettant de réaliser simultanément ou successivement plusieurs analyses, y compris des mesures étalons.

Les procédés d' analyse d' opiacés selon la présente invention, servent à analyser par exemple les alcaloïdes naturels endogènes ou exogènes, par exemple la morphine ainsi que ses dérivés. Pour ce faire, la créatine kinase ou un dérivé de celle-ci peut être marqué (e) , par exemple par marquage fluorescent, radioactif, etc.... La détection est alors réalisée par tout type de système approprié connu de l'art.

La présente invention a encore pour objet un kit d' analyse d' opiacés comprenant une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci et les moyens de détection des complexes formés entre ladite créatine kinase ou ledit dérivé de celle-ci et au moins un opiacé. Les moyens de détection sont par exemple les marquages précités.

La présente invention a encore pour objet l'utilisation d'une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci dans un procédé de filtration d'un fluide corporel pour la capture d'opiacés.

Par « fluide corporel » au sens de la présente invention, on entend par exemple la salive, l'urine, le sang, le liquide céphalorachidien, etc.

La présente invention a encore pour objet un dispositif de capture d'opiacés en présence d'une créatine kinase ou d'un dérivé de celle-ci, dans les tissus (e.g. biopsie cérébrale, hépatique, pulmonaire) ou les fluides corporels (e.g. salive, urine, sang, liquide céphalorachidien) .

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le dispositif peut consister en un système de dialyse d'un fluide corporel, de préférence de dialyse rénale, hépatique, péritonéale, du sang ou d' hémodialyse . Par exemple ledit systèmes de dialyse peut comprendre un premier circuit comprenant de la créatine kinase, qui entre en contact avec le fluide corporel à traiter à travers une ou plusieurs membranes ou filtres chargé (e) s de récupérer la créatine kinase une fois complexée aux opiacés. Le second circuit comprend un système pour décomplexer la créatine kinase avant qu'elle ne soit remise en circulation dans le premier circuit. Un autre exemple de système de dialyse peut comprendre un circuit avec une membrane ou un filtre identique à celui utilisé ci-dessus dans lequel le fluide corporel à traiter circule. L'autre côté de la membrane ou du filtre est parcouru par une solution de créatine kinase circulant à contre courant et qui est éliminée après son passage dans la membrane ou le filtre .

Ce dispositif trouve par exemple une utilité dans la détoxification des fluides corporels, par exemple pour le traitement d'un patient comprenant des doses élevées d'opiacé (s).

D' autres avantages pourront encore apparaître à l'homme du métier à la lecture des résultats expérimentaux obtenus à partir des protocoles décrits dans les exemples ci-dessous mis en œuvre par les inventeurs, et illustrés de manière non limitative par les figures annexées.

Brève description des figures

La figure 1 représente la réaction enzymatique catalysée par la créatine kinase.

La figure 2 représente la voie de synthèse putative de la morphine endogène chez les mammifères d'après [3] .

La figure 3 représente (A) 1 ' immunoréactivité observée pour les alcaloïdes dans des extraits de cerveau de souris à l'aide de 5 anticorps anti-morphine différents par Western blot, (B) les effets des différents tampons et traitements thermiques sur la dissociation du complexe « molécules de type morphine / protéine » par Western blot, (C) La disparition de 1 ' immunoréactivité pour les alcaloïdes après traitement des membranes de transfert avec un tampon contenant de l'urée et traitement thermique, (D) le remplacement de l'alcaloïde immunoréactif lié à la protéine de 42kDa complexée aux molécules de type morphine par la naloxone .

La figure 4 représente (A) 1 ' immunodétection de la protéine complexée aux molécules de type morphine après gel bidimensionnel , (B) localisation des protéines liant les alcaloïdes sur le gel bidimensionnel correspondant coloré au nitrate d'argent (rectangles), (C) l'effet de l'urée et de la température sur la créatine kinase BB et 1 ' immunoréactivité pour les alcaloïdes et la créatine kinase BB humaine, (D) l'effet de la naloxone sur la créatine kinase BB humaine .

EXEMPLES EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES

Anticorps

Les anticorps monoclonaux murins anti-morphine 6D6 et 3A6 (Aviva System Biology, réf : 16002 et AMM00033 respectivement, San Diego, USA) ont été produits en utilisant un conjugué ( ( 5-alpha- 6-alpha) -7-8-didéhydro- 4-5-époxy-17méthylmorphinan-3-5-diol ) -BSA.

L'anticorps polyclonal de mouton ABD6330-0004 a été obtenu vis-à-vis de la 3- (O-carboxyméthyl ) morphine conjuguée à 1 ' hémocyanine de patelle (AbD Serotec, Oxford, UK) . L'anticorps polyclonal de mouton ABD6330- 0014 a été obtenu après immunisation avec de la morphine conjuguée à 1 ' hémocyanine de patelle. L'anticorps de chèvre anti-morphine G61 a été fourni par le Pr. R. Hain (Cardiff School of Medicine, University Hospital of Wales, Cardiff, UK) .

L'anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la créatine kinase B (CK-BB ; ABCAM92452) a été obtenu vis-à-vis de la partie C-terminale de la CK-BB humaine.

Western blot

Les protéines ont été séparées sur gels SDS-PAGE (10% acrylamide Criterion XT ; tampon de migration XT- MOPS ; BioRad, Marnes-la-Coquette, France) . Les échantillons ont été suspendus dans 15μ1 de différent tampon de charge TPx :

Tampon de charge 1 (TPI) : 30mM Tris HC1 pH6.8, 0,5% SDS, 5mM EDTA, 2% glycérol, 0,5% β- mercaptoéthanol , et 0,05% de bleu de bromophénol.

Tampon de charge 2 (TP2) : 125mM Tris HC1 pH6.8, 2% SDS, 5mM EDTA, 5% glycérol, 50mM DTT, et 0,05% de bleu de bromophénol.

Tampon de charge 3 (TP3) : lOmM Tris HC1 pH8, 3%

SDS, ImM EDTA, 2,5% glycérol, 5mM DTT, et 0,05% de bleu de bromophénol.

Tampon de charge 4 (TP4, tampon dodécylsulfate de lithium) : 250mM Tris HC1 pH8,5, 2% tampon dodécylsulfate de lithium (LDS ) , 0,5mM EDTA, 10% glycérol, 0,075% de bleu de coomassie G250, 0,025% de rouge phénol, Agent de réduction XT (BioRad) .

Tampon de charge 5 (TP5, tampon urée) : 60mM Tris HC1 pH6.8, 2% SDS, 4M urée, 5mM EDTA, 5% glycérol, 1% β-mercaptoéthanol .

Les échantillons re-suspendus dans les tampons de charge ont été soumis on non à un traitement à la chaleur (100°C) pendant 0, 5, 10 ou 15 minutes avant leur dépôt sur gel. Après la migration, les protéines ont été électrotransférées sur membrane polyvinyldifluorène (GE Healthcare Bioscience) [Goumon et al., J. Biol. Chem., 281(12) : 8082-8089, 2006] [16] . La membrane a été traitée pendant 30 minutes avec une solution saturante (PBS supplémenté avec 3% de BSA et 0,05% de Tween 20) . Puis, les anticorps primaires ont été incubés lh avec la dilution suivante dans du PBS supplémenté avec 3% de BSA et 0,05% de Tween 20 : (1) anticorps monoclonal murin 6D6, dilution au 1 :4000 ; (2) anticorps monoclonal murin 3A6, dilution au 1 :2000 ; (3) anticorps polyclonal de mouton ABD6330-0004, dilution au 1 :500 ; (4) anticorps polyclonal de mouton ABD6330-0014, dilution au 1 :500 ; (5) anticorps de chèvre anti-morphine G61, dilution au 1 :500; anticorps de lapin anti-CK-BB, dilution au 1 :3000.

L' immunoréactivité a été révélée en utilisant soit 1' antisérum d'âne anti-souris conjugué à HRP (P.A.R.I.S. ; 1 :50000 dans le même tampon) ou 1' antisérum d'âne anti-mouton conjugué à HRP (P.A.R.I.S. ; 1 :30000 dans le même tampon) ou 1' antisérum d'âne anti-chèvre conjugué à HRP (P.A.R.I.S. ; 1 :30000 dans le même tampon) ou 1' antisérum d'âne anti-lapin conjugué à HRP (P.A.R.I.S. ; 1 :50000 dans le même tampon) . Kit Supersignal West Femto (Pierce, Rockford, USA) ou substrat Luminata™ Forte Western HRP (Millipore, Molsheim, France) . La liaison non-spécifique de chaque anticorps secondaire a été testée en omettant l'anticorps primaire, et il n'a été montré aucun marquage non-spécifique.

Mesures de dissociation

Des extraits de cerveau ont été soumis à différents traitements afin d'observer la dissociation des complexes créatine kinase B - alcaloïdes.

20 g d'extrait de cerveau ou 2μg de créatine kinase B native humaine (Fitzgerald 30-AC55) ont été incubés 12h, à 37°C, en présence de naxolone (ratio 1 :1, m/m ; Sigma Aldrich) , dans un volume final de 40μ1 (dilué dans 1 ' eau) .

Digestion en gel et analyse par spectrométrie de masse La digestion en gel et les analyses par spectrométrie de masse ont été réalisées sur un CapLC (Waters, http : //www . waters . corn) couplé à un spectromètre de masse en tandem à temps de vol orthogonal quadrupolaire hybride (Q-TOF 2, Waters).

Identification des protéines

Les données MS et MS/MS ont été analysées en utilisant un serveur local Mascot (MASCOT 2.0 ; Matrixscience, http : //www . matrixscience . corn) par rapport à une base de données de cible leurre composite, incluant les séquences protéiques UniProt de Viridiplantae (554832 séquences ; Janvier 2009), de kératines humaines, de trypsine porcine et de toutes les séquences inverses correspondantes (1109972 entrées au total) . Les recherches ont été réalisées avec une tolérance de masse de 250ppm en mode MS et 0,4Da en mode MS/MS pour les données nanoLC-MS/MS . Un clivage raté par peptide a été autorisé et des modifications variables ont été prises en compte, tel que la carbamidométhylation de la cystéine, l'oxydation de la méthionine et la N-acétylation (protéine N-ter) .

Aucune contrainte de poids moléculaire de la protéine ni de point isoélectrique n'a été appliqué. Les résultats Mascot ont été chargés en mode MuDPIT dans SCAFFOLD (logiciel Proteome, http : //www . proteomesoftware . corn) . Les résultats ont été soumis aux critères de filtration suivants. Pour l'identification des protéines avec deux peptides ou plus, un score ionique Mascot de plus de 25 a été requis. Dans le cas de collisions à peptide unique, le score du peptide unique doit être plus élevé (« score de différence » minimal de 0) que le seuil de signification Mascot de 95%. La recherche d'une base de données de cible leurre permet de contrôler et d'estimer le taux d'identification de faux positifs de l'étude [Peng et al., J. Proteome Res., 2(1) : 43-50, 2003 ; Elias et Gygi, Nat . Methods, 4(3) : 207-214, 2007] [17, 18] . Ainsi, le catalogue final de protéines présente un taux de faux positifs estimé à 1%.

EXEMPLE 2 : IDENTIFICATION DE COMPLEXES « MOLECULES DE TYPE MORPHINE / PROTEINE » PAR WESTERN BLOT

Immunodétection de complexes « molécules de type morphine / protéine »

Afin de déterminer si un immunomarquage de type morphine pouvait être détecté dans le cerveau de souris, une immunoréactivité pour la morphine et/ou ses dérivés (M6G, M3G, codéine, normorphine et norcodéine) a été testée dans un extrait de cerveau de souris. Pour ce faire des extraits de cerveau (lC^g) ont été resuspendus dans un tampon de charge contenant du SDS et du β-mercaptoéthanol (tampon de charge contrôle, TPI) . Les échantillons n'ayant pas été soumis à un traitement thermique (100°C, 10 minutes) ont été déposés sur SDS-PAGE et le gel a été transféré sur une membrane PVDF. L' immunodétection a été réalisée avec 8 anticorps différents (différents quant à l'espèce de l'hôte, l'aptène, la chimie) . Ces anticorps sont non seulement spécifiques de la morphine mais présentent également des réactions croisées avec certains de ses dérivés .

Les résultats montrent que 5 anticorps anti- morphine parmi les 8 testés détectent une seule bande à 40-45kDa (pistes 1 à 5, figure 3A) .

Ensemble, ces résultats suggèrent que le marquage « de type morphine » est présent dans les extraits de cerveau, et peut correspondre à des alcaloïdes liés à une seule protéine cérébrale. En outre, ces complexes sont résistants au SDS et au β-mercaptoéthanol (i.e., conditions d' électrophorèse SDS-PAGE), suggérant la présence de complexes d'affinité élevée. Dissociation des complexes par différents tampons de charge

Afin de déterminer si des complexes d'affinité élevée existaient entre les alcaloïdes endogènes et une protéine, des homogénats de cerveau (20μg) ont été déposés sur gels de polyacrylamide en présence de différents tampons de charge (TPI, TP2, TP3, TP4, TP5) contenant du SDS ou du LDS, des agents réducteurs ( β- mercaptoéthanol ou DTT) , ou des agents chaotropes (urée) , à température ambiante (RT) et sous condition d'ébullition (5 ou 10 minutes à 100°C) . Après transfert, le marquage de type morphine a été mis en évidence avec l'anticorps anti-morphine 6D6 (Aviva Biosciences) .

Les résultats montrent que sans traitement à la chaleur (RT, figure 3B) , aucun des tampons de charge n'a dissocié le complexe (i.e., présence d'une bande à 40-45kDa) . Après l'application d'un traitement thermique de 10 minutes (100°C), une diminution significative de 1 ' immunomarquage de type morphine a été observée seulement pour le tampon de charge contenant du LDS (TP4), alors que le marquage de type morphine a totalement disparu pour le tampon de charge contenant de l'urée (TP5) .

Ensemble, ces résultats montrent que des complexes de forte affinité impliquant un composé de type morphine sont dissociés uniquement en présence du tampon de charge TP5 (urée) associé à un traitement thermique. Fait intéressant, les tampons urée sont souvent utilisés pour dissocier des complexes protéine- protéine. Aucune dissociation n'est observée pour les tampons 2 et 3 (données non présentées) .

Des expérimentations complémentaires, réalisées en parallèle sur un marqueur du cerveau (chromogranine A, CGA) et des gels colorés à l'argent, n'ont présenté aucune diminution de 1 ' immunoréactivité ou de la quantité totale de protéines (données non présentées) . En outre, le fait que 1 ' immunomarquage observé sous la condition « contrôle » (tampon de charge TPI ne contenant ni LDS ni urée, figure 3B, fenêtre gauche) n'a présenté aucune diminution significative du marquage de type morphine confirme que la perte du marquage n'est pas due à la dégradation par la chaleur des protéines.

Dissociation des complexes sur membrane de transfert

Afin de déterminer si un tel marquage pouvait être réversé après des traitements sur membrane de transfert PVDF, une analyse par Western blot a été réalisée sur un extrait de cerveau de souris (2C^g, tampon de charge urée TP5 sans traitement thermique) . Le gel résultant a été transféré sur une membrane PVDF, puis celle-ci a été incubée 30 minutes à 100°C dans l'eau ou l'urée 2M supplémenté avec 0,5% de triton X100. Après immunomarquage avec l'anticorps 6D6, les lignes correspondant à l'incubation avec l'eau (RT et 100°C pendant 30 minutes) , ne présentent aucune diminution de 1 ' immunoréactivité de type morphine (données non présentées) . Fait intéressant, alors que la piste traitée avec le tampon urée à température ambiante montre la présence d'une bande à 40-45kDa (piste « - », figure 3C) , la membrane correspondante soumise au traitement thermique montre une disparition complète du marquage de l'alcaloïde (piste « + », figure 3C) .

Ensemble, ces résultats montrent, comme pour le tampon de charge, que la diminution du marquage de type morphine a été induit par l'urée associé à un traitement thermique. Cela suggère qu'un alcaloïde est lié avec une affinité élevée à une protéine présente dans le cerveau de souris. La diminution de marquage n'est pas associée avec le traitement thermique dans la mesure où le marquage ne diminue pas pour des tampons ne contenant pas d'urée (données non présentées) .

Mesures de dissociation in vitro

Une récente étude sur la cartographie des alcaloïdes endogènes chez la souris a indiqué que l'anticorps anti-morphine 6D6 ne présentait pas de réaction croisée avec la naloxone (antagoniste du récepteur aux opioïdes Mu présentant une structure proche de celle de la morphine) en ELISA. Sur cette base, un test de compétition a été réalisé sur des extraits de cerveau afin de remplacer les molécules de type morphine avec les antagonistes non détectés par l'anticorps 6D6. Pour ce faire, les extraits de cerveau ont été incubés avec la naloxone pendant 12h à 37°C. Les échantillons ont été déposés sur un gel de polyacrylamide (tampon urée sans traitement thermique) et le transfert sur membrane a été révélé avec l'anticorps 6D6. Les incubations avec l'antagoniste (naloxone) ont diminué significativement le marquage alcaloïde par rapport aux expérimentations de contrôle (même incubation réalisée en absence d'antagoniste, figure 3D) .

Ensemble, ces résultats suggèrent que les molécules de type morphine ne sont pas liées de manière covalente à une protéine du cerveau murin, et que ces alcaloïdes peuvent être remplacés par un analogue synthétique de la morphine non immunodétecté par l'anticorps 6D6. EXEMPLE 3 : CARACTERISATION DE LA PROTEINE COMPLEXEE AUX MOLECULES DE TYPE MORPHINE

Identification protéomique de la protéine complexée aux molécules de type morphine

Afin d' identifier la protéine liant les molécules de type morphine endogènes, une approche protéomique a été réalisée. Pour ce faire, 125 g d'extrait de cerveau de souris ont été soumis à une isoélectrofocalisation, puis séparés sur SDS-PAGE. Deux expérimentations ont été réalisées en parallèle : (i) une coloration à l'argent du gel et (ii) un transfert suivi d'un Western blot utilisant l'anticorps 6D6.

Les résultats de Western blot montrent la présence de deux spots immunoréactifs à 40-45kDa et à des pHi de 6,1 et 6,9 (figure 4A) . Les spots correspondants (figure 4B, cf. encadrements) présents dans le gel coloré à l'argent ont été digérés par la trypsine et analysés par spectrométrie de masse tandem (ou MS-MS) , et ont mis en évidence la présence de la créatine kinase B murine dans les deux spots (40 et 60% de la couverture ; 42kda) .

La présence de deux spots immunoréactifs est probablement due à la présence d'une modification post- traductionnelle conduisant à un changement de pHi .

Ces résultats indiquent que la créatine kinase B est liée au ligand de type morphine endogène.

Dissociation des complexes « molécules de type morphine / créatine kinase BB humaine »

De la créatine kinase BB purifiée de cerveau humain commerciale (CK-BB, réf. 30-AC55, Fitzgerald Industrie International, forme active) a été testée pour son immunoréactivité de type morphine en utilisant l'anticorps 6D6. Pour ce faire, 2μg de créatine kinase BB humaine ont été déposés sur SDS-PAGE, puis transférés sur membrane traitée par l'anticorps 6D6. La créatine kinase BB de cerveau humain a présenté deux bandes immunoréactives vis-à-vis des molécules de type morphine à 42 et 84 kDa correspondant au monomère et dimère de la créatine kinase BB, respectivement (données non représentées) . Un résultat identique a été observé pour la CK-M (CK-M, réf. C3755, Sigma Aldrich ; données non présentées) .

La dissociation de la molécule de type morphine de la créatine kinase BB (dépôt 0,5μg sur gel) traitée en présence d'urée (TP5) associé ou non à un traitement thermique (100°C, 10 minutes), a été testée et immunodétectée par Western blot à l'aide de l'anticorps anti-morphine 6D6. Les résultats montrent que, comme pour la CK-M (Sigma Aldrich, C3755) et les extraits de cerveau de souris, 1 ' immunomarquage de type morphine est perdu seulement lorsque le complexe a subi les traitements thermique associés à de l'urée (piste 6D6 + vs -, figure 4C) .

Une expérimentation parallèle utilisant un anticorps dirigé contre la partie C-terminale de la créatine kinase BB (réf. ab92452, ABCAM) a été réalisée sur les mêmes échantillons.

Les résultats montrent que, de manière surprenante, 1 ' immunoréactivité de la créatine kinase BB est faible lorsque la protéine a seulement été traitée à l'urée (piste CKB « - », figure 4C) , mais a augmenté après le traitement thermique (piste CKB « + », figure 4C) , suggérant que l'anticorps anti-créatine kinase BB a reconnu un épitope C-terminal de la créatine kinase B auquel était initialement liée la molécule de type morphine. Le traitement thermique en présence du tampon urée TP5 a donc permis le déplacement de l'alcaloïde et a ainsi laissé l' épitope libre pour la liaison de l'anticorps anti-créatine kinase BB . Le même résultat a été obtenu lorsque l'expérimentation a été réalisée sur une membrane PVDF traitée avec le tampon urée associé à un traitement thermique (données non présentées) . Les mêmes résultats ont été obtenus en utilisant de la CK-M de lapin, et des extraits de cerveau de souris (données non présentées) .

Ensemble, ces résultats montrent que les créatines kinases BB et MM natives sont complexées à une molécule de type morphine. Cette association a certainement résulté d'un complexe d'affinité élevée et de la purification douce qui s'est faite afin de conserver l'activité enzymatique de la créatine kinase.

Effet d'un antagoniste de la morphine sur la créatine kinase BB humaine et 1 ' immunoréactivité pour les alcaloïdes

Afin de confirmer que la molécule de type morphine est liée à la créatine kinase BB, la protéine (^g) a été incubée ou non avec la naloxone pendant 12h à 37 °C. Les échantillons ont été déposés sur gel de polyacrylamide (tampon urée TP5, sans traitement thermique) puis transférés sur membrane qui a été révélée par la suite avec l'anticorps 6D6.

Les résultats montrent que les incubations avec la naloxone (non détectée par l'anticorps anti-morphine 6D6) ont diminué de manière significative le marquage alcaloïde (= molécule de type morphine) par rapport aux expérimentations contrôles (la même incubation réalisée en absence d'antagoniste ; figure 4D) . En revanche, 1 ' immunoréactivité réalisée en parallèle sur les mêmes échantillons avec l'anticorps anti-CK-BB n'est pas modifiée, car la naloxone a remplacé l'alcaloïde initialement lié (données non présentées) .

Ces résultats suggèrent que les molécules de type morphine ne sont pas liées de manière covalente à la créatine kinase BB, et que ces alcaloïdes (molécules de type morphine) peuvent être remplacés par un analogue de la morphine qui n'est pas détecté par l'anticorps anti-morphine utilisé. Des résultats identiques ont été observés pour la créatine kinase MM de lapin (données non présentées)

L'ensemble des résultats montrent que la créatine kinase B et la créatine kinase M lient fortement, de manière non covalente, la morphine et/ou ses dérivés peut être au niveau de sa région C-terminale, et que la présence de ce ligand diminue 1 ' immunoréactivité pour la créatine kinase B et la créatine kinase M. (anticorps anti-partie C-terminale de la créatine kinase) Cependant, on ne peut pas exclure que d'autres portions de la créatine kinase lient également les alcaloïdes. En effet, il semble que l'épitope reconnu par l'anticorps anti-créatine kinase est en partie masqué par les alcaloïdes liés. La dissociation des alcaloïdes libère le site de reconnaissance de l'anticorps anti-créatine kinase. D'autre part, les expériences montrent que la perte d' immunodétection pour la morphine et/ou ses dérivés n'est pas dépendante d'une dégradation des protéines, mais est bien due à la dissociation des alcaloïdes lors d'un traitement thermique en présence d'urée.

Listes des références

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REVENDICATIONS

1) Créatine kinase ou dérivé de celle-ci pour la prévention ou le traitement d'une addiction ou d'une pathologie addictive associée aux opiacés.

2) Créatine kinase ou dérivé de celle-ci selon la revendication 1, où les opiacés sont des alcaloïdes naturels de l'opium.

3) Créatine kinase ou dérivé de celle-ci selon la revendication 2, où les alcaloïdes naturels de l'opium sont la morphine et ses dérivés. 4) Créatine kinase ou dérivé de celle-ci selon la revendication 1, où les opiacés sont des alcaloïdes naturels endogènes, de préférence la morphine endogène et ses dérivés. 5) Créatine kinase ou dérivé de celle-ci pour son utilisation comme médicament de capture des opiacés.

6) Composition pharmaceutique pour une utilisation dans la prévention ou le traitement d'une addiction ou d'une pathologie addictive associée aux opiacés, comprenant une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci à titre de principe actif et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 7) Composition pharmaceutique selon la revendication 6, où les opiacés sont des alcaloïdes naturels de l'opium. 8) Composition pharmaceutique selon la revendication 7, où les alcaloïdes naturels de l'opium sont la morphine et ses dérivés.

9) Composition pharmaceutique selon la revendication 6, où les opiacés sont des alcaloïdes naturels endogènes, de préférence la morphine endogène et ses dérivés.

10) Procédé d'analyse d'opiacés dans un échantillon comprenant :

a) la mise en contact dudit échantillon avec une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci ;

b) la détection des éventuels complexes formés entre ladite créatine kinase ou ledit dérivé de celle- ci et au moins un opiacé.

11) Procédé d'analyse selon la revendication 10, ledit procédé comprenant en outre une étape c) dans laquelle les résultats de détection obtenus à l'étape b) sont comparés par rapport à un contrôle négatif et/ou positif. 12) Procédé d'analyse qualitative et/ou quantitative d'opiacés dans un échantillon comprenant : a) la mise en contact dudit échantillon avec une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci ;

b) la détection des éventuels complexes formés entre ladite créatine kinase ou ledit dérivé de celle- ci et au moins un opiacé. c) la comparaison des résultats de détection obtenus à l'étape b) par rapport à une courbe étalon.

13) Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, où les opiacés détectés sont choisis parmi les alcaloïdes naturels exogènes ou endogènes, de préférence la morphine et ses dérivés.

14) Procédé d'analyse selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, où ladite créatine kinase ou ledit dérivé de celle-ci est marqué (e) .

15) Kit d'analyse d'opiacés comprenant une créatine kinase ou un dérivé de celle-ci, et les moyens de détection des complexes formés entre ladite créatine kinase ou ledit dérivé de celle-ci et au moins un opiacé .

16) Utilisation d'une créatine kinase ou d'un dérivé de celle-ci dans un procédé in vitro de filtration d'un fluide corporel pour la capture d' opiacés .

17) Utilisation d'une créatine kinase ou d'un dérivé de celle-ci selon la revendication 16, où le fluide corporel est choisi parmi l'urine, le sang et le liquide céphalorachidien .

18) Dispositif de capture d'opiacés caractérisé en ce qu'il comprend un système de dialyse d'un fluide corporel en présence d'une créatine kinase ou d'un dérivé de celle-ci.


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