Crohn's Disease-associated Autoantigen

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(12) ft 許協 力条 約 に基 づいて公 開された国際出願
(19) 世 界知 的所 有 権 機 関
国際事 務 局
(43) 国際公 開 日 (10) Il 際公 開番 号
2006 年5 月26 日(26.05.2006) PCT WO 2006/054806 Al
(51) 国際特 許 分類 (81) 定 国 (表 示のな い限 り、全 ての種 類 の国内保 護が
C12N 15/09 (2006.01) GOlN 33/53 (2006.01) 可能): AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR,
BW,BY,BZ, CA, CH, CN, Cの, CR, CU, CZ, DE, DK, DM,
(21) 国際出願 番 号: PCT/JP2005/021937 DZ, EC, EE, EG, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU,
ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LC, LK,
(22) 国際出願 日: 2005 年 11 月22 日(22.1 1.2005)
LR, LS, LT, LU, LV, LY, MA, MD, MG, MK, MN, MW,
(25) 国際出 MX, MZ, NA, NG, NI, Nの, NZ, のM, PG, PH, PL, PT, Rの
願 の言語: 日木語 ,
RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, SY, TJ, TM, TN, TR,
(26) 国際公 開の言語: 日木語 TT, TZ, UA, UG, U , UZ, VC, VN, YU, ZA, ZM, ZW
(30) 優 先権 子一タ (84) 指定 国 (表 示のな い限 り、全 ての種類 の広域保護が可
60/630,258 2004 年 11 月22 日(22.11.2004) US 能): ARIPO (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, D,
SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), -X ー ラ シ T (AM, AZ, BY,
(71) 出願 人 (米 国を除 < 全 ての指定 国について) 株 式 会
KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ヨ ー ロ ツ / i (AT, BE, BG,
社 ロ コ モ ジ ェン (LOCOMOGENE, INC.) [JP/JP]; 〒
CH, CY, CZ, DE, DK, EE, E , FI, FR, GB, GR, HU, IE,
1050001 東京 都港 区虎 ノ 門 4 - 1 - 1 虎 ノ 門パス ト
IS, IT, LT,LU, LV,MC, NL, PL, PT, Rの, SE, SI, SK, TR),
ラル本館 7 階 Tokyo (JP).
OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, Gの, GW, ML,
(72) 発 明者 およ び MR, NE, SN, TD, TG).
(75) 発 明者/ 出願 人 ( 米 国 につ いて の み) 奇 山 敏 男
(SAKIYAMA, Toshio) [JP几P]; 〒8900024 鹿 児 島県 鹿 添 付 公 開書
児 島市 明和 2 — 6 — 3 Kagoshima (JP).
(74) 理 人 :小林 浩 , 外 (KOBAYASHI,Hiroshi et al・); 〒 文字 コ ー ド及 び他 の略語 については、 定 期発行 される
1㎝0028 東京 都 中央 区八重洲 二丁 目8 番 7 号 福 岡 ピ 各PCTガゼ ツ トの巻 頭 に掲載 されている コ ー ドと略語
ル θ 階 阿部 ・井窪 ・片山法律 事務 所 Tokyo (JP). のガイ ダ ンス ノ ー ト を参 照 。
(54) Title: CROHN' S DISEASE-ASSOCIATED AUTOANTIGEN
(54) 発 明の名 称 ク ロ ー ン病 関連 自己抗 原
(57) Abstract: A di・agnosti・c marker f。r Crohn' s di・sease whi・ch contai・ns an anti・body agai・nst 1皿E4A protei・n or i・ts fragment
(UBE4A protei・n or the li・ke) and a di・agnosti・c reagent f。r Crohn' s di・sease whi・ch cont㎝・ns an anti・body agai・nst 1皿E4A protei・n or
the li・ke, or 1皿E4A protei・n or i・ts fragment. A method of j・udgi・ng whether 。r not a subj・ect suffers from Crohn' s di・sease whi・ch
comprises: (a) collecting a sample from the subject; (b) detecting the presence or absence of an antibody against a ubiquitination
factor E4A protei・n or i・ts fragment; and (。) j・udgi・ng as suffeπ・ng from Crohn' s di・sease i・n the case where the anti・body i・s detected i・n
th。sampl。.
(57) 要約 本 発 明は、1皿E4A タ ンパ ク質 又はその断片 (UBE4A タ ンパ ク質 等 に対 する抗体 を含 むク ロー ン病 診 断
マー カー及 び1皿E4A タ ンパ ク質等 に対 する抗体 又は1皿E4A タ ンパ ク質若 し はその断片含 むク ロー ン病 診 断試薬
で ある。 また、本 発 明は、被験者が ク ロー ン病 に罹 患 して いるかを診 断する方 法 等 で あって、(a) 前記被験者か ら
試 料 を採 取 し ; (b) 前記試 料 中に ピキチ ン化 因子 E4A タ ンパ ク質 又はその断片に対 する抗体 の有 無 を検 出 し 及
び (C) 前記試 料 中に前記抗体 が検 出された場 合 はク ロー ン病 で ある と診 断する こ とを含 む方法 で ある。

書圭
ク ロ ー ン 病 関連 自己抗原
技術分野
本発 明は、 ュビキチ ン化 因子 E4A タ ンパ ク 質又はその断片 に対する抗体 を
含 むク ロー ン病診 断マーカー及 び前記診 断マーカー を用 いた夕 口一ン病 の診
断又は予後 診 断方法 に関する 。
背景技術
夕 口一ン病 は、 消化 管 の炎 症性疾 患 で あ り 、 口か ら肛 門ま での消化 管 のい
かな る 部位 で も発 症 しぅ る が 、 主 と して回腸及 び結腸 で発症 する。 本疾 患 の
炎症 は通 常消化 管 で見 られる が 、皮膚 、 眼及 び関節 な どの炎症 も 見 られる こ
とが 報告 されている。 本疾 患 は、 再発及 び緩解する こ と が 知 られている。
般 的に、 夕 口一ン病 は免疫 系 調節 障害 によ り 発症 する 自 己免疫 疾 患 であ
る と考 え られている。 免 疫 系 の調節 障害 は、ク ロ ー ン病 の発 症機 序 の 中心 的
役 割 を果 たすと考 え られている が 、 ク ロ ー ン病 患者の持続 自りな炎 症反応 の明
確 な原 因は未 だに解 明 されていな い。
発 明の開示
本発 明は、 ュビキチ ン化 因子 E4A タ ンパ ク 質又はその断片 に対する抗 体 を
含 むク ロ ー ン病診 断マーカー及 びク ロ ー ン病 の診 断又は予後 診 断の方法 を提
供する こ と を 目的 とする。
本発 明者は、 ク ロ ー ン病 の診 断の試みと して、 ク ロ ー ン病 患者及び健常者
か ら採取 した血清 中のュビキチ ン化 因子の構成分子の ぅ ち、 ク ロー ン病 患者
及 び健 常者 を比 較 して変 化 している も のが あ る か否 かを検 討 した。 その結果
発 明者は、ュビキ チ ン化 因子に対する 自己抗 体 が ク ロ ー ン病診 断における有
用 なマーカーである こ と を見 出し、本発 明を完成する に至った。
すな わち、 本発 明は、 以 下の通 り である。

( ) ュビキ チ ン化 因子 E4A タ ンソく ク 質又 はその断片 に対する抗 体 を含 むク
ロ ー ン病診 断マーカー。
( 2 ) ュビキ チ ン化 因子 E4A タ ンパ ク 質又 はその断片 に対する抗 体 を含 むク
ロ ー ン病検 出試薬。
3 ) ュビキ チ ン化 因子 E4A タ ンパ ク 質又はその断片 を含 むク ロ ー ン病検 出
試薬。
( 4 ) 被験者 が 夕 口一ン病 に罹 患 している か否 かを検 出又は診 断する 方法 で
あって、 以 下の工程
a 前記被験者から試料 を採 取 し
b 前記試 料 中のュビキ チ ン化 因子 E4A タ ンパ ク 質又 はそ の断片 に対
する抗体 を検 出 し 及 び
c 前記試料 中に前記抗 体 が 検 出 さ れた場 合 に前記被 験 者が 夕 口一 ン病
である と診 断する こ と
を含 む前記方法。
( 5 ) ク ロ ー ン病 に罹 患 した患者 において前記疾 患 が 進行 している か否 かを
評価する方法 であって、以 下の工程
a 前記 患者か ら試料 を採 取 し
b 前記試料 申のュビキ チ ン化 因子 E4A タ ンパ ク 質又 はそ の断片 に対
する抗体 の抗体 量 を測定 し
c 程 (b) の測定結果 を、前記疾 患 の進行 と 関連 付 ける 工程
を含 む前記方法。
本発 明の好 ま しい態様 と して、 上記試料 は血清 、血液 、細胞 及 び組織 が 含
まれる が これ らに限定 さ れる も のではない。
図面の簡 単 な説 明
図 は、 BE4A に対する ク ロ ー ン病 (C D) 患者の血清反応 を示す写真で
ある。
図 2 は、組換 え E4A タ ンパ ク 質が 調製 されたこ と を示す写真である。
図 3 は、 E S A によ り 、C D 患者、 潰瘍性大腸炎 ( C 患者及 び健 常者

の血清 申の E4A 特異的 gG を定量 したグ ラ フである。
発 明 を実施 する ための最 良 の形態
以 下、 本発 明 を詳細 に説 明する。
なお、 本 明細書において引用 された全 ての先行技 術文献 およ び公 開公報 、
特許公報 その他 の特許文献 は、 参 照 と して本 明細書に組み込 まれる。
本発 明は、 ユ ビキチ ン化 因子 E4A タ ンパ ク 質又はその断片 に対する抗 体 を
含 むク ロ ー ン病 (C D) 診 断マーカー等及 び前記マーカ ー を用いたク ロー ン病
の診 断又は予後 診 断に関する。
ュ
・ 概 要
夕 口一ン病 は消化 管 の炎 症 性疾 患 を主な症 状 とする 自 己免疫 疾 患 で あ り 、
ク ロ ー ン病 の発症機 序 に免疫 系 の調節 障害が 深 く 関わっている。
本発 明は、 ユ ビキ チ ン化 因子 E4A BE4A を夕 口一ン病 における標 的 自
己抗原 と 同定 し、 ク ロ ー ン病 患 者 の血清 中のユ ビキ チ ン化 因子に対する 自己
抗体 が ク ロ ー ン病 診 断における 有用 なマーカー と な り ぅ る こ と を見 出 した こ
と によ り 完成 されたも のである。
自己抗 原 の分子的同定 は、 ク ロ ー ン病 の免疫 異常の解 明に役 立つ。 本 疾 患、
の標 的 自 己抗原 を同定 する ために、発 明者 は、 正常 ヒ ト回腸組織 を採 取 し、
ヒ トの典型 的な c A 発 現 ラ イ ブラ リ ー を作製 した。 そ こか ら、 発 明者 は、
免疫 ス ク リ ーニ ン グ を行い、 ユ ビキチ ン化 因子 E4A BE4A をコ ー ドする
免疫 反応性 c A C 末端 断片 を同定 した。 g G 自己抗 体 を、 BE4A タ ン
パ ク 質 の C 末 端 の 2 3 に相 当 する 組 換 え C 末 端 12 3 断片 を用 いて
E A で定量 した。 ク ロ ー ン病 患者の抗 ・ BE4A g G 自己抗 体 の有病率は
潰 瘍性 大腸 炎 患 者 の有 病 率 よ り も 極 めて高 く (42 に対 して 7 ・
s e s の直接 確 率検 定 P < 005 ) 、 ま た、 健 常者 と 比 べ て も 極 めて高 い
(42 に対 して 8 ・8 s e 冶 の直接確率検 定 P < )。
従 って、 抗原 ( BE4A) 又 はそ の免 疫 反応 性 を有 する 断片並 びに診 断 を
必 要 と する被 験者か ら採 取 した試料 を用 いて、 前記試料 中の BE4A と結

合 する抗 体 を測 定 し、 ク ロ ー シ 病診 断に用 い られる 前記抗 体 の存在 を検 出す
る よ ぅ な免 疫 学的解析 を行 ぅ こ と に よ り ク ロ ー ン病 の検 出、 診 断又 杖 予後 診
断が 可能 と な る。
BE4A に対する抗体 の存在 を検 出する よ ぅ な免疫 学的解析 における
BE4Aに対する抗 体 と結合する抗原 の使 用 杖 、 夕 口一ン病 の検 出又は診 断
に用 いられる。 従 って、 本発 明の方法 は、 試料 中の BE4A に対する抗 体
を検 出する方法、 例 えば、 非特異的態様 又は特異的態様 において、 当該
BE4A と結合 した後 、 当該非特異的結合又は特異的結合 を検 出する こ と に
よ る 方法 を含 む。 この よ ぅ な方法 は、 医薬 、 微 生物学又は免疫 学における 当
業者が 本発 明 を使 用 しぅ る 唯一の方法 の例示ではない。 いかな る 、 BE4A
を用 いる免疫 系 の相互作 用 が 検 出可能 であ り 、 試料 中の BE4A に対する
抗 体 の存在 を検 出する いかな る方法 も本発 明 において有用 である。
本発 明の方法 によ れば、 ク ロ ー ン病 を罹患 している こ と が 疑 われる 患者の
ク ロ ー ン病診 断、 又は、 すでにク ロ ー ン病 に罹 患 している と診 断 さ れた患者
における ク ロ ー ン病 の重症度若 しく は進行度 は、 診 断が 必要 な患者 由来 の試
料 中の BE4A に対する免疫 反応 を検 出する こ と によ り 行 われる。 抗体 の検
出が 所望 さ れる場合 は、一般 的に、 かつ好 ま しく ほ、 患者の試料 中の B
A に結合する抗 体 が 検 出される。 に結合する抗体 の検 出は、
BE4A に対する抗 体 の直接 的な検 出によ り 行 ぅ こ と が で き る。 ま たは、
BE 4 A に結合する抗 体 の検 出は、 E4A に対する抗体 の間接 的な検 出に
ょ り 行 ぅ こ と が でき る。 結合 の直接 的検 出と は、最終 的に測定 される存在で
あ る標 識 又 はイ ンジケー タ ー が E4Aに対する 抗 体 上にあ る こ と を意 味する
結合 の間接 的検 出と は、 最終 的に測定 さ れる 存在である標 識又はイ ンジケー
ターが BE4Aに対する抗 体 上にな いこ と を意 味する。
2 ・ ュビキチ ン化 因子 E4A タ ンパ ク 質及 びその断片
本発 明において、 「
BE4A」 又は 「
ュビキ チ ン化 因子 E4A 」 と い ぅ語 は、
ボ ック ス 型ュビキチ ン リ ガーゼ を意 味 し、本来 的には 4ュビキチ ン化 因子
と して記載 さ れる も のである。 BE4A は出芽酵母 幼c c a o ひces c e v s a e

d2 の哺乳動物 のホ モ ロ グであ る。 UBE4A 遺伝子は、神経 芽細胞 腫等 の癌
に関与する 臨界領域 である ヒ ト染色 体 1q23 ・3 領域 に位置する。 胎児及 び成
熟 ヒ ト組織 の ノ ザ シブ ロ ッ ト解析 では、 約 7 ・5 b の転写 単一バ ン ドが 得 られ
る こ と が 確認ほれている。 BE4Aは骨格筋 、 腎臓及 び肝臓 に存在する。
5 ュビキチ ン化 因子 E4A BE4A は、 夕 口一ン病 における標 白り自 己抗原 で
あ り 、 107 3 ア ミ ノ 酸 か らな る タ ンパ ク 質であ る。 上記 したよ ぅ に、 BE4A
は夕 口一ン病診 断の際 の指標 と して有用 である。 BE4A タ ンソく ク 質 を コ ー ド
する遺伝子の塩基 配列は公知 であ り 、 その配列は Ge Ba k 等 の公共デー タ
ベー ス を通 じて容 易 に入手する こ と が でき る (Ge a k Accessio o
0 004788) BE4A をコ ー ドする遺伝子の塩基 配列 を配列番号 ェ 、
E4A のア ミ ノ 酸配列 を配列番 号 2 に示す。
本発 明の BE4A タ ンパ ク 質 の断片 は、 E4A タ ンパ ク 質 の ぅ ち、免疫
反応性 を有する領域 を含 む断片であればいかな る 断片 で も よ い。 例 え ば、配
列番 号 2 の C 末端 の 132 ア ミ ノ 酸 (12 をカバ ーする 、配列番 号 の第
5 29 53 3 4 8 番 目の塩基部位 を含 む D A 断片 が あげ られる。 上記 D A 断片
を含 むク ロ ー ンは、 ク ロ ー ン病 患者か ら採 取 した血清 と 強 い反応 を呈示する
ため、 ク ロ ー ン病 の診 断において有用である。 ま た、 上記断片 に対する 抗体
は本発 明の ク ロー ン病診 断マーカ ー と して特 に好 ま しい。
この よ ぅ に、 JBE4A 又はその免疫 反応 性 を有する 断片が ク ロ ー ン病 の診 断
0 に有用 な 自己抗 体 と反応する と い ぅ点 に着 目する と 、 上記 した BE4A 又は
その免疫 反応性 を有する 断片 は、 下記 で説 明する よ ぅ にク ロ ー ン病診 断 と し
て使 用 しぅ る。
3 ・ JBE4A タ ンパ ク 質又はその断片 に対する抗体
5 本発 明のク ロ ー ン病 の診 断マーカーは、 BE4A 又はその免疫 反応性 を有す
る 断片 に対する 自己抗 体 以 下、 「 BE4A 等 に対する抗 体 」 と い う
場合 も あ
る である。
自己抗 体 と は、生体 内 リ ンパ 系組織 の増 生 によ る免疫応答 に生 じた異常が
原 因 と な って生 じる個 体 自身の構成物 の抗原成分である 自 己抗原 と反応する

抗体 をい ぅ。
本発 明において 「抗 体 」
と は、 天 然 の抗 体 、 並びに、 単一 ドメ イ ン及 び単
一鎖 抗 体 同様 、 ab 、 臥 2 、 Fv な どの生物 学的に活性 な 抗 体 の誘 導 体 を
共に含 む と意 味する。 生物学的に活性 な抗 体 の誘 導体 は抗原結合 能 が 備 わっ
ている。 本発 明の抗 体 は、 具体 的に、 BE4A 又はその部 分断片 に結合 し得
る抗体 分子全体 を意 味する。
BE4A に対する 抗 体 を保 有する 被 験 者 の 夕 口一ン病 の有病 率 は高い。 特
に、 上記 した配列番 号 工
の第 2953 3 3 48 番 目の塩基 部位 を含 む D A 断片
に対 する 抗 体 は、 夕 口一 ン病 患 者 の 42 16 38 、 潰瘍性 大腸 炎 患 者 の
7 2 28 、 健 常者 の 3 ・
8 2 52 で見 つかっている。 この よ ぅ に、 夕 口一
ン病 患者 申の抗 BE4A 抗 体 の有病 率は、 ク ロ ー ン病 患者 F she s の直接
確率検 定 P 005 及 び健 常者 P 0001 よ り も かな り 高 く 、 BE4A 等 に対
する抗体 は ク ロ ー ン病 に罹 患 している か否 かの診 断、 又はク ロ ー ン病 患者の
症状 の進行 の程度 を評価する ための予後 診 断のための血清 マーカ ー 診 断マ
一カ ー と して有用 である。
4 ・ ク ロ ー ン病 の検 出、診 断又は予後 診 断
本発 明の ク ロ ー ン病 の検 出、診 断又は予後 診 断は、 以 下に説 明する よ ぅ に
免 疫 学的分析方法 に よ り 、被 験者か ら採 取 した試料 中の抗 BE4A 抗体 を
検 出 し又はその抗 体 量 を測定する こ と によ って行 ぅ こ と が でき る。
被験者 には ヒ トのほか、 犬 、ネ コ 、 ラ ッ ト、 マ ウ ス な どの哺乳類 動物 も含
まれる。 試料 と しては、血液 、血清 、 組織 、尿 、粘液等 が あげ られる が これ
らに限定 されない。
特 に、 血 液 、 血 清 、 組織 と いった患 者 の試料 中の BE4A に対 する 抗 体
は、抗原 が 液 体 層 で利用 さ れる か、 固層 担 体 に結合 さ れ ぅ る免疫 解析 におい
て検 出 さ れ ぅ る。 BE4A 等 に対する 抗 体 を検 出する には、 一般 に普及 して
いる 多 く の免疫 学的分析方法 を用 いる こ と が で き る。 具体 的には、 患者 の試
料 申、 特 に、血 液 中、 血 清 又は組織試料 中の抗 体 量 、 ス は抗原 ・抗 体 複 合 体
の量 を化 学的X は物理 的手段 によ り 検 出 し、 これを既知量 の物質 を含 む標 準

溶液 を用 いて作 成 した検 量線 か ら算 出する測定方法 で あれば、 いずれの方法
を用 いて も よ い。 な かで も 、 抗原感 作 プ レー トをサ ンプル 中の抗 体 と反応 さ
せ、 プ レー ト表 面 に捕捉 さ れる 検 出対象 と な る 抗 体 を特異的な抗原 とする標
識物質 が 結合 した抗 体 で検 出する 方 法 が 、抗 体 の免 疫 学的分析方法 と して も
っと も ポ ピ ュラ 一な方 法 であ る ( oc e S y 8 8 7 879 , 9 7 )。 ま
た抗原 を吸着 させたラ テ ック ス 粒子 を試料 と混合 し、免疫 学的な凝 集反応 と
して抗体 を検 出する 方法 も公知 で あ る (A ・ ・ ・,2 8 8 8 892 956)
免疫 学的粒子凝集反応 は 試薬 で迅 速 な分析 が 可能 な方法 で あ り 、 大規模 な
ス ク リ ーニ ン グ に牡 好適 な方法 であ る。 具体 的な測定 手法 と しては、例 え ば
本 発 明 の方 法 で用 いる E4A に対 する 抗 体 を検 出する ための好 ま しい免
疫 解析 には、 ラ ジオイ ム ノ ア ッセ イ 、 酵 素免 疫 測 定 法 E S A 又 は免 疫 蛍
光測 定 法 、 化 学発 光測定法 、 又は生物発 光測 定 法等 の当業 界 で公知 の測定 方
法 が 含 まれる が 、 感 度 お よ び特異性 の見 地 か ら、EL S A が と く に灯 ま しい
E SA では、 不溶化 した BE4A 又はその断片 に試料 (定 量対象であ る
抗 体 を含 有) を加 えて反応 さ せ ( 次 反応 、 さ らに標 識 化 した 2 次 抗 体 を
反応 さ せた ( 2 次 反応) のち、 不溶化 担 体 上の標 識剤 の活性 を測 定 する こ と
に よ り 、試料 中の抗 体 の量 を定 量 で き る 。 この場合 、 次反応 と 2 次反応 は
逆 順序 におこな って も よ く 、 同時に行 な って も よ いし、 時間をず ら して行 な
って も よ い。
解析 において特 に有 用 な放射 性 同位 元 素 と しては、 H 、 、 1
、 3
P
S 5
C C 3
C 5 5
C o Fe
7 S e 及 び E が あ る。 放射性標 識 は ェ
例 であ る が 、 あ る いは、 B 4A 又はそ の抗 体 はまた、標 識物質 を用いる 測
定法 に使 用 される標 識剤 と して、 た と えぼ 当業 界 で公知 の技 術 を用 いた蛍光
標 識 、酵素標 識 、 フ リ ー ラ ジカル標 識又はア ビジン ビオチ ン標 識 を用 いて
標 識 しぅ る。 上記 した よ ぅ に標 識 に と く に酵素 を用 いた場合 を E A 法 と
い フ 。
典型 白りな酵素 には、 ア ルカ リ フォス フ ァターゼ、 ガラ ク トシダ一ゼ、
グル コ ース 6 リ ン酸 デ ヒ ドロ ゲナーゼ、 マ レー トデ ヒ ドロ ゲナーゼ、 グ
ル コ ー ス オ キ シダ一ゼ 、 ウ レア 一ゼ及 び人ルオ キ シダ一ゼ、 ガラ ク ト

シ ダ一ゼ な どが 含 まれる 。 蛍光物質 と しては、 フルオ レス カ ミ ン、 フル オ レ
ッセイ ンイ ソチオ シア ネ ー トな どが あげ られる。 な どを、 発 光物質 と しては、
ル シ フェリ ン、ル シ ゲニ ン、 ル ミ ノ ール、 ル ミ ノ ール誘 導体 な どをそれぞれ
あげ る こ と が で き る。
BE4A 又はその断片 の不溶化 には、物理 的吸着 を用 いて も よ く 、 あ る い
は通 常 タ ンパ ク 質 ま たは酵素 な どを不溶化 、 固定化 する ために用い られる化
学結合 を用 いた方法 を用 いる こ と が で き る。 担 体 と して、 ボ リ ス チ レン、 ポ
リ ア ク リ
ルア ミ ド、 シ リ コ ンな どの合成樹脂 、 ア ガ ロ ース 、 デ キ ス トラ ン、
セル ロ ー ス な どの不溶性多糖類 、 ある いはガラ ス な どが 用い られる。
上記 以外 に反応媒体 と して、 反応 の至適 条件 を与 え る か、 反応 生成物質 の
安定化 な どに有用 な緩衝液 、 反応物質 の安定化剤 な どが 含 まれる。 さ らに、
抗 体 の検 出手段 と しては、 分光器 、 放射線検 出器 、光散乱検 出器 と いった上
記標 識 を検 出可能 な も のを用いる こ と が でき る が これ らに限定 されない。 例
え ぼ、 分光器 を用いた場合 は、 汲 光度 を測定する こ と によ り 、抗体 量 を測定
する こ と が で き る。
上記 した よ ぅ な検 出方法 を用いて試料 中の BE4A 等 に対する抗 体 を検 出
し、 又はその抗体 量 を測定する こ と が でき る。
本発 明において、被験者が ク ロー ン病 に罹患 している か否 かは、抗
BE4A 抗体 重の O D 4 5 0 における 吸光度 の解析 によ り診 断 さ れ ぅ
る。 例 え ぼ、 抗体 を分光光度 計 を用いて O D値 を測定する場合 、得 られた
O D 値 が 0 ・3 以 上であれば、 被験者はク ロー ン病 に罹患 している と診 断す
る こ と が でき る。 さ らに、 ク ロ ー ン病 患者の進行 の程度 を評価する場合 ( つ
ま り 、疾 患 の進行 と 関連 づける場合) は、例 えば、 O D 値 が 0・2 6 以上であ
れば、 ク ロ ー ン病 患者 の症状 は進行 している と評価する こ と が でき る。
5 ・ ク ロ ー ン病検 出試薬 、 キ ット
本発 明においては、 自己抗体 を生 じた 自 己抗原 を検 出する こ と も で き る。
本発 明においては、 BE4A 等 に対する抗 体 ( 自己抗体 ) をク ロ ー ン病検

出試薬 と して使 用する こ と が でき る が 、 自 己抗 体 を産生する原 因 と な った
E4A タ ンパ ク 質又はその断片の最 も 、 ク ロ ー ン病検 出の指標 とする こ と が
で き る 。
上記 の E4A 等 に対 する抗 体 又 は BE4A タ ンパ ク 質若 しく はその断
片 をク ロ ー ン病検 出試薬 と して用いる 場合 には、 上記物質 を他 の溶媒や溶質
と組み合 わせて組成 物 とする こ と が で き る 。 た と え ぼ、蒸 留水 、 緩 衝試
薬 、塩 、 タ ンパ ク 質、界 面活性剤 な どを組み合 わせる こ と が で き る。
本発 明の BE4A 等 の抗 体 、 又 は BE4A タ ンパ ク 質若 しく はそ の断片
を免疫 学的測定方法 に適 用する場合 、 特 り
の条件 、操 作 な どは必 要 と されず、
それぞれの方法 における通 常の条 件 及 び操作 に準 じて行 な われる 。 必 要 で あ
れば 当業 者 に周 知 の修 飾 を加 えて好適 な測 定 系 を構 築 する こ と も 可能 で あ る。
も っと も簡 便 かつ効率的に測定 を行 な ぅ こ と を可能 とする のは、 上記試薬
をキ ッ ト化 する こ と であ る。 そ ぅ したキ ッ ト化 によ り 、 通 常の検 査 室ま たは
実験 室で、 特殊 な分析機器 、 熟 練 した操作 、 高度 の知識 は必 要 とせずに、効
率的に定 量 を行 な ぅ こ と が で き る。 上記 の各種診 断方法 ま たは治療 の判 定方
法 を実施 する ためのア ソセ イ キ ッ トの構 成 およ び形態 は、 と く に限定 さ れる
も のでな く 所 定 の 目的を達成 で き る も のであればその内容 は限定 されな い。
一般 には上記試料 について、 免疫 学的方法 を実行 し得 られた結果 を解釈 する
ための使 用説 明書、 反応試薬 、反応 が 行 な われる 場 と な る反応 媒体 、 実験 の
場 を提供する基 材 な どか ら構成 される 。 さ らに所 望 によ り 、 比 較基 準 と する
ための あ る いは検 量線 を作成する ための照 合 サ ンプル、検 出器 な ど も含 んで
も よ い。
以 下、実施例 によ り 、本発 明を具体 的に説 明する。 但 し、本発 明は これ
ら実施例 に限定 される も のでほない。
( 実施例
材料 と方法

イ ンフォー ム ドコ ンセ ン トを得 た後 、 ク ロ ー ン病 (CD 患者 3 8 人 年齢
14 52 歳 、 男子 2 5 名 、 女子 13 名 、潰瘍性大腸炎 患 者 2 8 年齢 18 7 歳 、
男子 16 名 、 女子 12 名 、 健 常者 5 2 人 年齢 3 5 6 歳 、 男子 4 0 名 、 女子
12 名 合 計 11 8 人 の患 者 を本研 究 に確保 した。 CD 及 び C の診 断は標 準
的な診療 的、 放射線 学的、 内視鏡 的及 び病理学的基 準 に基 づいて行 った。
c D A ラ イ ブ ラ リ ー
ヘル シ ンキ宣言に従 って、 結腸癌 の右半結腸切 除手術 申に取 り 出 した手術
切 片 か ら 、 正 常 ヒ ト 回腸 の 小 片 を 得 た 。 P o y A) K A を 、 P o yAT c
S ys e Promega ad so W SA を用 いて製 造業者 のプ ロ ト コ ール に従
って抽 出 した。 九
9 CD ラ イ ブ ラ リ ー を pe Sc p Cho ce S y em
v ogen C a sbad CA SA を用 いて構築 した。
免疫 ス ク リ ーニ ング
九g フ ァー ジ ラ イ ブ ラ リ ー を B 寒 天培 地 に
。
播 き 、 42 C で 7 時間培
養 し、そ の後 、 2 0 m イ ソ プ ロ ピ ル D チ オ ガ ラ ク ト ピ ラ ノ シ ド
P TG aca a e sq e yo o Japa 含 有 二 トロセル ロ ース Sch e cher
a d S c h e asse Ge a y にかぶせて
。
3 7 C で 7 時間重層 した。 5
w v ス キ ム ミ
ル ク ト リ ス 緩 衝 生理食 塩水 TBS でブ ロ ッキ ン グ した後 、
。
膜 を血清 でイ ンキ ュベ ー ト し、 それ らを TBS で希釈 して、 4 C で 15 時間、
大腸菌 Y 1090 株 の溶解物 で前扱 収 した。 膜 を西洋 ワ サ ビペルオキ シダ一ゼ
共役 ヤギ抗 ヒ ト gG C P a ace ca s A o a O SA) で 22
C 時間イ ンキ ュベー ト し、4 ク ロ ロ ナ フ トール ナカ ラ イテ ス ク
を用 いて抗 体反応性 フ ア ー ジプ ラ ー ク を検 出 した。 イ ンキ ュベー シ ョ ン後 は
005 Twee 20 含 有 TB で膜 を 3 回洗浄 した。 最初 のス ク リ ー ニ ン グ と
同様 の方法 で、第 2 、 第 3 ス ク リ ーニ ングで陽性 ク ロ ー ンを単離 した。
c D A ク 口一ンのシー ク ェンス 解析
免疫 反応 性 フア ー ジ ク ロ ー ン申の c D A 断片 を 九g 正方 向及 び逆 方 向
皿

プ ラ イ マー を用 いて P C R で増幅 した。 用 いた 几 正方 向及 び逆 方 向プ
ラ イ マー及 び PCR 条件 は以 下の通 り であ る。
正方 向 プ ラ イ マ ー GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 配 列番 号
3
5 逆 方 向プ ラ イマー TTGACACCAGACCA ACTGGTAATG 配列番 号 4
PCR 条件
反応液組成
乃瓦母克皮 肪ヴ ( ) 025
0 0X PCR B e 5
TP x e ( 各 2 5 4 1
鋳型
プ ライマー 各 ・0は (最終濃 度)
滅菌蒸 留水 p o 5 0は
5
温度 とサイ クル条件
9 4 C 、 ェ 分 間
5 5 o
C 、 分 間
7 2 C、 3 分 間
2 0 30 サイ クル
c D f片 は A B P sm 3 0 P E App ed B o s y s e s Fos e C A SA を用い
て配列を決 定 した。 シー ク エ ンス ア ラ イ ンメ ン トは米 国国立バ イオテ ク ノ ロ
ジー情 報 セ ンタ ー CB h p ww cb gov 提 供 の ソ フ ト ウ ェア
2 5 及 びサーチプ ロ グ ラ ム を用いて行 った。
組換 えユ ビ午チ ン化 因子 E4A
BE4A タ ンパ ク 質 の調製
GST ユ ビキ チ ン化 因子 E4A BE4A) 融合 タ ンパ ク 質 を作製 する ために
用いた構 築 体 は、PCR 調製 物 co 及 び 刃 \ で切 断 を pGEX 6 P

W
ベ ク タ ー Ame sham B o c e ces P sca aw ay J SA c o 刀 部位
にラ イ ゲー トする こ と に よ り調製 した。 選択 したフ ァー ジ ク ロ ー ンにおける
cD A 断 片 を 、 P C で BE4A の 第 2953 3 4 8 の 塩 基 部 位 に相 当 す る
D A 断片 を生成する ために用 いた。 用 いたプ ラ イ マー及 び PCR 条 件 は以 下
の通 り である。
5 プ ラ イ マー ATGAATTCGATGGACGTTCCTATTCC- 列番 号
5
3 プ ラ イ マ 5 '-GGCCGCTCGAGTCATTCAAGTTGCTCCTTTT-3 配列番 号
6
PCR 条件
反応液組成 は上記 cD A ク ロ ー ンの シー ク エ ンス 解析 で用 いた条 件 と 同様
である。
温度 と サイ ク ル条件
。
9 4 C 、 分間
5 5 C 、 分間
7 2 C、 分 間
3 0 サイ ク ル
これ らのプ ラ イ マー の う ち、 下線 部 の配列 は、pGEX 6P ベ ク タ ー の
coR 刀ん 普日ィ立 にサ ブ ク ロ ー ニ ン グする ために設 計 した。 こ の BE4A
断片 は 1073 ア ミ ノ 酸 か ら な る 全 BE4A の C 末 端 の 132 ア ミ ノ 酸
(12 をカバ ーする。 構 築 体 のシー ク エ ンス 確認 を した後 、 このべ ク タ
一を 0・ m P TG を用 いて、 大腸菌 B 2 1 株 に トラ ンス フオ ー ム した。
B PER GST 融合 タ ンパ ク 質精製 キ ッ ト P e ce B o ech o ogy Rock 的
SA) を用 いて、 製 造業者 のプ ロ トコ ール に従 い、 GST E4A 融合 タ ン
パ ク 質 を精製 した。 P
,e c ss o プ ロ テ ア一ゼ (A e sham B osc e ces を用
いて GST BE4A を切 断する こ と に よ り 組換 え C 末端 BE4A タ ンパ
2

2006 054806
ク 質 を作製 した。
酵素免疫 測定法 ・
EL 勺
マイ ク ロ タイ タ ー プ レー ト 町U C Ros k d e Denma k に、P BS P 7 4)
を用 いて、組換 え C 末端 BE4A
。
タ ンパ ク 質 を 4 C 5 時間コ ーテ ィング
した S pe B ock b ock g b e P e ce B o ech o ogy Roc o d SA で
ブ ロ ッキ ン グ 後 、 プ レー ト に、 P BS 含 有 0・05 Twee 2 0 P S T で
。
100 に希釈 した血清試料 150 叫 を加 え、2 2 C で 時間イ ンキ ュベ ー ト
した。 プ レー ト を P BS T で、
洗浄 し、各セルに、 1 0 RP 共役 ヤギ抗
ヒ ト g G ( C P 町 ace ca s を P BS T で 2 000 に希釈 した も のを加 え
さ らに
。
2 2 C で 時間イ ンキ ュベ ー シ ョ ン した。 プ レー トを P BS T で、
洗浄
し、各セル に、 100 B 基 質 1 S ep S ow T B E P e ce を加 えた。
3 0 分後 、 S を 100 山 加 えて反応 を停止 させ、T e eck ska
P s K eade C P ha mace ca s を用 いて 4 0 での扱 光度 D
を測定 した。
統 計解析
連続 して測 定 した平均値 の相 違 は A VA を用 いて統 計 的に解析 した。
デー タ のカ テ ゴ リ 的比 較 は F she s の直接確 率検 定 を用 いて解析 した。 全
ての統 計解析 は S a V ew 5 0 o ac osh SA S e C a y C SA で
行 った。
( 実施例 免疫反応性 c D A ク ロ ー ンの同定
本実施例 は、免疫 反応性 c D A ク ロー ンを同定する こ と を 目的 とする。
C D 患者の血清 に存在する 自己抗 体 を同定する ために、C 患者 において
頻繁 に炎 症 が おき る 部位 であ る 回腸 での正常 な部位 か ら c D A 発 現 ラ イ ブ
ラ リ ー を構 築 した。 ラ ンダ ム に選 んだ 3 人 の C D 患者か ら採 取 した血清 の
プールか ら合 計 5 X 05
個 の フ ア ー ジプ ラ ー ク をス ク リ ーニ ング した。 ラ ン
ダ ム に選 んだ健 常者 10 人 か ら採取 した血清 のプールで陽性 フア ー ジ ク ロ ー
3

ン をス ク リ ー ニ ン グ した 陰性 ス ク リ ー ニ ン グ 。 陰性 ス ク リ ー ニ ン グ に よ
り 選択 さ れたフ ァー ジ ク ロ ー ン をシ一夕 エ ンス によ り 同定 した。 C D 患者か
ら採 取 した血清 と 強 い反応 を呈示 した つの ク ロ ー ンは、 BE4A Accessio
o 004 7 8 8 の塩基 配列の ぅ ち、 第 2953 33 4 8 番 目の配列 と相 同であ り 、
それは、 全 BE4A の ぅ ちの 12 3 にあた る C 末 端 の 132 ア ミ ノ 酸 をカ
バ ーする。 図 ェ は、C D 患者及 び健 常者 の BE4A に対 する 反応 を示す。 図
ェ で断片 を有 していな い んg フ ァー ジ を同等 に混合 し、 ネ ガテ ィブ コ ン
ト ロ ール と した。 A は C D 患 者 の血 清 を、 B は、 健 常者 の血 清 を表 す。
(実施例 2 ) E S A に よ る C 患者の血清 中の BE4A 特異的抗 体 の検 索
本 実 施 例 は、C D 患者 の血清 中の BE4A 特異的抗 体 を E A を用 い
て検 索する こ と を 目的 とする。
BE4A に対 する 体 液 性免 疫 反応 が 特異 的 に C D に関連 する か否 かを確
認 する ため、 C D 患者、 C 患者及 び健 常者 か ら採 取 した血 清試料 におけ る 、
組換 え BE4A タ ンパ ク 質 に対 する反応 性 を試 験 した。 GST に対 する反応
に よ る 効 果 を排 除する た め に、 部 位 特 異 的プ ロ テ ア 一ゼ を用 いて GST
BE4A を切 断する こ と に よ り 、 組換 え BE4A の 2 3 にあた る C 末端
の断片 タ ンパ ク 質 を作製 した 図 2 。 図 2 は、 組換 え E4A タ ンパ ク 質 を
調製 したこ と を示す写真である。 レー ン は精製 GST BE4A 融合 タ ンパ
ク 質 で あ り 、 レー ン 2 は P eSc ss o プ ロ テ ア 一ゼ に よ る切 断によ り 産生 し
た組換 え BE4A タ ンパ ク 質 で あ り 、 レー ン 3 ほ、P eSc ss o プ ロ テ ア 一
ゼ切 断後 に還元型 グル タ チオ ンを加 え たグル タ チオ ンセ ファロ ース か らの溶
出物 を示す。 試料 は S D PAGE 12 5 で還元 された。
E SA を用 いて血清抗 E4A gG 抗 体価 を測 定 した。 C D 患 者の抗
BE4A 抗 体 の O D 値 の平均 は、 C 患 者や健 常者 に比 して極 めて高かっ
た A OVA P 0001 図 3 。 図 3 は、E SA によ り 、 C D 患者、潰瘍
性大腸炎 ( C ) 患者及 び健 常者 の血清 中の E4A 特異的 gG を定量 し
たグ ラ フで あ る 。 各 グルー プ ご と の平均 を長 い横線 で、標 準誤差 を短 い横
線 で示す。 抗 UBE4A 抗体 の明瞭性 Po v y に対 する O D 値 の分画は、
4

健 常者 の平均値 0・2 7 1 よ り 高い 2SD 以 上の と規 定 した。 破線
は分画 レベル を示す。 C D 患者の 4 2 16 38
C 患者 の 7 ・1 。 2 2 8
健 常者 の 3
・8 2 52 で抗 BE4A 抗 体 が 見 つかった。 C D 患者 中の抗
BE4A g G 抗 体 の有病 率は、 C 患者 F she の直接確 率検 定 P 005
及 び健 常者 P 0001 ょり も かな り 高かった。
産業 上の利用可能性
本発 明 によ り 、 E4A タ ンパ ク 質又はその断片 BE4Aタ ンパ ク 質等 に
対する抗 体 を含 むク ロ ー ン病診 断マーカ ー及 び BE4A タ ンパ ク 質等 に対す
る抗 体 又は BE4A タ ンパ ク 質若 しく はその断片含 む夕 口一ン病診 断試薬 が
提供 される。 上記 BE4A タ ンパ ク 質等 に対する抗 体 の存在 を検 出し、 又は
その抗 体量 を測定する こ と によ り ク ロ ー ン病 の診 断又は予後診 断が 可能 と な
る。 従 って、本発 明は、 ク ロ ー ン病 の診 断や治療効果 の判定 に貢献する と い
ぅ産業 上の利用 可能性 を有する。
配列表 フ リ ーテ キス ト
配列番 号 3 プ ラ イマー
配列番 号 4 ブラ イマー
配列番号 5 プ ラ イマー
配列番号 6 プ ライマー

請 求 の 範 囲
・ ュビキチ ン化 因子 E タ ンパ ク 質又はその断片 に対する抗 体 を含 むク
ロ ー ン病診 断マーカー。
・ ュビキチ ン化 因子 タ ンパ ク 質又はその断片 を含 むク ロ ー ン病検 出
用試薬。 ,
・ ュビキチ ン化 因子 E タ ンパ ク 質又 はその断片 に対する抗 体 を含 む夕 口
一ン病検 出用試薬。
・ 被験者が 夕 口一ン病 に罹 患 している か否 かを検 出又 は診 断する方法で
あって、以 下の工程
a 前記被験者から試料 を採 取 し
0 前記試料 中のュビキ チ シ化 因子 E タ ンパ ク 質又 はその断片 に対
する抗体 を検 出 し 及 び
C 前記試料 中に前記抗 体 が 検 出 さ れた場合 に前記被 験者が ク ロ ー ン病
である と診 断する こ と
を含 む前記方法。
・ ク ロ ー ン病 に罹 患 した患者 において前記疾 患 が 進行 している か否 かを
評価する方法であって、 以 下の工程 :
a 前記患者か ら試料 を採 取 し
b 前記試料 申のュビキ チ ン化 因子 F タ ンパ ク 質又 はそ の断片 に対
する抗体 の抗体 量 を測定 し
C 程 ( の測定結果 を、 前記疾 患 の進 行 と 関連付 ける工程
を含 む前記方法。
・ 試料 が 血清 である 、 請 求項 4 又は 5 載 の方法。




SEQUENCE LISTING
<110> Locomogene, Inc.
<120> CLONING OF AUTOANTIGEN ASSOCIATED WITH CROHN' S DISEASE
<130> PCT05-0088
<150> US60/630258
<151> 2004-11-22
<160> 6
<170> Patentln version 3 . 3
<210> 1
<211> 6138
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (130) .. (3351)
<400> 1
acttccggtt gctgtgctga gtcggaagtg ggaacccttc ggccgctgag attctgtcgt 60
gtcgtcgctg ctggcacttc aggctctgcc tctcccacta ggtctggatg gaggatacct 120
taaagtgaa atg aca gac cag gag aat aac aac aac ate tea agt aac ccc 171
Met Thr Asp GIn GIu Asn Asn Asn Asn lie Ser Ser Asn Pro
1 5 10
ttt get get ctt ttt ggc tec ctg get gat gee aaa cag ttt gcg gca 219
Phe Ala Ala Leu Phe GIy Ser Leu Ala Asp Ala Lys GIn Phe Ala Ala
15 20 25 30
ate caa aaa gag cag ctg aag caa caa tct gat gaa etc cca get age 267
H e GIn Lys GIu GIn Leu Lys GIn GIn Ser Asp GIu Leu Pro Ala Ser
35 40 45

cca gat gac teg gat aat age gtg tea gag age ctg gat gaa ttc gat 315
Pro Asp Asp Ser Asp Asn Ser VaI Ser GIu Ser Leu Asp GIu Phe Asp
50 55 60
tac tct gtg get gag att age cgc tea ttc cga tea cag cag gaa ata 363
Tyr Ser VaI Ala GIu H e Ser Arg Ser Phe Arg Ser GIn GIn GIu H e
65 70 75
tgt gag caa etc aac ate aat cac atg ate caa agg ate ttc ctt att 411
Cys GIu GIn Leu Asn lie Asn His Met H e GIn Arg H e Phe Leu H e
80 85 90
act ctg gac aac agt gat ccc age ttg aaa age ggg aat ggc ate cct 459
Thr Leu Asp Asn Ser Asp Pro Ser Leu Lys Ser GIy Asn GIy H e Pro
95 100 105 110
age cgt tgt gtg tat ttg gaa gaa atg gca gta gag eta gaa gat caa 507
Ser Arg Cys VaI Tyr Leu GIu GIu Met Ala VaI GIu Leu GIu Asp GIn
115 120 125
gac tgg ctt gat atg age aat gtt gag cag gee etc ttc get cgc tta 555
Asp Trp Leu Asp Met Ser Asn VaI GIu GIn Ala Leu Phe Ala Arg Leu
130 135 140
tta ctt caa gat cca ggc aac cac tta att aac atg act tct tct aca 603
Leu Leu GIn Asp Pro GIy Asn His Leu H e Asn Met Thr Ser Ser Thr
145 150 155
acg eta aat etc tct get gat cga gat gca gga gag agg cac att ttt 651
Thr Leu Asn Leu Ser Ala Asp Arg Asp Ala GIy GIu Arg His H e Phe
160 165 170
tgt tac ctt tac tec tgc ttc cag aga gee aag gaa gag att ace aaa 699
Cys Tyr Leu Tyr Ser Cys Phe GIn Arg Ala Lys GIu GIu H e Thr Lys
175 180 185 190
gtt cca gag aac ctg eta ccc ttt gca gtg cag tgc aga aac etc act 747
VaI Pro GIu Asn Leu Leu Pro Phe Ala VaI GIn Cys Arg Asn Leu Thr
195 200 205
gtg tec aat ace cga aca gtt ctt etc ace cca gag ate tat gtt gac 795
VaI Ser Asn Thr Arg Thr VaI Leu Leu Thr Pro GIu H e Tyr VaI Asp

210 215 220
caa aac ate cat gag caa ctg gta gat ttg atg tta gaa gcc ate cag 843
GIn Asn lie His GIu GIn Leu VaI Asp Leu Met Leu GIu Ala lie GIn
225 230 235
gga gcc cgt gag tac atg aac aag ate tat ttt gaa gat gta act gag 891
GIy Ala Arg GIu Tyr Met Asn Lys H e Tyr Phe GIu Asp VaI Thr GIu
240 245 250
ttt ctg gaa gag gtc att gaa gcc ttg ata ttg gat gag gaa gtt aga 939
Phe Leu GIu GIu VaI H e GIu Ala Leu H e Leu Asp GIu GIu VaI Arg
255 260 265 270
aca ttt cca gaa gtc atg att cca gtg ttt gat att tta ttg ggc cga 987
Thr Phe Pro GIu VaI Met lie Pro VaI Phe Asp lie Leu Leu GIy Arg
275 280 285
ata aaa gat eta gag etc tgt cag ate ctt ttg tat gca tat ctg gat 1035
H e Lys Asp Leu GIu Leu Cys GIn H e Leu Leu Tyr Ala Tyr Leu Asp
290 295 300
att ctt etc tat ttc act agg caa aaa gat atg gca aag gtt ttt gta 1083
H e Leu Leu Tyr Phe Thr Arg GIn Lys Asp Met Ala Lys VaI Phe VaI
305 310 315
gaa tac att cag ccc aag gac cct ace aat ggg caa atg tac cag aag 1131
GIu Tyr H e GIn Pro Lys Asp Pro Thr Asn GIy GIn Met Tyr GIn Lys
320 325 330
ace ttg ctg gga gta att ctg agt ate tec tgc tta tta aag act ccg 1179
Thr Leu Leu GIy VaI H e Leu Ser H e Ser Cys Leu Leu Lys Thr Pro
335 340 345 350
ggt gtt gta gaa aat cat ggc tac ttt ttg aat cca tct cgt tec age 1227
GIy VaI VaI GIu Asn His GIy Tyr Phe Leu Asn Pro Ser Arg Ser Ser
355 360 365
ccc cag gag ate aaa gta cag gag gcc aac ate cat cag ttc atg get 1275
Pro GIn GIu H e Lys VaI GIn GIu Ala Asn H e His GIn Phe Met Ala
370 375 380

cag ttc cac gaa aag ate tac cag atg ctg aag aac tta etc cag etc 1323
GIn Phe His GIu Lys H e Tyr GIn Met Leu Lys Asn Leu Leu GIn Leu
385 390 395
tct cca gaa ace aaa cac tgt ate ttg tec tgg ctt gga aac tgt ttg 1371
Ser Pro GIu Thr Lys His Cys lie Leu Ser Trp Leu GIy Asn Cys Leu
400 405 410
cat gca aat gca ggc cgc ace aag att tgg gee aat cag atg cca gaa 1419
His Ala Asn Ala GIy Arg Thr Lys lie Trp Ala Asn GIn Met Pro GIu
415 420 425 430
ate ttt ttc caa atg tat gee tea gat get ttc ttt ctg aat ctg ggt 1467
H e Phe Phe GIn Met Tyr Ala Ser Asp Ala Phe Phe Leu Asn Leu GIy
435 440 445
get get etc ctg aag eta tgc cag cca ttt tgc aaa ccc aga tec tct 1515
Ala Ala Leu Leu Lys Leu Cys GIn Pro Phe Cys Lys Pro Arg Ser Ser
450 455 460
egg etc etc ace ttt aat ccc aca tac tgt gee etc aag gag ttg aat 1563
Arg Leu Leu Thr Phe Asn Pro Thr Tyr Cys Ala Leu Lys GIu Leu Asn
465 470 475
gat gaa gaa cga aaa att aaa aat gta cac atg aga ggt ttg gac aaa 1611
Asp GIu GIu Arg Lys lie Lys Asn VaI His Met Arg GIy Leu Asp Lys
480 485 490
gaa ace tgt ttg ate cca get gtg cag gag ccg aag ttt cca cag aac 1659
GIu Thr Cys Leu H e Pro Ala VaI GIn GIu Pro Lys Phe Pro GIn Asn
495 500 505 510
tac aac ctt gta aca gag aac ctt get ctg aca gag tac ace ttg tac 1707
Tyr Asn Leu VaI Thr GIu Asn Leu Ala Leu Thr GIu Tyr Thr Leu Tyr
515 520 525
ttg gga ttt cac agg ttg cat gat cag atg gta aaa ate aac caa aat 1755
Leu GIy Phe His Arg Leu His Asp GIn Met VaI Lys H e Asn GIn Asn
530 535 540
ctg cat egg ctg cag gtt gee tgg egg gat get cag caa agt tct age 1803
Leu His Arg Leu GIn VaI Ala Trp Arg Asp Ala GIn GIn Ser Ser Ser

545 550 555
cct get get gac aat ctt cgt gag cag ttt gaa cga ctg atg ace ate 1851
Pro Ala Ala Asp Asn Leu Arg GIu GIn Phe GIu Arg Leu Met Thr lie
560 565 570
tat ctt tct ace aag act gee atg aca gag cca caa atg eta caa aac 1899
Tyr Leu Ser Thr Lys Thr Ala Met Thr GIu Pro GIn Met Leu GIn Asn
575 580 585 590
tgc eta aac ttg cag gtg tec atg get gtt eta ctg gtt caa ctg gee 1947
Cys Leu Asn Leu GIn VaI Ser Met Ala VaI Leu Leu VaI GIn Leu Ala
595 600 605
ata ggc aat gag ggc tea cag cca ata gag eta ace ttt cct ttg cca 1995
lie GIy Asn GIu GIy Ser GIn Pro H e GIu Leu Thr Phe Pro Leu Pro
610 615 620
gat ggc tac age tct ttg get tat gtg cca gaa ttt ttt gca gat aac 2043
Asp GIy Tyr Ser Ser Leu Ala Tyr VaI Pro GIu Phe Phe Ala Asp Asn
625 630 635
ctg ggt gat ttt etc att ttt etc cgc cgc ttt gee gat gac att ttg 2091
Leu GIy Asp Phe Leu lie Phe Leu Arg Arg Phe Ala Asp Asp H e Leu
640 645 650
gag aca tea gca gat tec ctg gag cat gtc ctt cac ttt ate ace att 2139
GIu Thr Ser Ala Asp Ser Leu GIu His VaI Leu His Phe H e Thr H e
655 660 665 670
ttc act gga age ata gaa aga atg aag aat ccc cac ctg agg gee aaa 2187
Phe Thr GIy Ser H e GIu Arg Met Lys Asn Pro His Leu Arg Ala Lys
675 680 685
eta gca gag gtg ttg gaa gca gtg atg ccc cac ctg gat cag ace cca 2235
Leu Ala GIu VaI Leu GIu Ala VaI Met Pro His Leu Asp GIn Thr Pro
690 695 700
aat ccc ttg gta tec agt gtg ttc cac egg aaa cgt gtg ttc tgc aac 2283
Asn Pro Leu VaI Ser Ser VaI Phe His Arg Lys Arg VaI Phe Cys Asn
705 710 715

ttt cag tat gca ccc caa ctt gca gag get eta ate aag gtt ttt gtg 2331
Phe GIn Tyr Ala Pro GIn Leu Ala GIu Ala Leu H e Lys VaI Phe VaI
720 725 730
gac ate gaa ttt aca gga gac ccc cat caa ttt gaa cag aag ttt aat 2379
Asp lie GIu Phe Thr GIy Asp Pro His GIn Phe GIu GIn Lys Phe Asn
735 740 745 750
tac cgc cgt ccc atg tat cct ate eta aga tac atg tgg ggg aca gat 2427
Tyr Arg Arg Pro Met Tyr Pro lie Leu Arg Tyr Met Trp GIy Thr Asp
755 760 765
ace tat egg gag age att aag gat ttg get gae tat gcc tct aag aat 2475
Thr Tyr Arg GIu Ser lie Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Ala Ser Lys Asn
770 775 780
tta gaa gcc atg aat ccc cca ctt ttc etc cgc ttt ctt aac ctg eta 2523
Leu GIu Ala Met Asn Pro Pro Leu Phe Leu Arg Phe Leu Asn Leu Leu
785 790 795
atg aat gat gcc ate ttc ctt ttg gat gaa gcc ata cag tat ttg age 2571
Met Asn Asp Ala lie Phe Leu Leu Asp GIu Ala lie GIn Tyr Leu Ser
800 805 810
aag ata aag att eag caa att gag aag gat cga ggt gaa tgg gat agt 2619
Lys H e Lys H e GIn GIn H e GIu Lys Asp Arg GIy GIu Trp Asp Ser
815 820 825 830
ctg act cca gaa gcc cgc cga gaa aag gag get ggc eta cag atg ttt 2667
Leu Thr Pro GIu Ala Arg Arg GIu Lys GIu Ala GIy Leu GIn Met Phe
835 840 845
gga cag ctg gca cgt ttc cat aac ate atg tec aat gaa aca ate ggt 2715
GIy GIn Leu Ala Arg Phe His Asn H e Met Ser Asn GIu Thr lie GIy
850 855 860
ace ctt gcc ttt etc aca tea gag ate aag tea etc ttt gtg cat ccc 2763
Thr Leu Ala Phe Leu Thr Ser GIu H e Lys Ser Leu Phe VaI His Pro
865 870 875
ttc ctg get gag cgc ate ate tec atg ttg aac tac ttc ctg caa cac 2811
Phe Leu Ala GIu Arg H e lie Ser Met Leu Asn Tyr Phe Leu GIn His

880 885 890
ctg gtt ggc ccc aag atg ggt gcc tta aaa gtc aag gac ttc age gaa 2859
Leu VaI GIy Pro Lys Met GIy Ala Leu Lys VaI Lys Asp Phe Ser GIu
895 900 905 910
ttt gac ttc aaa ccc cag cag ctt gta tea gat ate tgc act ate tac 2907
Phe Asp Phe Lys Pro GIn GIn Leu VaI Ser Asp lie Cys Thr H e Tyr
915 920 925
tta aat ctt ggg gat gag gag aat ttc tgt gcc act gtg ccc aag gat 2955
Leu Asn Leu GIy Asp GIu GIu Asn Phe Cys Ala Thr VaI Pro Lys Asp
930 935 940
gga cgt tee tat tec cca act etc ttt gca cag aca gtt cga gtc ttg 3003
GIy Arg Ser Tyr Ser Pro Thr Leu Phe Ala GIn Thr VaI Arg VaI Leu
945 950 955
aag aaa ata aat aag cct ggg aat atg att atg get ttc age aac ttg 3051
Lys Lys lie Asn Lys Pro GIy Asn Met lie Met Ala Phe Ser Asn Leu
960 965 970
gca gag aga ate aag tct ctt gca gac etc caa caa cag gaa gag gaa 3099
Ala GIu Arg H e Lys Ser Leu Ala Asp Leu GIn GIn GIn GIu GIu GIu
975 980 985 990
ace tat gca gat gcc tgt gat gag ttc ctg gat ccc att atg age aca 3147
Thr Tyr Ala Asp Ala Cys Asp GIu Phe Leu Asp Pro lie Met Ser Thr
995 1000 1005
ctg atg tgt gac cct gtg gtg ctg cca tct tec aga gtc act gtg 3192
Leu Met Cys Asp Pro VaI VaI Leu Pro Ser Ser Arg VaI Thr VaI
1010 1015 1020
gat aga tec ace att gca aga cat ttg etc agt gac caa aca gat 3237
Asp Arg Ser Thr lie Ala Arg His Leu Leu Ser Asp GIn Thr Asp
1025 1030 1035
ccc ttt aac cgt agt ccc etc ace atg gac cag ate egg cca aac 3282
Pro Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Met Asp GIn H e Arg Pro Asn
1040 1045 1050

aca gaa eta aaa gaa aaa ate caa egg tgg ctt gca gag agg aaa 3327
Thr GIu Leu Lys GIu Lys H e GIn Arg Trp Leu Ala GIu Arg Lys
1055 1060 1065
caa caa aag gag caa ctt gaa tag atactgtgaa ctaaccaaac caaaaccaac 3381
GIn GIn Lys GIu GIn Leu GIu
1070
cccagagtgc agataaacaa ttgtttgtgg tttctctctt tctggttctg ttccttttct 3441
ttcttctttt ctttttcttt tttttttttt tttttactaa attagagaac tgctcttgct 3501
gaaattatga tagttaagat tcctaagaac ttgacaatgc tcccctggct tgcaggaaat 3561
tatacttatt atagcatcac caagtttaga aatcatcact aattttcacc ctctgttgtc 3621
tcttcatatt cttcttcctt ttcctaaatg aaattatatt atttcaacta ctaaaacttc 3681
ccgccaccct gctatttctc ttccaattac tgttcaaaca tttttggtga gtgctgcttt 3741
tataaatatg tgatgtcaca tatttcagtg acagctgatg ttatcagaaa aatcctgtta 3801
tcctgtgtat ttactagtcc tcatgatcta gacttaaccc cttttctgtg ttacagagta 3861
acttcacata aaagcagata cctttaagtt tgtgtagact tctgaataag atgatagacg 3921
agaatttttt ttaaaaaagg aatttaaagg aatcttgtgc aacttctgtt gatagctctt 3981
aattttgtta tacagtcttt ttaatgagga ttggtagggc aatcctacca attgatgggg 4041
gtgaggagac tgttgggccc ttattctctt atgaaaatct gtttctacaa ggactaggcc 4101
taagtagatt taggcaacgg gtatcatatc catgaaaaat gtcattttaa gacactaata 4161
tcaacagtat atctcagtgt gtgagatata taaatacaca tacaccccat gtgctttttt 4221
gttggtttag tgtaaactga gtaccacttt atattttctc ttccatagtg agatgtatgc 4281
agtatgtggc catgtttact aacatactca ttcttcacaa aattctgaga ttataaaatg 4341
tatatagtta atatttgttt gagcttgtga cctgacttct aagagctact tctaacacag 4401

ccttaggtct tcaattaaca aagtaggaag ttgagcacaa ccttgtccac agccatttta 4461
aatatccact tagccctgtg tagttggtag gtggacacca ctttcataag tgaacttgag 4521
ctcactactc aattgtgcag cttaatatgc tgactaggga cattccccta tggattatct 4581
ttatatcact gtctttctaa gcccagagat gtcataagtg acaagaaaag tgataggatc 4641
aagaaatggg tgtcactgct tcatttggaa catgttatta actatggtct ctttcaaata 4701
aatagtagtt ttatatttca acacaagttg ctataagcag tccttgatgg gtttttgatt 4761
gcatcagctg gaaagcctca aatctaagag ggcttcccat cctagatata aaataggtgt 4821
tgcctattgc tgtgcttata aaatgaaaaa ggaaattgag gacacttttg caaatgccag 4881
aatgtaagat tcattcagtg tgctccctgg gcctttatgg catgggttga caggatttgt 4941
ttattttcta aaattagctt cattcaatat ttatcatcct cctttccctc tctgagaatg 5001
aactatgtat aaaataagct tctgcctatt tgcatttatc ttccaaaccc aatctagtag 5061
gatgttctca ttttaaaaac gaggggaaaa gaccagagtt tttcaggaga aaactggagg 5121
aaaatgggca caaaaactca gaaggcagct attcccagca gcttcctagt taacaacccc 5181
catgctgcct ccagtctttg tctgtattct tctgtattta accttcagat tgtaagcctt 5241
ttctggcaag cttttcttct ttttttaaac tcttttcctg aaacttttta tgaatggcta 5301
tggcaccatt aatgctgctg aatatcttta aactctgcac aagcaagtgt gtagcttaag 5361
gccactactg gtaaggaaac caagtgtcct ctgtgccttt tttctttctg tgaagtaatt 5421
taagaatatc caaaaaaatt agactttaaa aagttatctt ggtacaacac cgtgtgtata 5481
tacacttgga agcttaaaaa ggtgttttgt ctggaactta gaagcagctc taaatctagt 5541
agagcagact ttctaacata cctagttttg tgtattggct ttgctggagt atgatagcaa 5601
aatgaagact cttttactca gctctggtat tgctcataac ttaccaagag gctaatacta 5661

aacttggaaa attgtttaag tatgttttat caagcagtct gggttttgtt ttttaatata 5721
ctttttaatg gatatgtgaa aactgaagga aatgttaaag gttttttaat ggtgcaagtg 5781
aaggtgccag ttgctatttg atatcacact ctacaaaagc ttcattactt tatttgatgg 5841
tggttgctaa gcagccattg cacagagcat aagtctactg ggtgccttta catgccagag 5901
gctgatgctg cactgttgat gtcatgtgag gaaataatgc acatgctcta actgctcaac 5961
aggaaatgaa cctagaaaca gaaaatgaaa aggttgattg aaataaaact tgatcaacgc 6021
gactgtattt tgaaacattc caggaaggtt acttcttgtc aaacttgcct ggcagtgttt 6081
gttcaaaact tgtatttaat aaatgaacat ctgacttaca aaaaaaaaaa aaaaaaa 6138
<210> 2
<211> 1073
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Thr Asp GIn GIu Asn Asn Asn Asn H e Ser Ser Asn Pro Phe Ala
1 5 10 15
Ala Leu Phe GIy Ser Leu Ala Asp Ala Lys GIn Phe Ala Ala H e GIn
20 25 30
Lys GIu GIn Leu Lys GIn GIn Ser Asp GIu Leu Pro Ala Ser Pro Asp
35 40 45
Asp Ser Asp Asn Ser VaI Ser GIu Ser Leu Asp GIu Phe Asp Tyr Ser
50 55 60
VaI Ala GIu H e Ser Arg Ser Phe Arg Ser GIn GIn GIu lie Cys GIu
65 70 75 80

GIn Leu Asn H e Asn His Met H e GIn Arg H e Phe Leu H e Thr Leu
85 90 95
Asp Asn Ser Asp Pro Ser Leu Lys Ser GIy Asn GIy H e Pro Ser Arg
100 105 110
Cys VaI Tyr Leu GIu GIu Met Ala VaI GIu Leu GIu Asp GIn Asp Trp
115 120 125
Leu Asp Met Ser Asn VaI GIu GIn Ala Leu Phe Ala Arg Leu Leu Leu
130 135 140
GIn Asp Pro GIy Asn His Leu H e Asn Met Thr Ser Ser Thr Thr Leu
145 150 155 160
Asn Leu Ser Ala Asp Arg Asp Ala GIy GIu Arg His H e Phe Cys Tyr
165 170 175
Leu Tyr Ser Cys Phe GIn Arg Ala Lys GIu GIu H e Thr Lys VaI Pro
180 185 190
GIu Asn Leu Leu Pro Phe Ala VaI GIn Cys Arg Asn Leu Thr VaI Ser
195 200 205
Asn Thr Arg Thr VaI Leu Leu Thr Pro GIu H e Tyr VaI Asp GIn Asn
210 215 220
H e His GIu GIn Leu VaI Asp Leu Met Leu GIu Ala H e GIn GIy Ala
225 230 235 240

Arg GIu Tyr Met Asn Lys H e Tyr Phe GIu Asp VaI Thr GIu Phe Leu
245 250 255
GIu GIu VaI H e GIu Ala Leu lie Leu Asp GIu GIu VaI Arg Thr Phe
260 265 270
Pro GIu VaI Met H e Pro VaI Phe Asp lie Leu Leu GIy Arg H e Lys
275 280 285
Asp Leu GIu Leu Cys GIn H e Leu Leu Tyr Ala Tyr Leu Asp lie Leu
290 295 300
Leu Tyr Phe Thr Arg GIn Lys Asp Met Ala Lys VaI Phe VaI GIu Tyr
305 310 315 320
lie GIn Pro Lys Asp Pro Thr Asn GIy GIn Met Tyr GIn Lys Thr Leu
325 330 335
Leu GIy VaI H e Leu Ser H e Ser Cys Leu Leu Lys Thr Pro GIy VaI
340 345 350
VaI GIu Asn His GIy Tyr Phe Leu Asn Pro Ser Arg Ser Ser Pro GIn
355 360 365
GIu H e Lys VaI GIn GIu Ala Asn H e His GIn Phe Met Ala GIn Phe
370 375 380
His GIu Lys H e Tyr GIn Met Leu Lys Asn Leu Leu GIn Leu Ser Pro
385 390 395 400
GIu Thr Lys His Cys H e Leu Ser Trp Leu GIy Asn Cys Leu His Ala
405 410 415

Asn Ala GIy Arg Thr Lys H e Trp Ala Asn GIn Met Pro GIu H e Phe
420 425 430
Phe GIn Met Tyr Ala Ser Asp Ala Phe Phe Leu Asn Leu GIy Ala Ala
435 440 445
Leu Leu Lys Leu Cys GIn Pro Phe Cys Lys Pro Arg Ser Ser Arg Leu
450 455 460
Leu Thr Phe Asn Pro Thr Tyr Cys Ala Leu Lys GIu Leu Asn Asp GIu
465 470 475 480
GIu Arg Lys lie Lys Asn VaI His Met Arg GIy Leu Asp Lys GIu Thr
485 490 495
Cys Leu H e Pro Ala VaI GIn GIu Pro Lys Phe Pro GIn Asn Tyr Asn
500 505 510
Leu VaI Thr GIu Asn Leu Ala Leu Thr GIu Tyr Thr Leu Tyr Leu GIy
515 520 525
Phe His Arg Leu His Asp GIn Met VaI Lys H e Asn GIn Asn Leu His
530 535 540
Arg Leu GIn VaI Ala Trp Arg Asp Ala GIn G n Ser Ser Ser Pro Ala
545 550 555 560
Ala Asp Asn Leu Arg GIu GIn Phe GIu Arg Leu Met Thr lie Tyr Leu
565 570 575

Ser Thr Lys Thr Ala Met Thr GIu Pro GIn Met Leu GIn Asn Cys Leu
580 585 590
Asn Leu GIn VaI Ser Met Ala VaI Leu Leu VaI GIn Leu Ala H e GIy
595 600 605
Asn GIu GIy Ser GIn Pro H e GIu Leu Thr Phe Pro Leu Pro Asp GIy
610 615 620
Tyr Ser Ser Leu Ala Tyr VaI Pro GIu Phe Phe Ala Asp Asn Leu GIy
625 630 635 640
Asp Phe Leu H e Phe Leu Arg Arg Phe Ala Asp Asp lie Leu GIu Thr
645 650 655
Ser Ala Asp Ser Leu GIu His VaI Leu His Phe H e Thr H e Phe Thr
660 665 670
GIy Ser lie GIu Arg Met Lys Asn Pro His Leu Arg Ala Lys Leu Ala
675 680 685
GIu VaI Leu GIu Ala VaI Met Pro His Leu Asp GIn Thr Pro Asn Pro
690 695 700
Leu VaI Ser Ser VaI Phe His Arg Lys Arg VaI Phe Cys Asn Phe GIn
705 710 715 720
Tyr Ala Pro GIn Leu Ala GIu Ala Leu H e Lys VaI Phe VaI Asp lie
725 730 735
GIu Phe Thr GIy Asp Pro His GIn Phe GIu GIn Lys Phe Asn Tyr Arg
740 745 750

Arg Pro Met Tyr Pro H e Leu Arg Tyr Met Trp GIy Thr Asp Thr Tyr
755 760 765
Arg GIu Ser lie Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Ala Ser Lys Asn Leu GIu
770 775 780
Ala Met Asn Pro Pro Leu Phe Leu Arg Phe Leu Asn Leu Leu Met Asn
785 790 795 800
Asp Ala H e Phe Leu Leu Asp GIu Ala lie GIn Tyr Leu Ser Lys H e
805 810 815
Lys H e GIn GIn lie GIu Lys Asp Arg GIy GIu Trp Asp Ser Leu Thr
820 825 830
Pro GIu Ala Arg Arg GIu Lys GIu Ala GIy Leu GIn Met Phe GIy GIn
835 - 840 砧45 .—- . -
Leu Ala Arg Phe His Asn H e Met Ser Asn GIu Thr H e GIy Thr Leu
850 855 860
Ala Phe Leu Thr Ser GIu H e Lys Ser Leu Phe VaI His Pro Phe Leu
865 870 875 880
Ala GIu Arg H e H e Ser Met Leu Asn Tyr Phe Leu GIn His Leu VaI
885 890 895
GIy Pro Lys Met GIy Ala Leu Lys VaI Lys Asp Phe Ser GIu Phe Asp
900 905 910

Phe Lys Pro GIn GIn Leu VaI Ser Asp lie Cys Thr H e Tyr Leu Asn
915 920 925
Leu GIy Asp GIu GIu Asn Phe Cys Ala Thr VaI Pro Lys Asp GIy Arg
930 935 940
Ser Tyr Ser Pro Thr Leu Phe Ala GIn Thr VaI Arg VaI Leu Lys Lys
945 950 955 960
H e Asn Lys Pro GIy Asn Met H e Met Ala Phe Ser Asn Leu Ala GIu
965 970 975
Arg H e Lys Ser Leu Ala Asp Leu GIn GIn GIn GIu GIu GIu Thr Tyr
980 985 990
Ala Asp Ala Cys Asp GIu Phe Leu Asp Pro H e Met Ser Thr Leu Met
995 1000 1005
Cys Asp Pro VaI VaI Leu Pro Ser Ser Arg VaI Thr VaI Asp Arg
1010 1015 1020
Ser Thr H e Ala Arg His Leu Leu Ser Asp GIn Thr Asp Pro Phe
1025 1030 1035
Asn Arg Ser Pro Leu Thr Met Asp GIn H e Arg Pro Asn Thr GIu
1040 1045 1050
Leu Lys GIu Lys H e GIn Arg Trp Leu Ala GIu Arg Lys GIn GIn
1055 1060 1065
Lys GIu GIn Leu GIu
1070

<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 3
ggtggcgacg actcctggag cccg 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 4
ttgacaccag accaactggt aatg 24
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 5
atgaattcga tggacgttcc tattcc 26
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial

<220>
<223> primer
<400> 6
ggccgctcga gtcattcaag ttgctccttt t 3 1

INTERNATIONAL SEARCH REPORT Intern onal pplica on No.
PCT/JP2005/021937
A. CLASSIFICATION OF SUB ECT MATTER
C12N15/09 (2006.01) , G01N33/53 (2006.01)
According to International Patent Classification (IPC) or to both national classification and IPC
B. FIELDS SEARCHED
Minimum documentation searched (classifi㏄tion system 血llowed by classification symbols)
C12N15/09 ( 2 0 0 6 . 0 1 ) , G01N33/53 ( 2 0 0 6 . 0 1 )
Documen血tion searched other than minimum documentation to the extent that such documents are included m the fields searched
Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)
BI OS I S /MEDLINE/ PIDS (STN ) , JSTPlus (JOI S )
C. DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.
CONTINO, G . et al ., Expression analysis of the 1 - 6
gene encoding for the U-box-type ubiquitin
ligase UBE4A in human tissues, Gene, 2004
March, Vol. 328, pages 69 to 74
HUGOT, J .P . et al ., Association of NOD2 1 - 6
leucine-rich repeat variants with
susceptibility to Crohn's disease,
Nature, 2001, Vol. 411, No. 6837,
pages 599 to 603
OGURA, Y et al ., A frameshift mutation 1 - 6
in N0D2 associated with susceptibility
to Crohn's disease, Nature 2001, Vol. 411,
pages 603 to 606
Further documents are listed in the contmuation of Box C. See patent 血mily annex.
* Special categories of ciねd documents: "T" later document published after the international filing date or pπoπty
"A" document defining the general te of the a which is not considered to date and not in conflict with the application but cited to understand
e of particular relevance the pπnciple or theory underlying the invention
"E" earlier application or patent but published on or after the international filing "X" document of particular relevance, the claimed invention cannot be
date considered novel or cannot be considered to involve an inventive
"L" document which may throw doubts on priority claim(s) or which is step when the document is taken alone
cited to establish the publication date of another citation or other "Y' document of particular relevance, the claimed invention cannot be
special reason (as specified) considered to involve an inventive step when the document is
"O" document referring to an oral disclosure, use, e hibition or other means combined with one or more other such documents, such combination
"P ' document published pπor to t e international fling date but later than the being obvious to a person skilled in the art
pπoπty date claimed "&' document member of the same patent family
Date of the actual completion of the international search Date of mailing of the international search report
14 December, 2005 ( 14 . 12 . 05) 2 7 December, 2005 (27 . 12 05 :
Name and mailing ad打ess of the ISA/ Authorized officer
Japanese Patent Office
F c i rule No Tele hone No
Form PCT/ISA/210 (second sheet) (April 2005)

INTERNATIONAL SEARCH REPORT International application No.
PCT/JP2005/021937
C (Continuation) DOCUMENTS CONSIDERED TO BE RELEVANT
Category* Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant to claim No.
Keiji TANAKA, Protease to Shik an Ubiquitin/ 1 - 6
Proteasome to Shikkan", Experimental
Medicine, 1997, Vol. 15, No. 17, pages 2056 to
2062
US 2002/086506 A l (INCYTE CORP., US), l - <
04 July, 2002 (04.07.02),
US 6750027 B2
Form PCT/ISA/210 (continuation of second sheet) (April 2005)

国際調査報告 国際出願番号 P C T ノ J P 2 0 0 5 ソ 0 2 1 9 3 7
A . 発 明(D属 る分野の分類 (国際特許分類 ( I P C) )
intci a i砂 09 (2006 01), G01N33/53 (2006 01)
B ・ 調査 を行 た分野
調査 を行 た最小限資料 (国際特許分類 ( I PC) )
Int CL C1215/09 (2006. 01) ㏄133/53 (2006. 01)
最小限資料以外 の貸料て調査 を行 た分野に含 まれる もの
国際調査て使 用 した電子テ タ ス テ タベ ス の名称 、調査に使用 した用語
BIOSIS/MEDLINE/PIDS (STN) , JSTPl s (JOIS)
C . 関連する と認 められる文献
引用文献の 関連する
カテ ホ 引用文献名 及 び一部の箇 所が 関連する ときは、その関連する箇 所 CD 表示 請求の範囲の番号
CONTINO G . et al, Expression analysis o f the gene encoding for 1-6
the U-bo χ type ubiquitin ligase UBE4A in human tissues, Gene,
2004 Mar Vol. 328, pp. 69-74
HUGOT, J . P . et a l Association of N0D2 leucine-rich repeat 1-6
variants ith susceptibility to Crohn' s disease, Nature, 2001,
Vol. 411, No. 6837 pp. 599-603
紅 欄の続きにも文献か列挙 されて る。 ぽ テ ン トy ア に関する別紙 を参 照
ホ 引用文献のカテ の 日の役 に公表 された文献
ΓA 特 に関連 のある文献でほな < 、- 般 的技術水準 を示す ΓT J 国際出願 日又は優先 日後 に公表 された文献てあ て
の 出願 と矛盾する ものでほな 、発 明の原理又は理論
E 国際出願 日前の出願または特許てあるが、国際出願 日 の理解のために引用する もの
以後 に公表 された の ΓX J 特 に関連 のある文献であ て、当議文献のみで発明
Γ 優先権主張に疑義を提起する文献又は他 の文献の発行 の新規性又は進歩性が な ≥考 え られる もの
日若 し は他 の特別な理 由を確 立するために引用す ΓY J 特 に関連 のある文献であ て、当議文献 他の 以
る文献 理由を付す) 上D 文献 t の、当業者にt て自明てある組合せに
ΓO 口頭 によ る開示、使用、展示等に言及す 文献 よ て進歩性が な と考え られる もの
P J 国際出願 日前て、か 優先権 の主張 の基礎 な る出願 Γ J 同一 テ ン ア リ—文献
国際調査を完T た日 国際調査報告の発送 日
1 4 1 2 2 0 0 5 2 7 . 1 2 . 2 0 0 5
国際調査機関の名称及びあて先 特許庁審査官 権 限のある職員 4 B 2 9 3 6
日本国特許庁 ( I S A ノJ P )
飯室 里美
郵便番号 1 0 0 - 8 9 1 5
東京都 代 田区霞が 関三丁 目4 番 号 電話番号 0 3 - 3 5 8 1 - 1 1 0 1 内線 3 4 4 8
様式 P C T ノ I S A ノ2 1 0 (第 2 ジ) ( 2 0 0 5 午 4 月 )

国際調査報告 i PCT/JP2005 21937
C (続 き ) . 関連する t認められる文献
引用文献の 関連する
カテ r 引用文献名 及び一部の箇 所が 関連する と きは、その関連する箇 所の表示 請 求の範囲D 番号
OGURA, Y . et a l A frameshift mutation in N0D2 associated ith 1-6
susceptibility to Crohn's disease Nature 2001, Vol. 411,
pp. 603-606
二 プ テ ア ゼ 疾患、 ビキチ プ テ ア ソ ム 疾 1-6
患,実験 医学, 1997 Vol. 15 No. 17, pp. 2056 2062
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