Method For The Screening Of Molecules Useful In The Treatment And/or Prevention Of Alzheimer's Disease

  • Published: Mar 5, 2015
  • Earliest Priority: Aug 26 2013
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MÉTODO DE CRIBADO DE MOLÉCULAS ÚTILES PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCIÓN DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

DESCRIPCIÓN

La presente invención se encuadra en el campo de la neurología y la medicina, específicamente dentro de los métodos de cribado de moléculas útiles para mejorar el rendimiento cognitivo y promover el desarrollo cognitivo, preferiblemente para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o síndromes que producen deterioro cognitivo, como la enfermedad de Alzheimer.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los genes que codifican para las presenilinas 1 y 2 (PSEN1 y PSEN2, respectivamente) y la proteína precursora de amiloide (ΑβΡΡ) son las únicas moléculas conocidas hasta el momento implicadas en la enfermedad de Alzheimer (EA) de causa monogénica (Albert Lleó et al., 2002, Archives of Neurology; 59:1759- 1763). La relación entre estas proteínas y la enfermedad se puede entender como una asociación entre enzima/sustrato en la que la enzima es la presenilina y ΑβΡΡ es el sustrato.

La presenilina se encuentra formando parte de un gran complejo enzimático llamado γ- secretasa, del cual es el núcleo catalítico (Bart De Strooper et al., 2003, Neuron; 38:9- 12). En los vertebrados existen dos genes de presenilina: PSEN1 , que contiene la información genética para la presenilina 1 (PS1 ) y PSEN2, que contiene la información genética para la presenilina 2 (PS2). Ambos genes se encuentran altamente conservados entre las distintas especies de vertebrados. En la especie humana los genes codificantes para estas dos proteínas presentan una alta homología entre sí (80%). El complejo γ-secretasa se compone en total de cuatro proteínas que están presentes en igual estequiometría: presenilina, nicastrin, gen asociado al defecto en nasofaringe anterior de drosophila (APH 1 ) y potenciador de presenilina 2 (PEN2).

En primer lugar, en el procesamiento proteolítico secuencial de la proteína ΑβΡΡ, tiene lugar una escisión por la a- o β-secretasa. La secretasa α conduce al fragmento C83 (aCTF). La escisión por β-secretasa (BACE1 ) resulta en dos fragmentos potenciales: C99 y C89 (pCTFs). Todos estos fragmentos pueden sufrir, posteriormente, una primera escisión proteolítica (escisión ε) por parte del complejo γ-secretasa. Este proceso libera el dominio intracelular del amiloide (AICD o yCTF) hacia el citoplasma (principalmente dos: AICD51 y AICD50); mientras que en el lado opuesto (el extremo N-terminal) deja un remanente peptídico en la zona transmembrana (péptidos amiloides: Αβ48 y Αβ49 respectivamente), unido al complejo γ-secretasa:

1. a- ó pCTF-» Αβ48 + AICD51

2. a- ó pCTF-» Αβ49 + AICD50

Posteriormente, los remanentes transmembrana Αβ48 y Αβ49 pueden sufrir una escisión secuencial progresiva por el complejo γ-secretasa en el dominio transmembrana (escisión γ), liberando tres o cuatro residuos en cada paso de la secuencia de escisión, resultando en dos secuencias escisorias distintas en función del péptido de partida:

1. Αβ48^Αβ45^Αβ42^Αβ38.

2. Αβ49^Αβ46^Αβ43^Αβ40^Αβ37.

La secuencia de escisión (escisión representada por la flecha) se podría interrumpir en cualquier paso del proceso proteolítico, liberando finalmente el sustrato que no se ha escindido. Para la secuencia que comienza en Αβ49 el producto final más probable sería Αβ40 y para la que comienza en Αβ48 el péptido Αβ42.

Una droga funcional debería tratar la enfermedad y detener o retrasar el daño celular que conduce al empeoramiento de los síntomas. En este sentido, los esfuerzos de los investigadores se han centrando en buscar nuevas formas de tratamiento de la EA, ya que los medicamentos actuales únicamente ayudan a enmascarar los síntomas de la enfermedad sin llegar a tratarla.

Desde el punto de vista de su actuación, se estudian tres tipos de fármacos en la EA: los que actúan sobre la posible causa de la enfermedad, modulando la producción del péptido Αβ, los que tratan de prevenir las consecuencias de la enfermedad o fármacos neuroprotectores y los que tratan de paliar las consecuencias de la enfermedad actuando sobre los síntomas (Hugo Geerts et al., 2013, Frontiers of Pharmaco\ogy; 4:47).

La tendencia actual hacia el desarrollo de terapias frente a la EA, que tienen como objetivo reducir los niveles de Αβ en el cerebro, viene respaldada por la evidencia que sustenta la hipótesis de la cascada amiloidea (1. la deposición del péptido Αβ en el parénquima cerebral en forma de placas; 2. el hecho de que los tres genes causales de EA monogénica, ΑβΡΡ como sustrato y PSEN1 -2 como enzimas, intervengan en la formación de péptido Αβ) y apunta al papel crucial del péptido Αβ en la enfermedad. De acuerdo con esta hipótesis, la deposición de Αβ constituye el desencadenante patológico inicial de la enfermedad. Por ello, los fármacos diseñados en base a esta hipótesis tratan de modificar los niveles de Αβ desde varios frentes (Martin Citrón, 2010, Nature Reviews. Drug Discovery; 9(5):387-398): i. Actuando sobre la producción del péptido Αβ. Son los compuestos llamados "Αβ lowering compounds": inhibidores y moduladores de γ-secretasa (GSI, GSM) e inhibidores de β-secretasa (inhibidores de BACE1 ).

¡i. Aumentando el aclaramiento del péptido Αβ. Se realiza principalmente mediante anticuerpos.

i¡¡. Disminuyendo la agregación del péptido Αβ.

Al margen de los discretos resultados obtenidos en los ensayos clínicos realizados con los fármacos desarrollados a partir de la hipótesis amiloidea, existen dos grandes paradojas respecto a los objetivos que persiguen y el comportamiento de las mutaciones asociadas a la EA de causa monogénica, a saber, a) la mayoría de las mutaciones reducen la cantidad global del péptido Αβ producido y b) todas las mutaciones conllevan un aumento del cociente entre las dos principales formas de péptido Αβ: Αβ42/Αβ40 (Eñe Karran, et al., 201 1 , Nature Reviews Drug Discovery ,10, 698-712). A pesar de que los GSM consiguen invertir este cociente, lo hacen a expensas de un cambio en la producción de Αβ42 por Αβ38 (en la misma línea escisoria), lo que se traduce en un aumento de la toxicidad in vivo (Lucia Chávez-Gutiérrez et al., 2012, EMBO Journal; 31 (10):2261 -74). Por ello, aunque el mecanismo exacto por el que se produce la EA permanece sin esclarecer, el objetivo de cualquier fármaco diseñado para combatir esta enfermedad debería ser el de disminuir el cociente Αβ42/Αβ40 sin disminuir los niveles del péptido Αβ producido, atacando selectivamente la escisión ε, lo que condicionaría los productos de la secuencia escisoria posterior (escisión γ).

Por ello, existe la necesidad de desarrollar nuevos abordajes, tales como la creación de modelos de comportamiento cinético del complejo enzimático γ-secretasa para los diferentes productos de escisión del péptido ΑβΡΡ. La correlación entre estos modelos cinéticos y los modelos estructurales tridimensionales establecidos ayudaría a entender la dinámica molecular del procesamiento proteolítico del péptido ΑβΡΡ para generar los péptidos Αβ42 y Αβ40 y permitiría la identificación de dianas moleculares, dentro del complejo enzimático γ-secretasa, cuya inhibición pueda ser interesante desde el punto de vista clínico para el tratamiento y/o prevención de la EA.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona dianas moleculares dentro del complejo enzimático γ-secretasa, concretamente localizadas en la molécula de presenilina que constituye la subunidad catalítica de dicho complejo, las cuales permiten identificar y/o diseñar moléculas, preferiblemente anticuerpos, cuya unión bloquee selectivamente la entrada del sustrato ΑβΡΡ a uno de los dos canales que conducen al sitio activo de la enzima responsable de la producción del péptido Αβ42. Dicho canal se encontraría delimitado por un agujero que comunica el espacio extracelular con el citoplasma (Fig. 1 ). De este modo, la unión de dichas moléculas a las dianas moleculares aquí descritas conduce a la interrupción de la línea de producción del producto peptídico Αβ42 frente a la línea de producción del producto peptídico Αβ40, provocando así una reducción en el cociente Αβ42/Αβ40, lo cual es deseable desde el punto de vista del tratamiento y/o prevención de la EA.

El inventor de la presente invención ha desarrollado un modelo de comportamiento cinético para el complejo enzimático γ-secretasa que incluye a la presenilina como subunidad catalítica, proponiendo la existencia de dos posibles canales o vías de entrada (Fig. 1 ), que conducirían hasta el sitio catalítico en la presenilina, para un mismo sustrato amiloideo (ΑβΡΡ), el cual es el sustrato más abundante y relevante del complejo en enfermedades que afectan al rendimiento y deterioro cognitivo, como la EA. En el modelo propuesto, dichos canales, denominados canal γ40 y canal γ42, deberían divergir físicamente hacia el espacio luminal (por condicionamientos estéricos), pero confluirían en el centro activo en sentido hacia el citoplasma, y cada uno de ellos estaría asociado a las respectivas líneas escisorias dado que el sustrato presentaría diferentes condicionamientos estéricos respecto a la escisión ε en función del canal de entrada (el canal γ40 y el γ42 darían lugar a distintas escisiones ε, las que producen Αβ49 y Αβ48 respectivamente). De modo que el canal γ40 daría lugar al péptido Αβ40 y el canal γ42 al péptido Αβ42. En resumen, a través de dos vías de acceso o canales de entrada a la presenilina, dentro del complejo enzimático, el modelo permite explicar el mecanismo cinético que da lugar a la formación de estos dos péptidos (Αβ42 y Αβ40) y su distribución cuantitativa.

Por ello, la presente invención propone el bloqueo luminal del canal de entrada al complejo enzimático γ-secretasa atribuido a la formación del péptido Αβ42, el cual se localiza en la estructura de la presenilina y que en esta invención se ha denominado "canal γ42 de la presenilina", mediante moléculas que presentan especificidad frente a determinantes antigénicos que bordean la zona de entrada a dicho canal desde el espacio extracelular. De esta forma la subunidad enzimática presenilina, que forma el núcleo catalítico del complejo enzimático γ-secretasa, resulta parcialmente inaccesible para el sustrato que va a ser escindido, ΑβΡΡ, mientras la molécula permanezca unida al canal γ42 ejerciendo un impedimento estérico sobre el mismo. Esto provoca un bloqueo selectivo del canal γ42 y consecuentemente, como se muestra en los ejemplos de la presente invención, una reducción del cociente Αβ42/Αβ40, lo cual es deseable desde el punto de vista del tratamiento y/o prevención de patologías asociadas al procesamiento proteolítico del sustrato ΑβΡΡ. Por tanto, la presente invención se basa en la utilidad del canal γ42 de la presenilina como diana molecular y en la funcionalidad terapéutica de cualquier molécula identificada o diseñada a partir de dicha diana que sea capaz de bloquear la zona de entrada al canal γ42 desde el espacio extracelular impidiendo, parcial o totalmente, la entrada del sustrato a la enzima.

El canal γ42 de la presenilina se ha asociado hasta el momento con la entrada de agua e iones, por lo que hasta ahora no se había propuesto como un posible canal de entrada del sustrato amiloideo que posteriormente será escindido para producir el péptido Αβ42. Estructuralmente, el canal γ42 se encuentra flanqueado por los dominios transmembrana 2, 3, 5 y 7. Los dominios transmembrana, como su nombre indica, atraviesan la membrana celular y contactan, por un lado, con el lumen y, por el lado opuesto, con el citoplasma, concretamente algunos de los aminoácidos que constituyen estos dominios transmembrana estarán en contacto con el lumen o espacio extracelular (a esta región se llamará en la presente invención "extremo luminal del dominio transmembrana"). Entre dos dominios transmembrana cualesquiera se encuentra un bucle que conecta dos dominios entre sí y que se proyecta hacia el lumen o hacia el citoplasma. La conjunción de la parte luminal de los dominios transmembrana 2, 3, 5 y 7 con los bucles luminales con los que conectan (LL1 , LL2, LL3 y LL4 respectivamente; TM-II con LL1 , TM-lll con LL2, TM-V con LL3 y TM-VII con LL4) configuran el acceso de las moléculas amiloideas al interior del canal γ42 de la presenilina 1 (Fig. 2a). Más adelante se hará referencia a estas combinaciones estructurales transmembrana-bucle como "regiones luminales, RL," de acceso al canal γ42. Este patrón estructural es extrapolable a la presenilina 2 (Fig. 2b).

Por ello, un primer aspecto de la invención se refiere al uso del canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa como diana farmacológica para el cribado de moléculas útiles para el tratamiento y/o prevención de la EA.

El "complejo enzimático γ-secretasa" es el complejo compuesto por cuatro proteínas: presenilina, nicastrina, gen asociado al defecto en nasofaringe anterior de drosophila (APH1 ) y potenciador de presenilina 2 (PEN2). El complejo lleva a cabo el procesamiento proteolítico del sustrato ΑβΡΡ dentro de la membrana plasmática para dar lugar a los dos péptidos Αβ40 y Αβ42. La subunidad catalítica del complejo enzimático γ-secretasa es la presenilina, pudiendo estar presente en el complejo la presenilina 1 o la presenilina 2. Estas presenilinas son proteínas transmembrana cuyos genes, en humano, presentan una elevada homología entre ellos (80% de identidad a nivel de nucleótidos). En la presente invención se entiende, por tanto, por "presenilina" la presenilina 1 o la presenilina 2. En una realización preferida, la presenilina 1 es la proteína de humano de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 21 . En otra realización preferida, la presenilina 2 es la proteína de humano de secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 22. Las secuencias aminoacídicas de las presenilinas pueden contener mutaciones, tales como inserciones, sustituciones, adiciones o deleciones de uno o más residuos aminoacídicos. Por ello, dentro del alcance de la presente invención se incluyen las presenilinas 1 y 2 cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica u homologa a las secuencias descritas en SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22, respectivamente.

El término "diana farmacológica", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere al canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ- secretasa, preferiblemente a cualquiera de las regiones luminales que delimitan dicho canal descritas posteriormente en la presente invención, las cuales son de utilidad para el estudio del efecto bioquímico de moléculas capaces de unirse a ellas. Las moléculas de interés son aquellas que ejerzan un impedimento estérico que impida la entrada del sustrato amiloideo al complejo enzimático a través de este canal. Estas moléculas, pueden ser sin limitarnos, anticuerpos, aptámeros, RNAs de interferencia o agentes químicos, que se seleccionan mediante un cribado en el cual se analiza la presencia de dicho impedimento estérico y/o la reducción del cociente Αβ42/Αβ40.

El término "enfermedad de Alzheimer" o "EA", tal y como se emplea en la presente invención, se refiere a una enfermedad neurodegenerativa que presenta deterioro cognitivo y/o trastornos conductuales. Se caracteriza en su forma típica por una pérdida progresiva de la memoria y de otras capacidades mentales, a medida que las células nerviosas degeneran y/o mueren y diferentes zonas del cerebro se atrofian.

El término "canal γ42" tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere al canal mostrado en la Fig. 1 , el cual permite la entrada del sustrato amiloideo necesaria para su posterior procesamiento proteolítico para generar el péptido Αβ42, o cualquiera de los péptidos de su misma línea escisoria, tales como Αβ45 ó Αβ38. El acceso luminal a dicho canal estará delimitado, preferiblemente, por las regiones luminales (RL) como se indica posteriormente y que se encuentran representadas en la Fig. 2.

En otra realización preferida, dicho canal γ42 está delimitado por: a) una primera región luminal (RL1 ) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina y el bucle luminal 1 (LL1 ) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio TM-II, b) una segunda región luminal (RL2) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll) de la presenilina y el bucle luminal 2 (LL2) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio TM-lll, c) una tercera región luminal (RL3) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina y el bucle luminal 3 (LL3) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio TM-V, y d) una cuarta región luminal (RL4) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina y el bucle luminal 4 (LL4) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio TM-VII.

El término "región luminal" (RL), tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una región dispuesta hacia el exterior luminal del canal γ42 de las presenilinas 1 y 2 (Fig. 2) y compuesta por los elementos definidos anteriormente en los puntos a), b), c) ó d), donde los dominios TM-II, TM-lll, TM-V y TM-VII son dominios transmembrana de la presenilina; y LL1 , LL2, LL3 y LL4 son bucles luminales de la presenilina. Las regiones luminales a) a d) descritas anteriormente se encuentran dispuestas de manera que conforman el acceso luminal al canal γ42 de la presenilina, que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa.

Se entiende por "extremo luminal del dominio transmembrana" la región aminoacídica de cualquiera de los dominios transmembrana 2, 3, 5 ó 7 (TM-II, TM-lll, TM-V y TM- VII) de las presenilinas 1 ó 2 dispuesta hacia el extremo luminal del canal γ42 (Fig. 2), dentro del complejo enzimático γ-secretasa, los cuales, como se ha indicado anteriormente, forman parte del canal γ42 de la presenilina. Estas regiones aminoacídicas consisten en los últimos 3 a 4 aminoácidos del extremo C- ó N-terminal de cada dominio transmembrana (Fig. 2).

En una realización más preferida, el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica LVG. Se entiende por "bucle luminal" ("luminal loop", LL) aquella región aminoacídica de las presenilinas 1 ó 2 (Fig. 2) dispuesta enteramente hacia el lumen y que presenta estructura de bucle o "loop" debido a que conecta dos dominios transmembrana, contiguos en la secuencia primaria, entre sí.

En una realización más preferida, el bucle luminal 1 (LL1 ) de la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 6, el bucle luminal 2 (LL2) de la segunda región luminal (RL2) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7, el bucle luminal 3 (LL3) de la tercera región luminal (RL3) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8 y el bucle luminal 4 (LL4) de la cuarta región luminal (RL4) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9.

En una realización aun más preferida, la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 13, la segunda región luminal (RL2) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 14, la tercera región luminal (RL3) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 y la cuarta región luminal (RL4) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 16.

En otra realización preferida, el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5, el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica LVG.

En una realización más preferida, el bucle luminal 1 (LL1 ) de la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 10, el bucle luminal 2 (LL2) de la segunda región luminal (RL2) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 1 , el bucle luminal 3 (LL3) de la tercera región luminal (RL3) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8 y el bucle luminal 4 (LL4) de la cuarta región luminal (RL4) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12. En una realización aun más preferida, la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 17, la segunda región luminal (RL2) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 18, la tercera región luminal (RL3) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 y la cuarta región luminal (RL4) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 19.

Las regiones luminales definidas en la presente invención pueden ser utilizadas en su forma aislada como dianas farmacológicas para el cribado de moléculas capaces de ejercer un impedimento estérico sobre el canal γ42 de la presenilina que impida la entrada del sustrato a dicho canal. Por ello, en un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una región luminal aislada del canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa, de ahora en adelante "región luminal de la invención", seleccionada de la lista que consiste en: a) región luminal 1 (RL1 ) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina y el bucle luminal 1 (LL1 ) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II), b) región luminal 2 (RL2) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll) de la presenilina y el bucle luminal 2 (LL2) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll), c) región luminal 3 (RL3) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina y el bucle luminal 3 (LL3) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V), y d) región luminal 4 (RL4) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina y el bucle luminal 4 (LL4) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII). La utilidad de estas dianas moleculares se basa en su situación estratégica dentro del área que delimita el canal γ42 de la presenilina, por lo que su inhibición o bloqueo conduce a un impedimento estérico del canal γ42 para la entrada del sustrato ΑβΡΡ, lo que finalmente se traduce en una reducción del cociente Αβ42/Αβ40.

La región luminal de la presente invención puede ser sintetizada, por ejemplo, aunque sin limitarnos, in vitro. Por ejemplo, mediante la síntesis de péptidos en fase sólida o mediante aproximaciones de ADN recombinante. La región luminal de la invención puede producirse recombinantemente, no sólo directamente sino como un polipéptido de fusión junto con un polipéptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo aunque sin limitarnos, una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte por una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido. La producción recombinante de la región luminal de la invención comprende la amplificación de un polinucleótido que codifica para dicha región, la clonación del polinucleótido amplificado en un vector de expresión, la transformación o transfección de una célula competente con dicho vector, el cultivo de dicha célula en condiciones que promuevan la expresión de la región luminal de la invención y el aislamiento y purificación de la región luminal de la invención producida por la célula.

La región luminal de la invención puede presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad del péptido. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustituciones son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, por aminoácidos conservados. Los aminoácidos conservados son aminoácidos que tienen cadenas laterales y propiedades similares en cuanto a, por ejemplo, hidrofobicidad o aromaticidad. Estas sustituciones incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp), entre lisina (Lys) y arginina (Arg), entre asparagina (Asn) y glutamina (Gln), entre serina (Ser) y treonina (Thr), y/o entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala), leucina (Leu), valina (Val) e isoleucina (lie). Las variaciones pueden ser variaciones generadas artificialmente como, por ejemplo, mediante mutagénesis o síntesis directa. Por ello, dentro del alcance de la presente invención también se incluyen los péptidos o polipéptidos cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica u homologa a las secuencias descritas en la presente invención.

En una realización preferida de la región luminal de la invención, el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica LVG.

En una realización más preferida, el bucle luminal 1 (LL1 ) de la región luminal 1 (RL1 ) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 6, el bucle luminal 2 (LL2) de la región luminal 2 (RL2) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7, el bucle luminal 3 (LL3) de la región luminal 3 (RL3) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8 y el bucle luminal 4 (LL4) de la región luminal 4 (RL4) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9.

En una realización aun más preferida, la región luminal 1 (RL1 ) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 13, la región luminal 2 (RL2) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 14, la región luminal 3 (RL3) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 y la región luminal 4 (RL4) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 16.

En otra realización preferida de la región luminal de la invención, el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5, el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica LVG.

En una realización más preferida, el bucle luminal 1 (LL1 ) de la región luminal 1 (RL1 ) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 10, el bucle luminal 2 (LL2) de la región luminal 2 (RL2) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 1 , el bucle luminal 3 (LL3) de la región luminal 3 (RL3) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8 y el bucle luminal 4 (LL4) de la región luminal 4 (RL4) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12.

En una realización aun más preferida, la región luminal 1 (RL1 ) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 17, la región luminal 2 (RL2) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 18, la región luminal 3 (RL3) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 y la región luminal 4 (RL4) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 19.

Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso de la región luminal de la invención como diana farmacológica para el cribado de moléculas útiles para el tratamiento y/o prevención de la EA.

En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a un método de cribado de moléculas útiles para el tratamiento y/o prevención de la EA, de ahora en adelante "método de la invención", que comprende: a. Poner en contacto una molécula a estudiar con el canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa, ex vivo, o con la región luminal de la invención aislada,

b. Analizar la interacción entre la molécula a estudiar y las regiones luminales de la invención, y

c. Seleccionar la molécula del paso (a) para el tratamiento y/o prevención de la EA cuando ésta se ha unido a al menos una de las regiones luminales de la invención.

Se entiende por "poner en contacto una molécula a estudiar con el canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa, o con la región luminal de la invención aislada", la incubación de la molécula a estudiar con la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa, o con la región luminal de la invención aislada, bajo condiciones que permiten la unión molécula-diana farmacológica, siendo la diana el canal γ42 o la región luminal de la invención aislada. Si la molécula a estudiar es un anticuerpo, la incubación se realiza bajo condiciones que permitan la formación de complejos antígeno-anticuerpo y se mantiene durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una respuesta inmune.

El término "analizar la interacción", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere preferiblemente al estudio del cambio operado o respuesta tras la incubación de la molécula a estudiar, objeto del cribado en el paso (a), en la concentración de los sustratos/productos relacionados con la "escisión y" realizada por la presenilina, perteneciente al complejo enzimático γ-secretasa. Una realización más preferida sería cuando el sustrato/producto se refiera a un sustrato/producto amiloideo o un derivado/análogo de éste.

Si la molécula a estudiar es un anticuerpo, la presencia de una respuesta inmunológica puede determinarse, en una realización preferente, haciendo un seguimiento mediante FRET ("Fluerescent Resonance Energy Transfer") de la unión del sustrato (previamente marcado con un donador de fluorescencia) a la enzima presenilina, que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa, cuando la enzima está unida al anticuerpo a estudiar (previamente marcado con un aceptor de fluorescencia).

La presencia de una respuesta también puede determinarse, en otra realización preferente, estudiando los productos (derivados de la "escisión y" realizada por la presenilina, perteneciente al complejo enzimático γ-secretasa) por métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica. Por ello, en una realización preferida, la presencia de respuesta se determina mediante ensayos como Western blot, geles de electroforesis, inmunoprecipitación, arrays de proteína, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, ELISA o cualquier otro método enzimático; mediante la incubación con un ligando específico; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen; o, por ejemplo, mediante técnicas cromatográficas combinadas con espectrometría de masas. Los "productos/sustratos relacionados con la "escisión y" realizada por la presenilina" se refieren, preferiblemente, a un sustrato/producto amiloideo o un derivado/análogo de éste, más preferiblemente a los péptidos Αβ48 y Αβ49, como sustratos, y a los péptidos Αβ45, Αβ42, Αβ38, Αβ46, Αβ43, Αβ40 y Αβ37, como productos de la escisión γ. En una realización aun más preferida, el sustrato es Αβ48 y los productos son Αβ45, Αβ42 y/o Αβ38.

El criterio de selección de moléculas en el paso (c) ha de ser el siguiente: una vez que la molécula se ha unido al canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa (preferiblemente a una o varias de las regiones luminales de la invención), ésta debe ser capaz de disminuir el cociente entre los productos amiloideos Αβ42 y Αβ40 (Αβ42/Αβ40). La medida de este cociente puede realizarse in vitro mediante técnicas bien conocidas por el experto en la materia, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante la incubación con un anticuerpo específico para Αβ42 y otro para Αβ40, en ensayos como Western blot, geles de electroforesis, inmunoprecipitación, arrays de proteína, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, ELISA o cualquier otro método enzimático; mediante la incubación con un ligando específico; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen; o, por ejemplo, mediante técnicas cromatográficas combinadas con espectrometría de masas.

La región luminal de la invención presenta capacidad antigénica, por lo que puede ser empleada para la inmunización de un individuo, preferiblemente mamífero. Una vez producida la inmunización, se extrae el suero del animal inmunizado. La extracción del suero se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo aunque sin limitarnos, extracción sanguínea, posterior coagulación de ésta, eliminación del coágulo de fibrina y otros componentes y aislamiento del suero. Para obtener el suero, a la sangre no se aplica anticoagulante, sino que se deja que coagule y se centrifuga. Se entiende por "suero", "suero sanguíneo" o "suero hemático" el componente de la sangre resultante tras permitir la coagulación de ésta y eliminar el coágulo de fibrina y otros componentes, que contiene numerosos efectores biológicos, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas, segregados por los elementos formes al suceder dicha coagulación. Es de un color amarillo, un poco más intenso que el plasma. Posteriormente, se purifican los anticuerpos específicos frente a la región luminal de la invención empleada en la inmunización presentes en el suero obtenido. Son conocidos en el estado de la técnica diversos métodos de purificación de anticuerpos que podrían llevarse a cabo para tal fin, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, métodos electroforéticos o cromatográficos.

La región luminal también puede ser empleada para la inmunización de un ave. Preferiblemente, una vez producida la inmunización se recogen los huevos del animal inmunizado, se separan las yemas, eliminan los lípidos y precipitan/purifican los anticuerpos mediante diversos métodos conocidos en el estado de la técnica.

La "electroforesis" es una técnica analítica de separación basada en el movimiento o la migración de macro-moléculas disueltas en un medio (buffer de electroforesis), mediante una matriz o un apoyo sólido como resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula depende de su movilidad electroforética y esta movilidad depende de la carga, tamaño y forma. Existen numerosas variaciones de esta técnica basadas en el equipamiento usado, soportes y condiciones para llevar a cabo la separación de las moléculas. La electroforesis se selecciona de la lista que consiste en, pero sin limitarse, electroforesis capilar, electroforesis en papel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de poliacrilamida, isoelectroenfoque o electroforesis bidimensional.

Los "métodos cromatográficos" permiten la separación de las moléculas por, aunque sin limitarse, su carga, tamaño, masa molecular, mediante su polaridad o mediante su potencial redox. La técnica de cromatografía se selecciona de entre, pero sin limitarse, cromatografía de partición, filtración, cromatografía de adsorción, cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica o cromatografía de afinidad, y pueden realizarse tanto en columna, como en papel o en placa.

El péptido de secuencia SEQ ID NO: 20 es un péptido de 8 aminoácidos que corresponde a los residuos 14 a 21 de la secuencia aminoacídica del bucle luminal 1 (LL1 ) de la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 1 (SEQ ID NO: 6) ó 2 (SEQ ID NO: 10). Como se muestra en los ejemplos de la presente invención, este péptido de SEQ ID NO: 20 presenta capacidad antigénica y, por tanto, puede emplearse como se ha explicado anteriormente para la inmunización de un animal y la consiguiente obtención de anticuerpos. Como muestran los ejemplos, cuando al menos un anticuerpo específico frente a dicho péptido se encuentra unido al mismo en el complejo enzimático γ-secretasa, dicha interacción ejerce un impedimento estérico que impide la entrada del sustrato ΑβΡΡ al canal γ42 de la presenilina, provocando así una reducción en el cociente Αβ42/Αβ40.

Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a un péptido aislado que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 20, de ahora en adelante "péptido de la invención". Dicho péptido puede ser sintetizado, por ejemplo, aunque sin limitarnos, in vitro. Por ejemplo, mediante la síntesis de péptidos en fase sólida o mediante aproximaciones de ADN recombinante. El péptido de la invención puede producirse recombinantemente, no sólo directamente sino como un polipéptido de fusión junto con un polipéptido heterólogo, el cual puede contener, por ejemplo aunque sin limitarnos, una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de corte por una proteasa, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en el extremo N-terminal de la proteína madura o del polipéptido. La producción recombinante del péptido de la invención comprende la amplificación de un polinucleótido que codifica para dicho péptido, la clonación del polinucleótido amplificado en un vector de expresión, la transformación o transfección de una célula competente con dicho vector, el cultivo de dicha célula en condiciones que promuevan la expresión del péptido de la invención y el aislamiento y purificación del péptido producido por la célula.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que codifica para el péptido de la invención, de ahora en adelante "polinucleótido de la invención". Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción génica, preferiblemente un vector de expresión, que comprende dicho polinucleótido. Otro aspecto de la invención se refiere a una célula que comprende el polinucleótido de la invención o la construcción génica de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso del péptido de SEQ ID NO: 20 como diana farmacológica para el cribado de moléculas útiles para el tratamiento y/o prevención de la EA.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un anticuerpo específico frente a la región luminal de la invención, de ahora en adelante "anticuerpo de la invención". En una realización preferida, este anticuerpo de la invención es específico frente al péptido que consiste en la SEQ ID NO: 20.

El término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulinas o a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con la región luminal de la invención, preferiblemente con el péptido de SEQ ID NO: 20. Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, los cuales pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina o recombinantemente.

El anticuerpo de la invención puede ser policlonal (incluye típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonal (dirigido contra un único determinante en el antígeno). La expresión "anticuerpo monoclonal" alude a una población de moléculas de anticuerpos que contienen solamente una especie de un sitio de fijación de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno. El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, mediante manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento de la región luminal de la invención, preferiblemente del péptido de SEQ ID NO: 20, y estando sustituidas por otras que comunican al anticuerpo propiedades ventajosas adicionales. En una realización preferida el anticuerpo de la invención es un anticuerpo policlonal.

El anticuerpo de la invención también puede ser recombinante, humanizado, quimérico, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un "anticuerpo recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora transformada o transfectada con un polinucleótido que codifica para la región luminal de la invención o con el polinucleótido que codifica para el péptido de SEQ ID NO: 20, con un ácido nucleico codificante para el anticuerpo de la invención, o que produce el anticuerpo de la invención o la región luminal de la invención o el péptido de SEQ ID NO: 20 como resultado de la recombinación homologa. Dicha célula hospedadora incluye una célula en un cultivo celular "in vitro" así como una célula en un animal hospedador. El anticuerpo de la invención también puede ser quimérico. Así, una región de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de una especie determinada o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que la(s) cadena(s) restante(s) es(son) idéntica(s), u homóloga(s), a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la actividad biológica deseada.

Como se muestra en los ejemplos más adelante, un anticuerpo generado frente a cualquiera de las regiones luminales de la invención, preferiblemente frente al péptido de SEQ ID NO: 20, es capaz de bloquear la entrada del sustrato ΑβΡΡ al canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo γ-secretasa cuando se encuentra unido a su antígeno, lo cual se traduce en una disminución del cociente Αβ42/Αβ40 y así dicho anticuerpo es de utilidad para el tratamiento de enfermedades o condiciones patológicas en las que el procesamiento proteolítico del sustrato ΑβΡΡ esté implicado, como por ejemplo, pero sin limitarnos, la EA. Por ello, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo de la invención para la elaboración de un medicamento. O alternativamente, al anticuerpo de la invención para su uso como medicamento. En una realización preferida, el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de la EA.

El término "medicamento", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en los organismos, preferiblemente seres humanos, o que pueda usarse o administrarse a los organismos, preferiblemente seres humanos, con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica. El medicamento de la invención puede utilizarse tanto solo como en combinación con otros medicamentos o composiciones para mejorar el rendimiento cognitivo y/o promover el desarrollo cognitivo a modo de terapia combinada, pudiendo ser administrados al mismo tiempo o en tiempos diferentes. El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de la enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;

(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.

El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención, de ahora en adelante "composición farmacéutica de la invención". En una realización preferida la composición farmacéutica de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otro principio activo.

El "vehículo farmacéuticamente aceptable", es una sustancia que se emplea en la composición para diluir cualquiera de los componentes comprendidos en ella hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacéuticamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los elementos comprendidos en la composición de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros elementos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición.

Además, la composición farmacéutica de la invención puede comprender uno o más adyuvantes y/o excipientes. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de los elementos de la composición de la invención, estabiliza dichos elementos, activa o ayuda a la preparación de la composición en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que la hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos, como por ejemplo es el caso de almidones, azúcares o celulosas, la función de endulzar, la función de colorante, la función de protección de la composición, como por ejemplo, para aislarla del aire y/o la humedad, la función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, la función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

Preferiblemente, la composición de la invención comprende el anticuerpo de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva, entendiéndose por "cantidad terapéuticamente efectiva" el nivel, cantidad o concentración de anticuerpo de la invención que produzca el efecto deseado mejorando el rendimiento cognitivo y/o promoviendo el desarrollo cognitivo, preferiblemente, tratando y/o previniendo la EA, sin causar efectos adversos. La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del individuo al que le va a ser administrada la composición de la invención.

La composición de la presente invención puede formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica. Como ejemplos de preparaciones se incluye cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, gránulos, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para administración oral, tópica o parenteral. La composición de la presente invención también puede estar en forma de formulaciones de liberación sostenida de drogas o de cualquier otro sistema convencional de liberación, así puede estar contenida, aunque sin limitarnos, en nanopartículas, liposomas o nanosferas, en un material polimérico, en un implante biodegradable o no biodegradable o en micropartículas biodegradables, como por ejemplo, microesferas biodegradables.

Tal composición y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, y por tanto al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, percutánea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna o bomba de infusión.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Representación del complejo γ-secretasa desde una perspectiva luminal. Los dos canales alojan sendas estructuras cilindricas que representan al sustrato amiloideo: la blanca se localiza en el canal γ42, y la negra en el γ40.

Figura 2. Esquema representativo de las estructuras que configuran el acceso luminal al canal γ42 de la PS1 (Fig. 2a) y PS2 (Fig. 2b). Las distintas regiones luminales se representan recogidas dentro de los rectángulos (RL1 , RL2, RL3 y RL4). Los círculos concatenados representan residuos aminoácídicos. Los residuos de los bucles luminales LL1 , LL2, LL3 y LL4 se encuentran identificados con la letra del aminoácido correspondiente y sin rellenar. Los residuos de los extremos luminales de los dominios transmembrana TM-II, TM-lll, TM-V y TM-VII se encuentran identificados con la letra del aminoácido correspondiente y con relleno.

Figura 3. Gráfico que representa el porcentaje de amiloide Αβ42 y Αβ40 y el correspondiente cociente Αβ42/Αβ40 en el sobrenadante recogido en 24 de un cultivo de células de la línea neuronal SHSY5Y-APP695 cultivado en presencia de los anticuerpos policlonales generados frente al péptido de SEQ ID NO: 20, respecto a un cultivo control paralelo cultivado en ausencia de los anticuerpos.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos que demuestran la eficacia del uso del canal γ42 de la presenilina, y concretamente del péptido de SEQ ID NO: 20, como diana farmacológica para el cribado de moléculas útiles para el tratamiento y/o prevención de la EA. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante muestran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo 1. Producción de anticuerpos policlonales frente al péptido de SEQ ID NO: 20.

El péptido antigénico fue sintetizado mediante técnicas de fase sólida y purificado por HPLC (cromatografía liquida de alta presión) alcanzando una pureza del 97,21 %. Se modificó la secuencia peptídica original de la SEQ ID NO: 20, añadiendo un residuo de cisteína al extremo N-terminal del péptido. El péptido se unió covalentemente mediante enlaces disulfuro a BC ("Blue Carrier Immunogenic Protein" de Pierce). Se inmunizaron un total de dos gallinas con el complejo BC-péptido y adyuvante de Freund (de Sigma) y se inyectaron refuerzos con intervalos de 14, 28 y 56 días. Se recogieron los huevos de cada gallina entre los días 40 y 71 posteriores al comienzo de la inmunización. Se separaron las yemas, eliminaron los lípidos y precipitaron/purificaron los anticuerpos con el kit de separación de Pierce ("Pierce Chicken IgY Purification Kit" de Thermo Scientific). Se obtuvieron dos lotes de anticuerpo correspondientes a cada uno de los animales inmunizados: PoliclonaH y Policlonal2.

Ejemplo 2. Acción terapéutica asociada al bloqueo del canal γ42 con los anticuerpos generados.

La acción terapéutica asociada al bloqueo del canal γ42 no estuvo asociada con una reducción de los niveles de Αβ total, toda vez que el aumento en la producción de Αβ40, a través del canal que no es objeto del bloqueo (γ40), iba acompañado del aumento en el fragmento intracelular del ΑβΡΡ correspondiente (AICD50 ó C50) responsable de un aumento en la expresión del sustrato ΑβΡΡ en 8.7 veces su valor (Sébastien Hébert et al., 2006, EMBO Reports, 7(7), 739-745). El resultado neto fue un aumento de la cantidad total de Αβ, a expensas de un importante aumento en la cantidad de Αβ40, y aumento inferior de Αβ42 con respecto al incremento de Αβ40, lo que llevó a una disminución del cociente Αβ42/Αβ40. Este resultado, lejos de ser un problema por el paradójico aumento de Αβ42, corrige las características fenotípicas patológicas que presentan la mayoría de las mutaciones de los pacientes con EA de causa monogénica, descritas en el apartado anterior (Eric Karran, et al., 201 1 , Nature Reviews Drug Discovery, 10, 698-712):

1. Descenso de la cantidad global de amiloide producido, Αβ total.

2. Aumento del cociente Αβ42/Αβ40.

En este sentido, existen evidencias de que se produce una regulación positiva del cociente Αβ40/ Αβ42 (o de otro modo: regulación negativa del cociente Αβ42/ Αβ40) con aumento de la cantidad total de Αβ, (aumento en la cantidad de Αβ40 y aumento inferior de Αβ42 con respecto al incremento de Αβ40) en estudios de plasticidad sináptica que permiten ampliar el espectro del tratamiento propuesto a pacientes con EA esporádica (Iftach Dolev et al., 2013, Nature Neuroscience, 16(5), 587-595).

Se evaluó el bloqueo del canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa mediante los anticuerpos policlonales desarrollados contra el péptido SEQ ID NO: 20 descritos en el ejemplo 1 . Se expusieron células de la línea neuronal SHSY5Y-APP695 cultivadas hasta una confluencia del 80-90% en medio DMEM (de Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (de Invitrogen- Gibco). Las células fueron desprendidas de la placa utilizando sólo medios mecánicos. A continuación fueron sembradas en medio Opti-MEM (de Invitrogen-Gibco) en una concentración aproximada de 3,5 x 104 células/pocilio. Las células fueron cultivadas durante 24 horas (a 37°C, 5% C02) en presencia (concentración final: 6.000 nM) y en ausencia de anticuerpo policlonal (cultivo control). Se midieron los niveles de Αβ40 y Αβ42, tanto de los sobrenadantes a las 24 horas como los del medio de cultivo Opti- MEM (que se consideró como nivel basal, de referencia), utilizando los kits de ELISA "Colorimetric BetaMark™ Beta-Amyloid x-40 ELISA kit" (de Covance) y "Colorimetric BetaMark™ Beta-Amyloid x-42 ELISA kit" (de Covance) respectivamente.

Los resultados se muestran gráficamente en la figura 3. Estos resultados logran invertir las características fenotípicas que presentan la mayoría de las mutaciones de los pacientes con EA de causa monogénica, ya comentadas. De este modo, lo que se observó es: Aumento de la cantidad global de amiloide producido, Αβ total, respecto al control sin exposición al anticuerpo.

Descenso del cociente Αβ42/Αβ40, respecto al control sin exposición al anticuerpo.

REIVINDICACIONES

1. Uso del canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ- secretasa como diana farmacológica para el cribado de moléculas útiles para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad de Alzheimer (EA).

2. Uso del canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ- secretasa según la reivindicación 1 , donde dicho canal está delimitado por: a) una primera región luminal (RL1 ) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina y el bucle luminal 1 (LL1 ) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II), b) una segunda región luminal (RL2) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll) de la presenilina y el bucle luminal 2 (LL2) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll), c) una tercera región luminal (RL3) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina y el bucle luminal 3 (LL3) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V), y d) una cuarta región luminal (RL4) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina y el bucle luminal 4 (LL4) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII).

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde la presenilina es la presenilina 1 ó 2.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, donde el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM- III) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica LVG.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, donde el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM- III) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5, el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica LVG.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde el bucle luminal 1 (LL1 ) de la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 6, el bucle luminal 2 (LL2) de la segunda región luminal (RL2) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7, el bucle luminal 3 (LL3) de la tercera región luminal (RL3) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8 y el bucle luminal 4 (LL4) de la cuarta región luminal (RL4) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 5, donde el bucle luminal 1 (LL1 ) de la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 10, el bucle luminal 2 (LL2) de la segunda región luminal (RL2) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 1 , el bucle luminal 3 (LL3) de la tercera región luminal (RL3) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8 y el bucle luminal 4 (LL4) de la cuarta región luminal (RL4) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12.

8. Uso según la reivindicación 2, donde la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 13, la segunda región luminal (RL2) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 14, la tercera región luminal (RL3) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 y la cuarta región luminal (RL4) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 16.

9. Uso según la reivindicación 2, donde la primera región luminal (RL1 ) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 17, la segunda región luminal (RL2) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 18, la tercera región luminal (RL3) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 y la cuarta región luminal (RL4) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 19.

10. Región luminal del canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa seleccionada de la lista que consiste en: a) región luminal 1 (RL1 ) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina y el bucle luminal 1 (LL1 ) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II), b) región luminal 2 (RL2) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll) de la presenilina y el bucle luminal 2 (LL2) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-lll), c) región luminal 3 (RL3) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V) de la presenilina y el bucle luminal 3 (LL3) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM-V), y d) región luminal 4 (RL4) que comprende el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina y el bucle luminal 4 (LL4) de la presenilina que enlaza con dicho extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII).

1 1 . Región luminal según la reivindicación 10, donde la presenilina es la presenilina 1 ó 2.

12. Región luminal según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 1 1 , donde el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 , el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-II I) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2, el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM- V) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica LVG.

13. Región luminal según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 1 1 , donde el extremo luminal del dominio transmembrana 2 (TM-II) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4, el extremo luminal del dominio transmembrana 3 (TM-II I) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5, el extremo luminal del dominio transmembrana 5 (TM- V) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3 y el extremo luminal del dominio transmembrana 7 (TM-VII) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica LVG.

14. Región luminal según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde el bucle luminal 1 (LL1 ) de la región luminal 1 (RL1 ) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 6, el bucle luminal 2 (LL2) de la región luminal 2 (RL2) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7, el bucle luminal 3 (LL3) de la región luminal 3 (RL3) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8 y el bucle luminal 4 (LL4) de la región luminal 4 (RL4) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 9.

15. Región luminal según cualquiera de las reivindicaciones 10, 1 1 ó 13, donde el bucle luminal 1 (LL1 ) de la región luminal 1 (RL1 ) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 10, el bucle luminal 2 (LL2) de la región luminal 2 (RL2) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1 1 , el bucle luminal 3 (LL3) de la región luminal 3 (RL3) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 8 y el bucle luminal 4 (LL4) de la región luminal 4 (RL4) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 12.

16. Región luminal según la reivindicación 10, donde la región luminal 1 (RL1 ) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 13, la región luminal 2 (RL2) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 14, la región luminal 3 (RL3) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 y la región luminal 4 (RL4) de la presenilina 1 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 16.

17. Región luminal según la reivindicación 10, donde la región luminal 1 (RL1 ) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 17, la región luminal 2 (RL2) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 18, la región luminal 3 (RL3) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 15 y la región luminal 4 (RL4) de la presenilina 2 consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 19.

18. Uso de la región luminal según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17 como diana farmacológica para el cribado de moléculas útiles para el tratamiento y/o prevención de la EA.

19. Método de cribado de moléculas útiles para el tratamiento y/o prevención de la EA, que comprende: a. Poner en contacto una molécula a estudiar con el canal γ42 de la presenilina que forma parte del complejo enzimático γ-secretasa, ex vivo, o con la región luminal aislada según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17,

b. Analizar la interacción entre la molécula a estudiar y las regiones luminales según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, y

c. Seleccionar la molécula del paso (a) para el tratamiento y/o prevención de la EA cuando ésta se ha unido a al menos una de las regiones luminales según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.

20. Anticuerpo específico frente a la región luminal según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17.

21 . Anticuerpo según la reivindicación 20, donde el anticuerpo es policlonal.

22. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 para la elaboración de un medicamento.

23. Uso del anticuerpo según la reivindicación 22, donde el medicamento es para el tratamiento y/o prevención de la EA.

24. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 .

25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y/u otro principio activo.


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