Culturing And Detection Of A Methanogenic Archaeon

Culture et détection d'une Archaea méthanogène

La présente invention concerne une nouvelle Archaea isolée et établie en culture, un milieu de culture de ladite Archaea, un procédé de préparation dudit milieu de culture et des procédés de culture et de détection de ladite Archaea. Les Archaea sont des procaryotes constituant un des quatre domaines de la vie au côté des eukarya, des bactéries et des virus géants à ADN [16]. Initialement isolées de l'environnement et en particulier des environnements extrêmes qui leur ont valu leur nom de extrêmophiles, les Archaea ont ensuite été détectées chez différents animaux invertébrés et vertébrés comprenant notamment les oiseaux et les mammifères. Chez les mammifères, ce sont les Archaea méthanogènes capables de détoxifier l'hydrogène avec synthèse du méthane qui ont été essentiellement détectées et ces Archaea ont donc une importance considérable actuellement puisqu'il est considéré que l'émission de méthane par les bovins de rapport constitue la source essentielle de destruction de la couche d'ozone dans l'environnement. Chez l'homme également, les analyses méta génomiques ont montré la présence de signatures ADN spécifiques de plusieurs espèces d'Archaea qui appartiennent essentiellement aux deux phyla Euryarcheaota et aux Archaea halophiles ; plus particulièrement, les séquences détectées chez l'homme indiquent la présence de Methanosarcina, Thermoplasma, Crenarchaeaota, et des Archaea halophiles ainsi qu'un dernier ordre de méthanogènes [1 à 6]. Parmi toutes ces Archaea, seules trois espèces d'Archaea ont été isolées chez l'homme : Methanobrevibacter smithii [7], Methanosphaera stadtmanae [8], et Methanobrevibacter oralis [9] et seuls M. smithii et M. stadtmanae ont été isolées à partir du tube digestif.

Chez l'homme, ces Archaea méthanogènes participent à l'homéostasie de la flore digestive en détoxifiant l'hydrogène avec production de méthane et participent donc à la régulation du pH. Egalement, certaines Archaea sont impliquées en pathologie orale en infection polymicrobienne au cours des parodontopathies. Il a été montré que le portage digestif d'Archaea méthanogènes était constant chez tous les individus [12], et les travaux antérieurs par études métanogénomiques et par analyses moléculaires de la flore digestive humaine, montraient une prévalence d'Archaea d'environ 30 % des individus testés et une variété de séquences ADN explicitée ci- dessus. Pour isoler M. smithii, les auteurs [7] ont utilisé un échantillon de matières fécales inoculées dans du milieu 1 de Balch (composition indiquée dans le Tableau 3 ci- après) [10], sous une atmosphère de H2-C02 (80 : 20) pressurisée à 2 atmosphères (202.6 kPa), sous agitation. Après 2 à 3 h, des échantillons de 0.5 ml de l'atmosphère ont été analysés pour détecter la présence de méthane par chromatographie en phase gazeuse. Des isolats producteurs de méthane et fluorescents pour le facteur-420 (comme déterminé par microscopie en épifluorescence) ont été sous-cultivés sur le milieu 1 de Balch additionné de 2 % d'agar jusqu'à ce qu'une culture pure ait été obtenue; les critères de pureté étaient la morphologie uniforme des cellules, la production de méthane, la fluorescence factor-420 de toutes les cellules et l'absence de croissance dans un milieu complexe (SMS) contenant des hydrates de carbone sans substrat pour la méthanogénèse.

Pour isoler M. stadtmanae, les auteurs [9] ont utilisé un milieu de culture El (Tableau 3 ci-après) modifié par l'addition de fluide de rumen à 30% (v/v), de clindamycine et de céphalothine, respectivement, de 0.4% méthanol et d'une atmosphère composée de N2, 80%, et C02, 20%. La culture a été maintenue par des transferts mensuels (10% vol.) dans le même milieu. Une morphologie sphérique brillante par fluorescence du facteur 420 était le morphotype dominant. Au jour 60, la culture a été sous-cultivé dans le milieu 1 de Balch modifié par ajout de fluide de rumen, NH4C1, cepthalothin et clindamycine [7] avec du méthanol sous une atmosphère de 80% H2 : et C02, 20%. Une culture pure d'une Archaea sphérique- méthanogène, a été obtenue.

Pour isoler M. oralis, les auteurs ont utilisé sensiblement le même milieu de culture que celui utilisé pour isoler M. smithii [9]. Les Archaea constituent des microorganismes d'intérêt médical et vétérinaire compte tenu de leur rôle en physiologie et éventuellement en pathologie.

Le but de la présente invention était donc d'isoler et d'établir en culture une nouvelle Archaea dont l'existence avait été présumée dans la flore digestive chez l'homme par des travaux antérieurs [12]. Pour ce faire, les inventeurs ont déterminé les milieux et conditions spécifiques d'isolement et culture de ladite Archaea ce qui leur a ainsi permis de disposer suffisamment d'ADN de ladite Archaea pour en déterminer la séquence complète du gène 16S ADNr et confirmer ainsi sa spécificité et la nouveauté de ladite Archaea.

Plus précisément la présente invention fournit une nouvelle Archaea isolée et établie en culture, comprenant la séquence spécifique du gène 16S ADNr (ADN ribosomal) SEQ. ID. n°l dans le listage de séquences que les inventeurs ont dénommée Methanomassiliicoccus luminyensis.

Plus particulièrement la présente invention a pour objet une Archaea déposée à la collection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne), conformément au Traité de Budapest, sous le numéro DSM 24529 le 23 Juin 2011, par l'Université de la Méditerranée, faculté de médecine Timone, Marseille, France.

Cette nouvelle Archaea n'a pas pu être isolée et établie en culture à l'aide des milieux et conditions de culture précédemment décrites pour les Archaea précédemment isolées et établies en culture, y compris pour les Archaea méthanogènes. La présente invention a également pour objet un procédé de culture d'une

Archaea M. luminyensis selon l'invention, à l'aide d'un milieu de culture comprenant un milieu de base de culture d'Archaea méthanogène, caractérisé en ce qu'il comporte en outre :

- du méthanol à une concentration molaire de 5 à 100 mM, de préférence 10 à 50 mM, et

- un sel de tungstate et un sel de sélénite, chacun à une concentration molaire de 5.10"3 à 0,5 mM, de préférence 5.10"2 à 0,5 mM.

Les inventeurs émettent l'hypothèse sans être liée par cette théorie, que le méthanol intervient ici comme accepteur d'électrons et les sels de tungstène et sélénium comme cofacteur d'une enzyme intervenant dans le transfert d'électrons.

De préférence, ledit milieu de culture comprend en outre :

- un sel de molybdate et un sel de nickel, chacun à une concentration molaire de 10"3 à 10"2 mM, et - un sel de formate, à une concentration molaire de 1 à 10 mM, de préférence 6 mM.

Plus particulièrement, le milieu selon la présente invention comprend des composants choisis parmi les composants suivants, de préférence tous les composants suivants : a- sel de sélénite Na2Se03, à une concentration de 0,001 mg/l à 0,1 mg/l, de préférence 0,01 à 0,1 mg/l, de préférence encore 0,015 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Se03.5H20, et b- sel de tungstate Na2W04, à une concentration de 0,001 mg/l à 0,1 mg/l, de préférence encore 0,02 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2W04.2H20, c- sel de molybdate Na2Mo04, à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/l, de préférence 0,02 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Mo04.2H20, et d- sel de NiCI2 à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/l, de préférence 0,7 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate NiCI2.6H20, et e- sel de formate NaHC02 à une concentration de 0,1 à 1 g/1, de préférence 0,4 g/1.

De préférence, le milieu de culture comprend en outre des acides gras volatiles (ci-après abrégés "AGV") à une concentration molaire de 1 à 10 mM, de préférence de 5 à 7 mM pour chacun desdits acides gras volatiles.

Plus particulièrement, les acides gras volatiles sont des acides gras à chaînes carbonées courtes, de moins de 6 atomes de carbone, plus particulièrement de 4 à 6 atomes de carbone, plus particulièrement encore les acides gras choisis parmi les acide valérique (C5H10O2), acide isovalérique (C5H10O2), acide 2-méthylbutyrique (C5H10O2), acide isobutyrique (C4H802), acide 2-méthylvalérique (C6H1202).

Dans les valeurs de concentration ci-dessus : 1 M = 1 mol/1

Plus particulièrement, ledit milieu de base de culture d'Archaea comprend au moins : - plusieurs sources de carbone et d'azote, de préférence choisie parmi un extrait de levure, un sel d'acétate, un sel de formate et une peptone trypsique,

- une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate,

- une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium, - au moins un sel de chacun des métaux K, Mg, Na, Ca, de préférence NaCI,

- une substance réductrice, plus particulièrement choisie parmi la cystéine-HCI et Na2S,

- une substance tampon régulateur de pH de 7 à 7,5, de préférence KOH3 pour ajuster le pH à 7,5, - des oligoéléments, de préférence des sels choisis parmi des sels de Fe, Ni, W,

Se, Mo, Mn, Cu, Zn, B, Co, de préférence encore des oligoéléments de Widdel,

- des vitamines, de préférence les vitamines du milieu de Balch,

- de préférence, un indicateur d'oxydoréduction pour contrôler l'anaérobie, de préférence la résazurine. Les oligoéléments de Balch sont listés au tableau 4 ci-après et comprennent

NaCI, FeS04, ZnS04, MgS04, MnS04, CoS04, H3B03, NiCI2, Na2Mo04, CaCI2.

Les oligoéléments de Widdel sont listés au tableau 5 ci-après et comprennent FeCI2, CoCI2, MnCI2, ZnCI2, H3B03, Na2Mo04, NiCI2 et CuCI2.

Les vitamines du milieu de Balch sont listées au tableau 6 ci-après et comprennent la biotine, acide folique, hydrochlorure de pyridoxine, hydrochlorure de thiamine, riboflavine, acide nicotinique, pantothénate de DL-calcium, vitamine B12, Acide p-aminobenzoïque, acide lipoique.

Plus particulièrement, ledit milieu de culture selon l'invention contient les espèces suivantes : KH2P04, K2P04, MgS047H20, NaCI, KCI, KOH, NH4CI, CaCI2.2H20, KOH, NaCOOCH3 cystéine, extrait de levure, trypticase peptone, NaOH, NaHC02, CH3OH, Na2S, NaHC03, NaHC02, Na2Se03.5H20, Na2W04.2H20, Na2Mo04.2H20, NiCI2.6H20, FeS04.7H20, des oligoéléments de widdel, des vitamines de Balch et de préférence résazurine; le pH étant ajusté à 7,5.

Plus particulièrement encore, le milieu selon la présente invention comprend les composants aux concentrations mentionnées dans les tableaux 1B, 1C et 1D ci-après. Ledit milieu de culture selon l'invention peut se trouver initialement à l'état liquide auquel cas il comporte de l'eau distillée ou dans un état lyophilisé apte à être régénéré par ajout d'eau distillée ou encore à l'état solide, notamment sous forme gélosée, plus particulièrement par ajout d'agar, plus particulièrement agar à 2% final.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un milieu de culture stérilisé selon l'invention caractérisé en ce qu'on réalise les étapes successives suivantes dans lesquelles:

1- on place un dit milieu de culture ne contenant pas les composants susceptibles d'être dégradés par chauffage comprenant ledit méthanol, desdites vitamines, des sels de sodium labiles comprenant NaHC02, NaHC03 et Na2S et, le cas échéant, lesdits acides gras volatiles (AGV), ci-après dénommé "milieu de culture incomplet", sous atmosphère d'anaérobie, de préférence sous un flux d'azote, dans au moins un récipient étanche, notamment un tube que l'on scelle de manière étanche, et

2- de préférence, l'atmosphère gazeuse dudit récipient étanche est remplacée par un mélange N2/C02 à 80/20%, et 3- on stérilise par chauffage ledit milieu de culture incomplet, de préférence dans un autoclave, une température supérieure à 100°C pendant au moins 15 mn, et

4- on refroidit ledit milieu de culture incomplet à température ambiante et on ajoute dans ledit milieu de culture incomplet, lesdits composants susceptibles d'être dégradés par stérilisation dans un autoclave comprenant le méthanol, lesdites vitamines, lesdits sels de sodium labiles comprenant NaHC03, NaHC02 et Na2S.

Plus particulièrement, la température à l'étape 3 du procédé de préparation ci- dessus est de 120°C pendant au moins 20 minutes ou 110 °C pendant au moins 45 minutes. La présente invention a également pour objet un procédé de culture d'une Archaea selon l'invention avec un dit milieu de culture dans lequel on réalise les étapes successives suivantes :

1- on inocule un échantillon biologique susceptible de contenir une dite Archaea dans ledit milieu de culture en anaérobie, de préférence sous atmosphère d'azote, et

2- on place ledit milieu de culture sous une atmosphère d'anaérobiose et contenant au moins 50% d'hydrogène à une pression inférieure à 2 atm, et

3- on réalise une incubation à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C, pour atteindre une phase exponentielle de croissance avec dégagement de méthane en au moins 1 jour, de préférence en pas plus de 15 jours, de préférence encore pas plus de 7 jours.

De préférence, à l'étape 2 du procédé de culture ci-dessus, ledit milieu de culture est placé sous une atmosphère composée H2/CO2 dans une proportion volumique de 80/20% à une pression de 1 à 2 atm. Les milieu et procédé de culture ci-dessus ont permis d'établir en culture ladite

Archaea c'est-à-dire que celle-ci peut ainsi être sous cultivée indéfiniment.

Plus particulièrement, il est possible d'obtenir une culture en phase exponentielle de croissance en 1 à 10 jours, de préférence pas plus de 7 jours, cette phase de croissance se caractérisant par : (1) une production de méthane d'au moins 10 μΜ, tel que déterminé par chromatographie en phase gazeuse, et

(2) une visualisation au microscope à fluorescence de microorganismes sphériques d'une taille de 0,5 à 1 μιτι, et auto fluorescents à 420 nm.

Plus particulièrement, on réalisera les sous-cultures par repiquage à l/10ème à l/5ème de la culture en dite phase de croissance.

Enfin, la présente invention a également un procédé de détermination de la présence d'une dite Archaea dans un échantillon biologique, de préférence dans un échantillon de selles animales ou humaines selon l'invention ou d'une dite Archaea cultivée selon le procédé de l'invention caractérisé en ce que l'on extrait l'ADN dudit échantillon biologique et on détecte et de préférence on quantifie spécifiquement l'ADN de ladite Archaea par amplification enzymatique du type PCR de préférence du type PCR en temps réel avec un couple d'amorces et de préférence une sonde de séquences tirées du gène 16S ADNr de séquence SEQ.ID N°l.

Plus particulièrement, ledit couple d'amorces et de préférence ladite sonde présentent les séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr:

Amorce 5' directe : SEQ.ID. N° 2 = 5'-GTTCGTAGCCGGTCTGGTAA-3' Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 3 = 5'-CCAAGTCTGGCAGTCTCCTC-3'

Sonde : SEQ.ID. N° 4 = 5'-TCGGG AAGCTTAACTTTCCGACTTCC-3.

Plus particulièrement encore, on réalise au préalable une amplification enzymatique du type PCR spécifiquement de l'ADN de toutes Archaea contenues dans ledit ADN extrait de l'échantillon avec un couple d'amorces consensus de séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr

Amorce 5' directe : SEQ.ID. N° 5 =5'-AGCCGCCGCGGTAAYAC-3'

Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 6 = 5'-CYGGCGTTGAVTCCAATT-3'.

Ces amorces universelles de toutes Archaea ont été initialement déterminées par les inventeurs pour permettre d'identifier et déterminer le gène 16S de l'ADNr de ladite Archaea.

La présente invention a donc aussi pour objet un kit de détection d'une Archaea selon l'invention pour la mise en œuvre d'un procédé de détection selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend : - un dit milieu de culture de préférence lyophilisé ou sous forme solide, et

- des réactifs de mise en œuvre d'une amplification enzymatique d'ADN de type

PCR, et - des oligonucléotides constituants des dites amorces et sonde tirées de SEQ. ID. n°l, de préférence choisies parmi SEQ. ID. n°2 à 6.

La présente invention fournit également un protocole automatisé très performant d'extraction des ADN û'Archaea, performante, reproductible et facile à mettre en œuvre en routine de laboratoire afin de faciliter l'analyse d'un grand nombre d'échantillon dans un but tant diagnostique qu'épidémiologique, permettant l'extraction de la totalité des ADN.

Pour ce faire, les inventeurs ont mis au point une technique d'extraction semi automatisée de l'ADN en alternant lyse mécanique et lyse enzymatique avec au moins deux lyses mécaniques. Les inventeurs ont optimisé toutes les étapes d'extraction de la lyse des bactéries jusqu'au choix de la méthode d'extraction qu'elle soit manuelle ou automatique, en tenant compte de l'efficacité et de la reproductibilité de la méthode. Enfin, les inventeurs ont comparé la technique d'extraction retenue avec celle utilisée par les principaux auteurs qui ont publiés sur ce sujet. Plus précisément, selon la présente invention, pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit échantillon de selles, on réalise les étapes dans lesquelles :

1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, à une dilution de 0,01 à 1 g/1, de préférence à une dilution 0,2 g/ml, et 2) on réalise une lyse mécanique automatisée par mélange et agitation de ladite suspension de l'étape 1) avec un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, dans un appareil réalisant une forte agitation, notamment par rotation multidirectionnelle.

3) de préférence, on chauffe la suspension obtenue à au moins 100°C pendant au moins 10 minutes, et

4) on réalise une lyse chimique et/ou enzymatique par mélange et agitation du surnageant de la suspension obtenue à l'étape 2) ou 3) avec un ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatique, puis 5) on répète l'étape 2) de lyse mécanique mais avec le mélange obtenu à l'étape 4), et

6) de préférence, on répète l'étape 4) de lyse chimique et/ou lyse enzymatique avec le mélange obtenu à l'étape 5). De façon connue, on sépare in fine l'ADN soit avec des méthodes connues telles que par fixation sur une colonne contenant du silicate puis lavage pour éluer ladite ADN en le séparant de la colonne ou par lavage et centrifugation pour récupérer lesdits fragments d'ADN.

La réalisation de la première étape de lyse mécanique permet d'optimiser et de favoriser le travail d'agents chimiques ou enzymatiques de lyse à l'étape 2) en favorisant leur pénétration dans les micro-organismes procaryotes permettant de dégrader partiellement les parois épaisses des micro-organismes procaryotes à paroi épaisse, et la dégradation totale des parois épaisses est obtenue seulement par au moins une deuxième lyse mécanique après ladite première lyse chimique ou enzymatique.

A l'étape 3), le chauffage permet de finaliser la dégradation des composants des parois et membranes des microorganismes.

Plus particulièrement, on réalise les étapes suivantes : a) 1 gramme de selles est suspendu dans 5 ml d'une solution de Tris-HCI 0.05 M à pH 7,5, et b) des aliquots de la suspension sont transférés dans un tube Eppendorf stérile contenant de la poudre de billes de verre lavées à l'acide et agités pour réaliser une lyse mécanique dans un dit appareil à rotation multidirectionnelle, tel qu'un appareil FastPrep-24 Instrumente (MP Biomédicale Europe Illkirch, France) à vitesse 6,5 m/s pendant 90 secondes, et c) Le surnageant est incubé durant la nuit à 56°C avec un tampon de lyse chimique du kit d'extraction d'ADN d'EZl® et un tampon de lyse enzymatique comprenant une Protéinase K, et d) Après un deuxième cycle de lyse mécanique comme décrit ci-dessus en b), le surnageant est incubé pendant 10 minutes à 100°C et l'ADN total est alors extrait en utilisant l'extracteur EZ1, et le kit d'extraction d'ADN d'EZl® (Qiagen, Courtaboeuf, France) selon le procédé du fabricant. Enfin, la présente invention fournit un kit utile pour un procédé de détermination de la présence d'une dite Archaea selon l'invention caractérisé en ce qu'il comprend :

- des réactifs d'amplification d'ADN comprenant des amorces et sonde de détection de ladite Archaea M. luminyensis, comprenant des oligonucléotides constituants desdites amorces et sonde tirées de SEQ. ID. n°l, de préférence choisis parmi SEQ. ID. n°2 à 4, et

- des amorces spécifiques de toute Archaea de séquences SEQ. ID. n°5 et 6, et

- de préférence encore, des réactifs d'extraction d'ADN comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et des réactifs de lyse chimique et/ou enzymatique, notamment un tampon de lyse chimique du kit d'extraction d'ADN d'EZl® et un tampon de lyse enzymatique comprenant une Protéinase K.

De préférence, on met en œuvre des réactions d'amplification et quantification par PCR en Temps Réel, à l'aide de sondes d'hydrolyse spécifiques. La technique de PCR en Temps Réel, consiste en une PCR classique en utilisant des amorces de séquence directe et inverse, et comprend une détection du produit amplifié basée sur la mesure d'émission de fluorescence proportionnelle à la quantité de gènes amplifiés avec une sonde dite « d'hydrolyse ». Pour cela, ladite sonde est marquée par un émetteur de fluorescence ou fluorophore en 5' et un agent bloquant l'émission de fluorescence en 3'. Cet agent bloquant absorbe la fluorescence émise lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont proches. Lorsque le fluorophore et l'agent bloquant sont séparés, l'émission de fluorescence n'est plus absorbée par l'agent bloquant. Lors de son passage, la Taq polymérase entraîne une hydrolyse de la sonde et donc une libération des nucléotides et du fluorophore en solution. L'émission de fluorescence sera donc proportionnelle au nombre d'amplifiat. Le principe de la PCR en temps réel repose sur la capacité de la Taq polymérase pendant l'étape d'élongation d'hydrolyser une sonde hybridée sur l'ADN à copier, cette hydrolyse permettant l'émission de fluorescence, laquelle permet une quantification. Au cours de la même réaction, on peut quantifier deux cibles différentes, en introduisant dans le mélange réactionnel deux amorces et une sonde dirigées contre une première cible, et deux autres amorces et sonde dirigées contre l'autre cible. Les deux sondes étant marquées avec des fluorophores différents.

De préférence encore, on met en œuvre un grand fragment synthétique d'ADN servant de standard d'étalonnage de quantification de l'ADN, ledit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdites séquences spécifiques respectivement de chacune desdites bactéries ou espèce procaryote dont les concentrations sont quantifiées. La présence de plusieurs cibles moléculaires sur un même fragment nucléique permet de quantifier des cibles différentes dans un même échantillon et de les coquantifier de façon homogène, la quantification en utilisant la même gamme d'étalonnage de plusieurs espèces moléculaires, permettant la comparaison de l'efficacité des différentes réactions de PCR entre elles et d'une détermination à l'autre au cours du temps et évite les biais liés au témoin positif.

On entend par "fragment d'ADN", un fragment d'ADN ou oligonucléotide dont les séquences sont écrites ci-après dans le sens 5'→3'. On entend ici par "sonde", un oligonucléotide, de préférence encore de 20 à 30 nucléotides, s'hybridant spécifiquement avec ladite séquence spécifique et donc permettant de la détecter et de la quantifier de façon spécifique grâce à la mesure de l'accroissement de la fluorescence liée de la réaction de PCR.

La sonde permet de détecter l'ADN spécifique amplifié et de le quantifier par comparaison de l'intensité du signal avec celui du standard de quantification.

On entend ici par "amorce", un oligonucléotide de préférence de 15 à 25 nucléotides qui s'hybride de façon spécifique avec une des 2 extrémités de la séquence que l'ADN polymérase amplifiera dans la réaction de PCR.

Dans les méthodes de quantification d'ADN pour PCR en Temps Réel, il est important de savoir si une réaction positive n'est pas due à une contamination par le plasmide recombinant utilisé comme standard de quantification ou comme témoin positif. Pour résoudre ce problème, un site de coupure par un enzyme de restriction est avantageusement introduit dans au moins une des cibles moléculaires. Ce site étant absent sur la séquence naturelle. Donc, par coupure enzymatique et analyse du fragment amplifié sur gel d'agarose, ou en utilisant une sonde de PCR en temps réel qui reconnaît spécifiquement le site de restriction, on peut ainsi détecter la présence éventuelle du plasmide contaminant.

Ainsi, on peut mettre en œuvre plus particulièrement, les étapes suivantes dans lesquelles : 1. on réalise une réaction d'amplification enzymatique de type PCR de l'ADN d'au moins une dite séquence spécifique d'au moins un desdits agents, dans l'ADN extrait desdits échantillons selon l'invention à tester et dans l'ADN de l'échantillon standard d'étalonnage, à l'aide d'au moins un jeu d'amorces apte à amplifier à la fois au moins ladite séquence spécifique authentique et ladite séquence spécifique modifiée;

2. on vérifie si les amplifiats éventuels de l'ADN extrait desdits échantillons à tester, comprennent une dite séquence spécifique, et

3. on détecte les faux positifs éventuels provenant de contaminations éventuelles desdits échantillons à tester par de l'ADN provenant de l'échantillon de standard d'étalonnage, par l'une au moins des étapes suivantes :

3a. on réalise une digestion enzymatique du produit de PCR obtenu avec une enzyme correspondant au site de clivage et analyse sur gel d'agarose du produit de digestion en comparaison avec le produit de PCR non digéré par l'enzyme de restriction. Si le fragment digéré provient de l'amplification de la cible moléculaire insérée dans le plasmide témoin, il contient le site de restriction, et il sera d'une taille inférieure au fragment non digéré. 3b. on réalise une réaction de type PCR en temps réel avec des amorces directes et inverses de l'une des cibles moléculaires, et une sonde spécifique de ladite séquence exogène contenant le site de restriction.

Seul un fragment provenant du plasmide témoin et contenant la séquence exogène pourra être amplifié.

Avantageusement encore, on réalise des réactions d'amplification et de quantification en mettant en œuvre des jeux d'amorces et des sondes d'hydrolyse spécifiques de chacune des différentes bactéries dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries à tester, et le cas échéant d'une séquence spécifique d'ADN humain dans l'échantillon à tester, telle que une séquence spécifique de l'albumine humaine, et ladite séquence spécifique comprend une séquence sonde encadrée par des séquences aptes à servir comme amorce dans une réaction d'amplification du type PCR desdites séquences spécifiques.

Avantageusement encore, on met en œuvre une pluralité de réactions d'amplifications enzymatiques PCR simultanées ou non de chacune desdites séquences spécifiques desdites bactéries avec le même grand fragment d'ADN synthétique étalon, à l'aide d'une pluralité de différents jeux d'amorces spécifiques de chacune des différentes dites séquences spécifiques de chacune desdites bactéries, les séquences des différentes amorces ne se croisant pas entre les différentes dites bactéries et lesdites amorces pouvant être mises en œuvre dans une réaction d'amplification enzymatique réalisée selon le même protocole et, notamment, à la même température d'hybridation.

La présente invention a également pour objet une trousse de détection utile pour la mise en œuvre d'une méthode de détection selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend :

- des échantillons d'ADN standard d'étalonnage à une concentration connue comprenant desdites séquences spécifiques de chacun desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence bactérienne universelle telle que définie ci-dessus, et de préférence encore un dit grand fragment d'ADN synthétique regroupant desdits séquences spécifiques de chacun desdites bactéries tels que définis ci-dessus, et de préférence une dite séquence bactérienne universelle telle que définie ci-dessus, ainsi que

- desdits jeux d'amorces et sonde spécifiques desdits fragments d'ADN synthétiques modifiés spécifiques de ladite Archaea M. luminyensis tirés de SEQ. ID. n°l, de préférence choisis parmi SEQ. ID. n°2 à 4, et, de préférence encore, des amorces spécifiques de l'ADN de toute Archaea de séquences SEQ. ID. n°5 et 6, et

- des réactifs de mise en œuvre d'une réaction d'amplification d'ADN de type

PCR.

D'autres caractéristiques de la présente invention apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre de différents exemples de réalisation.

La figure 1 représente un histogramme présentant les délais de culture en jours (en ordonnée) de l'Archaea M. luminyensis selon l'invention (en abscisse) dans un milieu 119 modifié selon l'exemple 2 (gris clair) et le milieu SAB préféré selon l'exemple 3 (gris foncé). La figure 2 représente un histogramme présentant les délais de culture en jours

(en ordonnée) de l'Archaea M. luminyensis selon l'invention (en abscisse) dans un milieu SAB de l'exemple 3 (gris foncé) et dans un milieu SAB-fat de l'exemple 3 (gris clair).

Les séquences d'ADN SEQ. ID. n°l à 17 sont explicitées dans le listage de séquences d'ADN annexé à la présente description.

Exemple 1 : Technique moléculaire pour la détection de la gêne ribosomal 16S partiel de la nouvelle Archaea Methanomassiliicoccus luminyensis.

Les inventeurs ont tout d'abord mis au point une technique moléculaire basée sur la détection du gène ribosomal 16S en utilisant une technique de PCR suivie d'un clonage des produits d'amplification et du séquençage des clones. Pour ce faire, l'ADN procaryote a été extrait selon une procédure décrite dans WO 2010/130914 comme suit : approximativement 1 gramme de selles ont été resuspendues dans 10 ml de tampon et filtrées (Diagnostica-Fumouze-Division d'Orion, Levallois Perret, France). Le filtrat (250 ml) a été transféré dans un tube Eppendorf stérile contenant 0.3 g de billes en verre traitées à l'acide (#106 millimètre ; Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) et agitées pour réaliser une lyse mécanique à l'aide de l'instrument BIO 101 FastPrep (Qbiogene, Strasbourg, France) utilisé niveau 6.5 (à vitesse maximale) pendant 90 secondes. Le surnageant a été incubé durant la nuit à 56°C avec 180 ml de tampon Tl du kit de tissu de NucleoSpinH (Macherey Nagel, Hoerdt, France) et 25 ml de protéinase K (20 mg/ml). Après un deuxième cycle de lyse mécanique comme décrit ci- dessus, le filtrat a été incubé pendant 15 minutes à 100°C. L'ADN total a été alors extrait en utilisant le kit NucleoSpinH selon les recommandations du fabricant. L'ADN extrait a été élué dans 100 μΙ de tampon d'élution (15). Pour ce faire, les inventeurs ont déterminé une paire d'amorces PCR consensus

(SEQ.ID.N0 5 et 6 et tableau 8 "Archaea consensus") permettant d'amplifier par PCR un fragment du gène 16S ADN ribosomal de toute Archaea après avoir aligné les séquences du gène 16S ADN ribosomal de 20 organismes EuryArchaeaota. Le programme d'amplification PCR comportait 95°C pendant 15 min, suivi de 45 cycles de 95°C pendant 30 secondes et 60°C pendant 1 min. Tous les échantillons d'ADN ont été examinés deux fois. Les résultats ont été exprimés en nombre de copies des gènes de 16 S ADNr par gramme de selles. La quantification de plasmide a été effectuée en insérant un fragment chimérique de nucléotide dans le plasmide de l'ACP II (kit de clonage de TA (pCRII) Invitrogen, Carlsbad, CA, Etats-Unis). Le fragment chimérique contenait des cibles de PCR en temps réel pour le gène rpcB de M. smithii et de M. stadtmanae permettant la quantification de ces deux Archaea ainsi qu'un fragment du gène 16S de l'ADNr de Streptomyces sudanensis SD504 (numéro d'accession de GenBank EF515876) comme témoin interne pour garantir l'absence d"inhibition de la PCR. Les produits d'amplification PCR ont été clonés dans des bactéries Escherichia coli JM109 compétentes en utilisant le vecteur pGEM-T Easy Vector System (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) et 100 colonies recombinantes ont été vérifiées pour la présence d'un insert en utilisant les amorces PCR universelles M13d/M13r ("Insert d'amplification", tableau 8 et SEQ. ID. n°16 et 17. Les produits de PCR ont été purifiés et séquencés en utilisant le kit BigDye terminator et le séquenceur 3130 (Applied BioSystem). Des témoins négatifs ont été utilisés pour chaque analyse. Les séquences ont été analysées utilisant le programme Seqscape (Applied BioSystem), et les valeurs de similitude étaient déterminées en utilisant le programme en ligne de BLAST de NCBI. Lors de ce travail, les inventeurs ont identifié dans quatre échantillons sur 20 échantillons analysés (soit dans 89 clones) une séquence partielle du gène 16S ADNr de 461-bp déposée par les inventeurs dans GenBank sous le numéro GenBank FJ823135. Cette séquence n'a que 78.8% de similarité avec la séquence homologue du gène 16S ADNr de M. smithii. Cette similarité a été comparée en alignant la séquence FJ823135 avec la région correspondante de la séquence de l'ADN 16S de M. smithii disponible dans GenBank sous le numéro U55233. L'alignement a été fait en utilisant le programme en ligne MULTALIN du pôle bioinformatique lyonnais (http://npsa- pbil.ibcp.fr/cgi bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_multalinan.html). En utilisant la même technique de comparaison, les inventeurs ont observé que la séquence originale GenBank FJ823135 déterminée par les inventeurs présentait un pourcentage de similarité de 98.7% avec une séquence déposée antérieurement dans GenBank sous l'intitulé "human faeces clone E18_16S2" et sous le numéro (FJ752571); et présentait 98% de similarité de séquence avec une séquence déposée antérieurement dans GenBank sous l'intitulé "human faeces clone E20_16S1" et le numéro d'accession FJ752572, ces deux séquences correspondant à un travail publié (6) par Mihajlovski et al., 2010. Cette séquence a été identifiée comme étant une séquence de l'ADN ribosomale 16S partielle décrite dans la littérature comme représentative d'un nouvel ordre, d'une nouvelle famille, d'un nouveau genre et d'une nouvelle espèce d'Archaea détectée indépendamment par deux équipes de recherche en Irlande (1,14) et en France (5,6) sans pouvoir être isolée et cultivée. Les inventeurs ont en outre réalisé une analyse phylogénétique de la séquence partielle qu'ils ont déterminée en utilisant une analyse en maximum de vraisemblance et en traçant l'arbre phylogénétique par le logiciel PhyML. Cette analyse phylogénétique a indiqué que cette nouvelle séquence était comprise dans un groupe de séquences déposées dans GenBank par différents auteurs qui avaient obtenu ces séquences à partir de selles de différents animaux et d'autres sources environnementales, correspondant à des Archaea non cultivées et non-isolées, mais indiquant qu'il s'agissait d'un nouvel ordre d'Archaea.

A partir de la mise en évidence de cette séquence indicative partielle du gène 16S ADNr d'une nouvelle espèce d'Archaea, les inventeurs ont développé une PCR en temps réel spécifique de ce clone après avoir déterminé des amorces et une sonde spécifiques de M. luminyensis (SEQ.ID.N0 2-4 et Tableau 8), leur permettant de déterminer la prévalence de ce clone dans un grand nombre d'échantillons de selles (500).

La spécificité de ces amorces et sondes a été vérifiée expérimentalement en incorporant de l'ADN extrait à partir d'un représentant bactérien de 43 espèces de microbes habitants communs d'intestin et des microbes pathogènes entériques (tableau 9), y compris M. smithiieX. M. stadtmanae en tant que témoins positifs (SEQ. ID. n°7-9 et SEQ. ID. n°10-12, tableau 8).

Le protocole de PCR en temps réel était le suivant. Des amorces et sondes Taqman utilisées pour la qPCR en temps réel de l'ADN bactérien total avec les amorces consensus et sondes décrites dans Dridi B. et al. [15], des amorces et sonde "bacteria consensus" et reprises au tableau 8 et SEQ. ID. n°13-15. Des analyses par PCR en temps réel ont été exécutées avec un système de MX3000TM (Stratagène, Amsterdam, Pays-Bas) utilisant le kit PCR de sonde de QuantiTect (Qiagen, Courtaboeuf, France) avec 5pmol de chaque amorce et de sonde marquée avec FAM ou VIC, et 5 μΙ d'ADN dans un volume final de 25 pl. Le nombre de copies du gène rDNA 16S a été mesuré dans une analyse duplex, et la détection d'ADN bactérien total "bacteria consensus" a été employée dans la qPCR en temps réel comme témoin d'extraction de l'ADN.

Ainsi, les inventeurs ont pu démontrer la présence de cette séquence du gène ribosomal 16S dans 4 % seulement des prélèvements de selles qu'ils ont analysés par PCR selon le protocole suivant: 15 min à 95°C, suivi par 50 cycles comprenant 95°C pendant 30 s, 56°C pendant 45 s et 72°C pendant 1 min; suivie d'une étape finale d'élongation de 5-min à 72°C.

La séquence complète du gène 16S ADNr de la nouvelle Archaea SEQ.ID.N°1 n'a pu être déterminée qu'après l'isolement et la mise en culture pure de cette nouvelle Archaea selon l'exemple 2 ci-après et détermination de la séquence de son génome comme décrit à l'exemple 4 ci-après.

Exemple 2 : Culture de l'Archaea Methanomassiliicoccus luminyensis.

Les inventeurs ont sélectionné trois échantillons de selles ne présentant pas de Methanosphaera stadtmanae et présentant par technique de PCR en temps réel, un rapport optimum entre Methanobrevibacter smithii (en concentration la plus faible possible) mesuré par le nombre de cycles de PCR en temps réel le plus grand possible et le plus petit nombre de cycles de détection de PCR en temps réel pour la nouvelle Archaea non isolée. Au cours de ce travail, les amorces, les sondes (Eurogentec, Seraing, Belgique) de M. smithii (SEQ. ID. n°7-9) et M. stadtmanae (SEQ. ID. n°10-12) mises en œuvre étaient déjà décrites (15) et sont récapitulés dans le tableau 8.

La spécificité desdites amorces et sondes a été ensuite également vérifiée expérimentalement en incorporant l'ADN extrait à partir d'un représentant bactérien de 43 espèces des habitants communs d'intestin et des microbes pathogènes entériques du tableau 9. Le même protocole que précédemment a été mis en œuvre pour réaliser une PCR en temps réel. Les amorces et les sondes Taqman utilisées pour la qPCR en temps réel de l'ADN bactérien total ont été adaptées de la méthode précédemment décrite par Palmer et collaborateurs. Des analyses par PCR en temps réel ont été exécutées avec un système de MX3000TM (Stratagène, Amsterdam, Pays-Bas) utilisant le kit PCR de sonde de QuantiTect (Qiagen, Courtaboeuf, France) avec 5pmol de chaque amorce et de sonde marquée avec FAM ou VIC, et 5 μΙ d'ADN dans un volume final de 25 pl. Le nombre de copies du gène 16S ADNr a été mesuré dans une analyse duplex, et la détection d'ADN bactérien total a été employée dans la qPCR en temps réel comme témoin d'extraction de l'ADN.

Les inventeurs ont ensuite utilisé ces trois prélèvements de selles pour tenter l'isolement et la culture de la nouvelle espèce d'Archaea méthanogène qu'ils ont appelée Methanomassiliicoccus luminyensis.

Les milieux et conditions de culture d'Archaea décrites dans la littérature , notamment pour les 3 espèces humaines M. smithii , M. stadtmanae et M. oralis entre autres n'ont pas permis de cultiver la nouvelle espèce. Une partie des nombreux différents essais de culture de ladite Archaea sont rapportés ci-après.

Les tentatives d'isolement de Methanomassiliicoccus luminyensis onX. commencé par l'inoculation de 200 pL des prélèvements de selle en question dans un milieu de base comprenant des constituants décrits séparément dans la littérature pour des Archaea précédemment isolées contenant en g/1 : KH2P04 (0,3), K2HP04 (0,3), MgCI2 x 6H20 (0,5), KCI (0,1), NaCI (1) NH4CI (1), CaCI2 x 2H20 (0,1), cystéine-HCI (0,1), extrait de levure (1), solution d'oligo-éléments de Balch (2,5 ml/1), resazurine (0,001 g/1) et de l'eau distillée (qsp); le pH a été ajusté à 7 avec du KOH (10 M) avant autoclavage. Le milieu a été porté à ébullition sous N2 gaz pour éliminer le maximum d'oxygène et refroidit à température ambiante. Le milieu a été distribué dans des tubes Hungate de 5 ml ou dans des flacons en anaérobiose sous N2/CO2 (80:20, v/v) à la pression atmosphérique. Les tubes et/ou flacons sont ensuite autoclavés pendant 45 minutes à 110°C. Après autoclavage, le milieu est supplémenté par du NaHC03 (4 g/1), du Na2S x 9H20 (0,5 g/1), du Na-formate (2 g/1) et de 10 ml/1 d'une solution filtrée à l'aide d'un filtre à 0,22 μιτι pour la stériliser, de vitamines de Balch [10]. Cette première façon de cultiver les Archaea méthanogènes a été infructueuse, puisqu'un faible dégagement de méthane n'a été observé qu'après deux mois de culture sans atteindre de phase exponentielle de croissance.

A partir de ce milieu de base, les inventeurs ont testé un très grand nombre de différentes conditions de culture en tentant l'ajout de différents substrats avant ou après autoclavage. A titre illustratif, les conditions se rapprochant au milieu de l'établissement d'une culture étaient les suivantes :

Condition 1 : Acétate ajouté à la concentration de 20 mM.

Condition 2 : Méthanol ajouté à la concentration de 40 mM.

Condition 3 : Méthanol ajouté à la concentration de 40 mM + H2/C02 (80/20) à une pression de 2 bars car c'est la pression optimale de la majorité des méthanogènes utilisant ce substrat : H2/CO2 (80/20).

Condition 4 : H2/C02 (80/20) à une pression de 2 bars sans méthanol.

Aucune production de méthane n'a été enregistrée dans les conditions 1, 2 et tandis qu'une légère production de méthane a été détectée par chromatographie en phase gazeuse un mois après l'inoculation pour les conditions 3 et 4 sans que la culture évolue de façon remarquable.

Les tubes correspondant à cette production de méthane ont été ensuite repiqués dans des roll tubes contenant le même milieu de base avec les mêmes substrats des conditions 2 et 3 c'est-à-dire en présence de méthanol que les inventeurs suspectaient alors d'être une substance nécessaire à la croissance, solidifiés avec 0.08g d'agar. Ces tubes ont été préparés selon la technique d'Hungate (13). Une faible production de méthane a été observée 3 mois après inoculation dans les tubes sous la condition 2 avec apparition de quelques colonies blanches de forme irrégulière. Plusieurs colonies ont été repiquées en milieu liquide, mais la production de méthane est restée faible et n'était détectable que plusieurs semaines après le repiquage correspondant à un très faible inoculum, trop faible pour permettre par exemple le dépôt de la souche dans des collections de dépôt.

Il a donc été nécessaire de réaliser d'autres modifications dans le milieu de base, d'une part, et dans les substrats de supplémentation après autoclavage ou conditions de culture, d'autre part.

Après un grand nombre essais avec des changements des milieux de culture et des changements de conditions de culture, les inventeurs ont pu déterminer un milieu de culture et des conditions de culture de l'Archaea Methanomassiliicoccus luminyensis, permettant d'obtenir une souche (clone B10T) déposée sous le numéro DSM 24529, vérifiant les conditions d'admissibilité et de viabilité dans la collection de dépôt de microorganismes selon le traité de Budapest Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zell kulturen, Inhoffen 7B D-38124 Branschweig, Deutschland (DSMZ, Allemagne). En particulier cette souche permettait une production de méthane rapide et importante qui démarre 48 heures après inoculation et atteint son maximum entre le 5ème et le lOème jour.

Les inventeurs ont fait varier la pression et le milieu gazeux de culture. Mais surtout il a été nécessaire de compléter le milieu de base par l'addition de Sélénite et tungstate de sodium avant autoclave et addition de Méthanol (40mM) après autoclave. Les inventeurs ont donc commencé par utiliser un milieu de base contenant des constituants de bases communs à toutes les Archaea méthanogènes cultivées précédemment. Les essais ont amené les inventeurs à tester un milieu de base tiré du milieu 119 (http://www.dsmz.de, tableau 1A ci-après) qui est un milieu spécifique au genre Methanobrevibacter, à titre de milieu de base, la production de méthane était plus importante que celle obtenue avec le premier milieu de base mais encore insuffisante. En particulier, les inventeurs ont testé l'ajout d'une solution de Sélénite et tungstate de sodium sur plusieurs milieux de base précédent sous différents milieux atmosphère gazeuse et pression notamment à 1, 2 et 2,5 bars.

Seuls les milieux additionnés de Sélénite et tungstate de sodium sous une atmosphère contenant plus de 50% d'hydrogène à une pression inférieure à 2 bars ont donné une production de méthane détectable en seulement 7 jours après inoculation.

Le milieu 119 complémenté par du méthanol et les sels de tungstate et sélénite du tableau 1B ci-après et conditions de culture ci-dessus permettait d'établir la nouvelle Archaea en culture. Le milieu de culture dérivé du milieu 119 complété contenait en g/1: KH2P04

(0,5), MgS04 x 7H20 (0,4), NaCI (5), NH4CI (1), CaCI2 x 2H20 (0,05), Na-acétate (1,6), cystéine-HCI (0,5), extrait de levure (1), trypticase peptone (1), solution d'oligo- éléments de Widdel du tableau 5 (1 ml/1), 2 ml/1 de solution de Sélénite-Tungstate (NaOH 0,4 g/1, Na2Se03 x 5H20 3 mg/l, Na2W04.2H20 4 mg/l, resazurine 0,001 g/1) et de l'eau distillée (qsp); le pH est ajusté à 7,5 avec du KOH (10 M) avant autoclavage. Le milieu est porté à ébullition sous N2 gaz pour éliminer le maximum d'oxygène et refroidit à température ambiante. Le milieu est distribué dans des tubes Hungate de 5 ml ou dans des flacons en anaérobiose obtenue par le mélange N2/CO2 (80:20, v/v) à la pression atmosphérique. Le rajout d'un mélange N2+C02 dans des cultures de microorganismes permet, de façon connue, d'établir l'anaérobiose et fournir le C02 aux anaérobies qui le métabolisent comme source de carbone. Les tubes et/ou flacons sont ensuite autoclavés pendant 45 minutes à 110°C. Après autoclavage, le milieu est supplémenté par du NaHC03 (4 g/1), du Na2S x 9H20 (0.5 g/1), du Na-formate (2 g/1) et de 10 ml/1 d'une solution de vitamines de Balch du tableau 6 (Balch et al., 1979); enfin, le méthanol est rajouté (40 mM) avec un mélange gazeux composé de H2/C02 (80/20) à une pression de 1 bar seulement constituant l'atmosphère à la surface de la culture Le mélange gazeux composé par du H2/C02 (80/20) à 1 bar de pression est introduit dans la culture en barbotage par une aiguille stérile jusqu'à disparition totale des bulles, le contenu du tube est alors à 1 bar de pression de H2/CO2 (80/20). Une fois inoculé (10% vol), le milieu est incubé à 37°C sous agitation. La production de méthane démarre 48 heures après inoculation et la phase exponentielle de croissance est atteinte entre le 7ème et lOème jour après l'inoculation. Cinq souches de cette Archaea ont été établies en culture dans des conditions autorisant leur dépôt en collection, à savoir la collection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne) sous le numéro DSM 24529 dans les conditions de viabilité et accessibilité conformes au traité de Budapest.

Cette souche peut être cultivée et sous-cultivée par repiquage de manière indéfinie dans le temps, par repiquage de l/5eme d'une culture, chaque sous-culture arrivant en phase exponentielle avec dégagement de méthane d'au moins 10 μΜ et possibilité de visualisation au microscope des Archaea de forme sphériques de 0,5 à 1 microns au bout d'au plus 15 jours, en pratique au bout de 5 jours.

Le dégagement de méthane peut être quantifié par une méthode appropriée par chromatographie en phase gazeuse, notamment telle que décrite dans BARREDO et al. [18].

Ladite Archaea présente une morphologie sphérique de plus petite taille que les autres Archaea M. smithiieX. M. stadtmanae.

Exemple 3 : Développement des milieux améliorés, dits milieux SAB et SAB-fat

3.1/- Les inventeurs ont développé un milieu de culture amélioré polyvalent, appelé ci-après milieu SAB, ayant un effet sur la croissance des Archaea méthanogènes. Pour ce faire, les inventeurs ont découvert que le milieu 119, modifié par du méthanol et une solution de sélénite/tungstate de l'exemple 2 ci-dessus, était avantageusement supplémenté par différents ingrédients, notamment des oligométaux Fe, Ni, Mo et Mg, Mn, Cu et Zn tels que décrits dans le tableau 1C, permettant notamment d'obtenir des croissances plus rapides de toutes les Archaea méthanogènes Methanobrevibacter estées, y compris M. luminyensis.

Ce milieu SAB était préparé de la façon suivante.

Le milieu de culture est bouilli sous flux d'azote, dans un récipient fermé avec un papier d'aluminium jusqu'à ce qu'il devienne transparent (l'indicateur d'oxydoréduction dans ce cas la résazurine, est de couleur rose, elle devient transparente après réduction par ébullition sous flux d'azote). Il est ensuite refroidi à température ambiante et rincé avec du N2 ou un mélange 80% N2/ 20% C02. Toutes les solutions doivent être préparées sous une atmosphère strictement anaérobie, notamment sous un flux N2/C02 (remplaçant l'oxygène) [9,21]. Le pH doit être ajusté avec du KOH 10 M pour obtenir un pH final de 7,5. Le milieu est réparti dans des tubes de Hungate, puis il est autoclavé à 120°C pendant 40 minutes sous une pression de 2 bar, puis refroidi à température ambiante.

Le milieu de culture incomplet comprenait les éléments suivants du tableau 1C ci-après.

Quantités par litre de H20

NiCI2 x 6H20 0,07 mg

Na2Mo04 x 2H20 0,02mg

FeS04 x 7H20 0,2 mg

MgS04 x 7H20 0,01 g

K2HP04 0,5 g

KH2P04 0,5 g

KCI 0,05 g

CaCI2 0,05 g

NaCI 1,5 g

NH4CI i g

Na-Acétate i g

Extrait de levure i g

Trypticase peptone i g

Après autoclavage, le milieu est supplémenté par les éléments suivants :

NaHC03 4 g/1

Na2S.9H20 0,5 g/1

Na-Formate 0,4 g/1

Méthanol 40 mM

Vitamines de Balch(cf. tableau 6) 10 ml/1

La culture est incubée sous une atmosphère utilisant le mélange 80% de H2 + 20% de C02 à 2 bars. La culture a été réalisée dans des tubes de Hungate (Dutscher, Issy-les-Moulineaux, France) incubés à 37°C sous agitation. 3.2/- Le milieu liquide SAB précédemment décrit en 3.1/- (tableau 1C) a été encore complété en développant un milieu de culture original polyvalent, appelé ci- après milieu SAB+fat, ayant un effet sur la croissance des Archaea méthanogènes.

Les inventeurs ont, en effet, découvert que le milieu SAB du tableau 1C était avantageusement supplémenté par un mélange d'acides gras volatiles tels que décrits dans le tableau 1D ci-après, permettant notamment d'obtenir des croissances plus rapides de toutes les Archaea méthanogènes Methanobrevibacter testées. Ce milieu SAB+fat était préparé de la façon suivante.

Le milieu de culture est bouilli sous flux d'azote, dans un récipient fermé avec un papier d'aluminium jusqu'à ce qu'il devienne transparent (l'indicateur d'oxydoréduction dans ce cas la résazurine, est de couleur rose, elle devient transparente après réduction par ébullition sous flux d'azote). Il est ensuite refroidi à température ambiante et rincé avec du N2 ou un mélange 80% N2/ 20% C02. Toutes les solutions doivent être préparées sous une atmosphère strictement anaérobie, notamment sous un flux N^CC^ (remplaçant l'oxygène). Le pH doit être ajusté avec du KOH 10 M pour obtenir un pH final de 7,5. Le milieu est réparti dans des tubes de Hungate, puis il est autoclavé à 120°C pendant 40 minutes sous une pression de 2 bar, puis refroidi à température ambiante.

Le milieu de culture incomplet SAB+fat comprenait les éléments suivants du tableau 1D :

Quantités par litre de H20

NiCI2 x 6H20 0,07 mg

Na2Mo04 x 2H20 0,02mg

FeS04 x 7H20 0,2 mg

MgS04 x 7H20 0,01 g

K2HP04 0,5 g

KH2P04 0,5 g

KCI 0,05 g

CaCI2 0,05 g

NaCI 1,5 g

NH4CI i g

Après autoclavage, le milieu est supplémenté par les éléments suivants :

NaHC03 4 g/1

Na2S.9H20 0,5 g/1

Na-Formate 0,4 g/1

Methanol 40 mM

Vitamines (cf. tableau 6) 10 ml/1

Acide valérique 5,88 mM (0,6 g/1)

Acide isovalérique 5,88 mM (0,6 g/1)

Acide 2- méthylbutyrique 5,88 mM (0,6 g/1)

Acide isobutyrique 6,81 mM (0,6 g/1) Acide 2- méthylvalérique 5,16 mM (0,6 g/1)

3.3/- La culture est incubée sous une atmosphère utilisant le mélange 80% de H2 + 20% de C02 à 2 bars. La culture a été réalisée dans des tubes de Hungate (Dutscher, Issy-les-Moulineaux, France) incubés à 37°C sous agitation.

La croissance des méthanogènes était vérifiée quotidiennement par observation au microscope optique et par la mesure parallèle de la production de méthane utilisant un chromatographe en phase gazeuse GC-8A (Shimadzu, Champs-sur-Marne, France) équipé d'un détecteur de conductivité thermique, d'un injecteur et d'une colonne de la maille SP100 de Chromosorb WAW 80/100 (Alltech, Carquefou, France). Le N2 à une pression du kPa 100 était employé comme gaz vecteur. La température du détecteur et de l'injecteur étaient 200°C et la température de la colonne de 150°C.

Les inventeurs ont testé la croissance de la souche M. luminyensis DSM 24529 dans les milieux de culture des tableaux 1B, 1C et 1D et comme témoin positif et des tubes contenant le même milieu de culture non-inoculé comme témoins négatifs. Ils ont comparé le délai de croissance de la souche M. luminyensis dans les milieux de culture 119 modifié de l'exemple 2 et dans les milieux SAB et SAB+fat ci-dessus. Les expériences ont été faites en triple.

Les témoins négatifs sont tous restés stériles. Les résultats obtenus sont présentés sur les histogrammes des figures 1 et 2, et montrent que la souche M. luminyensis DSMZ 24529 cultive après 5 jours d'incubation dans le milieu SAB contre 7 jours dans le milieu 119 DSMZ modifié, et que la souche M. luminyensis DSMZ 24529 cultive après 3 jours d'incubation dans le milieu SAB-fat contre 5 jours dans le milieu SAB.

Exemple 4 : Séquence du gène 16S de l'ADNr complet de M. luminyensis.

La nouvelle souche d'Archaea M. luminyensis a été inoculée dans un volume de 250 ml du milieu de culture liquide et cultivée jusqu'à obtention d'une culture visible à l'oeil nu sous forme d'un trouble du milieu, l'ADN a été ensuite extrait comme précédemment décrit [15] à partir du culot obtenu par centrifugation de la culture à 13,000 rpm pendant 15 min à température ambiante. Le séquençage de l'ADN génomique de M. luminyensis a été réalisé par pyroséquençage à l'aide d'un appareil 454-Roche GSFLX comme décrit précédemment [17]. Les inventeurs ont pu ensuite extraire des contigs de la séquence complète du génome de M. luminyensis, la séquence complète SEQ. ID. n°l du gène 16S rADN de M. luminyensis, de 1 434 pb, telle que décrite dans le listage de séquences annexé à la description.

Exemple 5 : Extraction semi-automatisée de l'ADN des méthanogènes.

Les inventeurs ont mis au point une technique d'extraction de l'ADN de méthanogène à partir de prélèvements cliniques, en particulier de prélèvements de selles [15]. Cependant, ce protocole repose uniquement sur des étapes manuelles, rendant ce protocole difficilement utilisable en routine de laboratoire. Ici, les inventeurs ont tenté d'automatiser tout ou partie de ce protocole afin de réduire le temps de travail et de mettre en place un protocole compatible avec une utilisation en routine. Dans ce but, les inventeurs comparé des protocoles automatisés, semi-automatisés et manuels pour l'extraction d'ADN d'Archaea. Dans ce travail prospectif, les inventeurs ont inclus 110 échantillons de selles prélevés chez 110 individus, Marseille, France, entre juillet et août 2011. Cette étude a été approuvée par le Comité d'Ethique local de l'IFR48. Trois protocoles différents d'extraction d'ADN ont été réalisés en parallèle. Un protocole manuel utilisant kit NucleoSpin® (Macherey Nagel, Hoerdt, France) a été réalisé comme précédemment décrit [15]. Un protocole automatisé a utilisé la technique d'extraction d'ADN en utilisant l'extracteur EZ1, et le kit d'extraction d'ADN d'EZl® (Qiagen, Courtaboeuf, France) selon le procédé du fabricant. Un protocole semi-automatisé a été réalisé de la façon suivante : approximativement 1 gramme de selles a été suspendu dans 5 ml d'une solution de Tris-HCL 0,05 M, pH 7,5. Des aliquots de 250 μΙ de la suspension ont été transférés dans un tube Eppendorf stérile contenant 0,3 g de billes de verre lavées à l'acide (< 106 millimètres ; Sigma, Saint-Quentin Fallavier, France) et agités pour réaliser une lyse mécanique dans un appareil FastPrep-24 Instrumente, (MP Biomédicale Europe Illkirch, France) à vitesse 6,5 m/s pendant 90 secondes. Cet appareil opère une agitation par rotation multidirectionnelle. Le surnageant a été incubé durant la nuit à 56°C avec 180 ml de tampon de lyse (kit ADN tissue, Qiagen EZ1®) et 25 μΙ de Protéinase K (20 mg/ml). Après un deuxième cycle de lyse mécanique comme décrit ci-dessus, le surnageant a été incubé pendant 10 minutes à 100°C et l'ADN total a été alors extrait en utilisant le kit ADN tissue, Qiagen EZ1® dans l'extracteur EZ1, Qiagen. Des témoins négatifs se composant d'eau stérile sans ADN ont été introduits dans toutes les manipulations et ont subi le même processus d'extraction que les échantillons de selles. L'ADN extrait par les trois protocoles d'extraction, ont été incorporés dans une détection du 16S des méthanogènes par PCR en temps réel. Les amorces et sonde du tableau 8 ont été utilisés selon le protocole précédemment décrit [11]. Les produits de PCR ont été purifiés puis séquencés en utilisant le kit de séquençage BigDye terminator 1.1 et le séquenceur 3130 (Applied Biosystems). Des témoins négatifs ont été incorporés à chaque analyse.

Après la première étape, (digestion de protéinase K et amortisseur durant la nuit de lyse), le protocole semi-automatisé prend 15 à 30 minutes selon l'opérateur, contre 2,5 à 3 heures pour la technique manuelle. Le protocole automatisé est exécuté dans deux étapes, digestion de la protéinase K à 70°C pour 10 minutes et l'étape automatisée pendant 15 mn.

Résultats et discussion :

Les témoins négatifs introduits dans toutes les expériences sont demeurés négatifs et aucun ADN d'Archaea n'a été extrait dans ces témoins négatifs. Le protocole automatisé a rapporté 35/110 (32%) d'échantillons positifs avec une valeur moyenne de Ct (nombre de cycles de PCR temps réel pour obtenir un signal positif) de 36.1. Le protocole semi-automatisé a rapporté 90/110 (87%) d'échantillons positifs avec une valeur moyenne de Ct de 27.4. En comparaison avec le protocole automatisé, ce protocole semi-automatisé a rapporté un nombre significativement plus élevé d'échantillons positifs (P < 0.001) avec des valeurs significativement plus basses de Ct (P < 0.001). Le protocole manuel comme décrit dans la référence [11] a rapporté 100/110 (91%) d'échantillons positifs avec une valeur moyenne de Ct de 30.33. En comparaison avec le protocole automatisé, ce protocole manuel a rapporté un nombre significativement plus élevé d'échantillons positifs (P < 0.001) avec des valeurs significativement plus basses de Ct (P < 0.001). Cependant, en comparaison avec le protocole semi-automatisé, ce protocole manuel a rapporté un nombre non- significativement plus élevé d'échantillons positifs (P = 0.1) avec des valeurs non- significativement plus basses de Ct (P = 0.1).

Ces données ont indiqué aux inventeurs que la combinaison d'une lyse mécanique par agitation mécanique en présence de billes en verre avec une lyse enzymatique et chimique a augmenté de manière significative le rendement d'extraction de l'ADN des méthanogènes, amplifiable par PCR. Selon la présente invention, cependant, il est possible de combiner une partie manuelle du procédé d'extraction avec une partie automatisée de manière à diminuer le temps de travail dans la perspective d'une mise en œuvre en routine. Des résultats similaires ont été obtenus en quantifiant par PCR l'ADN de M. smithii, M. luminyensis et M. stadtmanae avec les amorces des gènes 16S ADNr de M. smithii, M luminyensis 'et M. stadtmanae ' du tableau 8 et du listage de séquences d'ADN annexé.

Dans les tableaux ci-après, les concentrations pondérales des sels sous forme d'hydrates, ne tiennent pas compte du poids des molécules d'eau impliquées dans les hydrates.

Tableau 1A : Milieu 119

Tableau 1B : Milieu 119 complété de l'exemple 2

Quantité par litre de H20

KH2P04 0,5 g

MgS04 x 7H20 0,4 g

NaCI 5 g

NH4CI i g

CaCI2 x 2H20 0,05 g

Na-acétate 1,6 g

Cystéine-HCI 0,5 g

Extrait de levure i g

Trypticase peptone i g

Résazurine 0,001 g

Oligo-éléments de Widdel (cf. 1 ml

tableau 5)

Solution de sélénite/tungstate 2 ml

(tableau 7) Après autoclave :

Quantité par litre de H20

NaHC03 g

Na2S x 9H20 0,5 g

Na-formate 2 g

Vitamines de Balch 10 ml

(tableau 6)

Méthanol 40 mM

Tableau 1C : milieu SAB

Après autoclave :

Quantité par litre de H20

NaHC03 4 g/1

Na2S.9H20 0.5 g/1

Na-Formate 0.4 g/1

Methanol 40 mM

Vitamines de Balch (tableau 6) 10 ml/1

Tableau 1D : Milieu SAB-fat

Après autoclave :

Quantités par litre de H20

NaHC03 4 g/1

Na2S.9H20 0.5 g/1

Na-Formate 0.4 g/1

Methanol 40 mM

Vitamines de Balch (tableau 6) 10 ml/1

Acide valérique 0,6 g/1

Acide isovalérique 0,6 g/1

Acide 2-méthylbutyrique 0,6 g/1

Acide isobutyrique 0,6 g/1

Acide 2-méthylvalérique 0,6 g/1

Tableau 2 : Milieu El

Tableau 3 : Composition du milieu 1 de Balch

Les ingrédients sont rajoutés à de l'eau distillée pour avoir un volume final de 1 litre. La cystéine et le Na2S sont rajoutés après barbotage du milieu avec un mélange gazeux 80o/oN2-20%CO2, la phase gazeuse finale du tube est composée d'un mélange 80%H2- 20%CO2.

(a) : Contient 6g de KH2P04 par litre d'eau distillée.

(b) : Contient en gramme par litre d'eau distillée: KH2P04 (6), (NH4)2S04 (6), NaCI (12), MgS04.7H20 (2,6), CaCI2.2H20 (0,16).

(c) : Contient en gramme par litre d'eau distillée (pH ajusté à 7 avec KOH) : acide nitriloacétique (1,5), MgS04.7H20 (3), MnS04.2H20 (0,5), NaCI (1), FeS04.7H20 (0,1), CoS04 ou CaCI2 (0,1), CaCI2.H20 (0,1), ZnS04 (0,1), CuS04.5H20 (0,01), Na2Mo04.2H20 (0,01) ; dissoudre l'acide nitriloacétique avec du KOH (pH 6,5) puis rajouter les autres minéraux.

(d) : Contient en milligramme par litre d'eau distillée les vitamines suivantes : biotine (2), acide folique (2), hydrochloride de pyridoxine (10), hydrochloride de thiamine (5), riboflavine (5), acide nicotinique (5), pantothénate de DL-calcium (5), vitamine B12 (0,1), Acide p-aminobenzoïque (5), acide lipoique (5).

(e) : FeS04 7H20; (f) : NaHC03; (g) :Na acétate; (h) : Na formate; (i) :extrait de levure DIFCO; (j) : trypticase BBL; (k) : hydrochlorure de L-cystéine; (I) :Na2S, 9H20

Tableau 4: Solution d 'oligo-éléments de Balch

ableau 5 : Solution d'oli o-éléments de Widdel

Tableau 6 : Solution de vitamines de Balch

Quantité par litre de H20

Biotine 2 mg

Acide folique 2 mg

Pyridoxine -HCI 10 mg

Thiamine-HCI x 2H20 5 mg

Riboflavine 5 mg

Acide nicotinique 5 mg

D-Ca-pantothénate 5 mg

Vitamine B12 0,1 mg

Acide p-Aminobenzoïque 5 mg

Acide lipoique 5 mg

Tableau 7 :_Solution de Sélénite/tungstate

Quantité par litre de H20

NaOH 0,5 g

Na2Se03 x 5H20 3 mg

Na2W04 x 2H20 4 mg

Tableau 8

Organisme Cible Séquence {S'-^1) des amorces et sondes (bp)

M. smithii 16S rDNA Smit.16S-740F, 5'-CCGGGTATCTAATCCGGTTC-3' 123

Smit.16S-862R, 5'-CTCCCAGGGTAGAGGTGAAA-3'

Smit. l6S FAM, 5'-CCGTCAGAATCG 1 I CCAGTCAG-3' FAM (MGB)

M. stadtmanae 16S rDNA Stadt_16SF, 5'-AGGAGCGACAGCAGAATGAT-3' 97

Stadt_16SR, 5'-CAGGACG 1 1 CACAGTACGA-3'

Stadt_16SFAM, 5'-TGAGAGGAGGTGCATGGCCG-3' FAM (Taqman)

M. luminyensis 16S rDNA BlO-dir, 5'-G 1 1 CGTAGCCGGTCTGGTAA-3' 79

BlO-rev, 5'-CCAAGTCTGGCAGTCTCCTC-3'

BIO-VIC, 5'-TCGGGAAG 1 I AA I 1 I GAC I I CC-3' VIC (Taqman) bacteria consensus 16S rDNA Bact 8FM, 5'-AGAG 1 1 1 GATCMTGGCTCAG-3' 327

Bact515R, 5'-TTACCGCGGCKGCTGGCAC-3'

Bact338K, 5'-CCAKACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3' VIC (Taqman)

Archaea consensus 16S rDNA TArchaea2-dir, 5'-AGCCGCCGCGGTAAYAC-3' 461

TArchaea-rev2, 5'-CYGGCGTTGAVTCCAATT-3'

Insert amplification 16S rDNA M13d, 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' ~730

M13r, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'

Tableau 9 : Liste des microbes testés

Espèces

Bacteroides fragilis Salmonella enterica arizonae

Streptococcus pyogenes Lactococcus plantarum

Shigella boydii Streptococcus gallolyticus

Enterococcus faecalis Klebsiella oxytoca

Pseudomonas aeruginosa Streptococcus entericus

Staphylococcus aureus Gemella morbillorum

Corynebacterium jeikeium Enterococcus gai 'inarum

Bacteroides thetaiotaomicron Streptococcus oral/s

Enterococcus faecium Streptococcus agalactiae

Acinetobater haemolyticus Kluyvera ascorbata

Klebsiella pneu mon iae Mycobacterium avium

Enterobacter cancerogenus Yersinia enterolitica

Enterobacter cloacae Mycobacterium tuberculosis

Providencia stuartii Halobacterium sp

Proteus mirabilis Methanosarcina acetivorans

Propionibacterium acnés Sulfolobus sol fata n'eus

Bifidobacterium Aeropyrum pernix

Escherichia hermanii Methanobrevibacter oralis

Citrobacter freundii Methanobrevibater smithii

Citrobacter koseri Methanosphaera stadtmanae

Escherichia coli

Campilobacter jejuni

Salmonella enterica enterica Références bibliographiques

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Revendications

1. Archaea Methanomassiliicoccus luminyensis isolée et établie en culture, comprenant la séquence spécifique du gène 16S de l'ADN ribosomal SEQ. ID. n°l du listage de séquences ou une séquence complémentaire. 2. Archaea selon la revendication 1, telle que déposée à la collection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne) sous le numéro DSM 24529.

3. Procédé de culture d'une Archaea selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on réalise ladite culture avec un milieu de culture comprenant un milieu de base de culture d'Archaea méthanogène caractérisé en ce qu'il comporte en outre :

- du méthanol à une concentration molaire de 5 à 100 mM, de préférence de 10 à 50 mM, et

- un sel de tungstate et un sel de sélénite à une concentration molaire de 5.10"3 à 0,5 mM, de préférence 5.10"2 à 0,5 mM chacun. 4. Procédé de culture selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre :

- un sel de molybdate et un sel de nickel à une concentration molaire de 10"3 à 10"2 mM chacun, et

- un sel de formate à une concentration molaire de 1 à 10 mM, de préférence 6 mM.

5. Procédé de culture selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend en outre les composants choisis parmi les composants suivants, aux concentrations suivantes : a- sel de sélénite Na2Se03, à une concentration de 0,001 mg/l à 0,1 mg/l, de préférence 0,015 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Se03.5H20, b- sel de tungstate Na2W04, à une concentration de 0,001 mg/l à 0,1 mg/l, de préférence 0,02 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2W04.2H20, c- sel de molybdate Na2Mo04, à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/l, de préférence 0,02 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Mo04.2H20, d- sel de nickel NiCI2 à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/l, de préférence 0,7 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate NiCI2.6H20, et e- sel de formate NaHC02, à une concentration de 0,1 à 1 g/1, de préférence

0,4 g/1.

6. Procédé de culture selon l'une des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend en outre des acides gras volatiles comprenant une chaîne carbonée courte de moins de 6 atomes de carbone, chacun à une concentration molaire de 1 à 10 mM, de préférence de 5 à 7 mM.

7. Procédé de culture selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdits acides gras volatiles comprennent les acides suivants : acide valérique, acide isovalérique, acide 2-méthylbutyrique, acide isobutyrique et acide 2-méthylvalérique.

8. Procédé de culture selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que ledit milieu de base comprend au moins :

- plusieurs sources de carbone et d'azote, de préférence choisies parmi un extrait de levure, un sel d'acétate et une peptone trypsique, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate,

- une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium,

- au moins un sel de chacun des métaux K, Mg, Na et Ca, de préférence NaCI,

- une substance réductrice, plus particulièrement choisie parmi la cystéine-HCI et Na2S, - une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 8, de préférence NaHC03 pour ajuster le pH à 7,5, - des oligoéléments, de préférence des sels choisis parmi des sels de B, Fe, Cu, Zn, W, Se, Cu, Mn, Co, Ni et Mo, de préférence encore des oligoéléments du milieu de Widdel,

- des vitamines, de préférence les vitamines du milieu de Balch, et - de préférence, un indicateur d'oxydoréduction de contrôle de l'anaérobie, de préférence la résazurine.

9. Procédé de culture selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que ledit milieu comporte les espèces suivantes : KH2P04, K2P04, MgS04.7H20, NaCI, KCI, KOH, NH4CI, CaCI2.2H20, KOH, NaCOOCH3 cystéine, extrait de levure, trypticase peptone, NaOH, NaHC02, CH3OH, Na2S, NaHC03, NaHC02, Na2Se035H20, Na2W042H20, Na2Mo04.2H20, NiCI2.6H20, FeS04.7H20, des oligoéléments de widdel, des vitamines de Balch et de préférence résazurine; le pH étant ajusté à 7,5.

10. Procédé de culture d'une Archaea M. luminyensis selon l'une des revendications 3 à 9, dans lequel on réalise les étapes successives suivantes : 1- on inocule un échantillon biologique susceptible de contenir une dite Archaea dans ledit milieu de culture en anaérobie, et

2- on place ledit milieu de culture sous une atmosphère d'anaérobiose contenant au moins 50% d'hydrogène à une pression inférieure ou égale à 2 atm, et

3- on réalise une incubation à une température de 20 à 40°C, de préférence à 37°C, pour atteindre une phase de croissance exponentielle avec dégagement de méthane en au moins 1 jour, de préférence pas plus de 15 jours, de préférence encore pas plus de 7 jours.

11. Procédé de détermination de la présence d'une Archaea dans un échantillon biologique, de préférence dans un échantillon de selles animales ou humaines selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on extrait l'ADN dudit échantillon biologique et on détecte et de préférence on quantifie spécifiquement l'ADN de ladite Archaea par amplification enzymatique du type PCR de préférence du type PCR en temps réel avec un couple d'amorces et de préférence une sonde, de séquences tirées du gène 16S ADNr de séquence SEQ.ID N°l.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on met en œuvre un dit couple d'amorces et de préférence une dite sonde de séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr

Amorce 5' directe : SEQ.ID. N° 2 = 5'-GTTCGTAGCCGGTCTGGTAA-3'

Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 3 = 5'-CCAAGTCTGGCAGTCTCCTC-3' Sonde : SEQ.ID.N°4 = 5'-TCGGGAAGCTTAACTTTCCGACTTCC-3'

13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que l'on réalise au préalable une amplification enzymatique du type PCR de préférence du type PCR en temps réel , spécifiquement de l'ADN de toutes Archaea contenues dans ledit ADN extrait de l'échantillon avec un couple d'amorces consensus de séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr :

Amorce 5' directe : SEQ.ID. N° 5 =5'-AGCCGCCGCGGTAAYAC-3' Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 6 = 5'-CYGGCGTTGAVTCCAATT-3'.

14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit échantillon de selles, on réalise les étapes dans lesquelles :

1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, à une dilution de 0,01 à 1 g/1, de préférence à une dilution de 0,2 g/1, et

2) on réalise une lyse mécanique automatisée par mélange et agitation de ladite suspension de l'étape 1) avec un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, dans un appareil du type réalisant une agitation forte, de préférence par rotation multidirectionnelle, et

3) de préférence encore, on chauffe la suspension obtenue à au moins 100°C pendant au moins 10 minutes, et 4) on réalise une lyse chimique et/ou enzymatique par mélange et agitation du surnageant de la suspension obtenue à l'étape 2) ou 3) avec un ou des tampons de lyse chimique et/ou enzymatique, puis

5) on répète l'étape 2) de lyse mécanique mais avec le mélange obtenu à l'étape 4), et

6) de préférence, on répète l'étape 4) de lyse chimique et/ou enzymatique avec le mélange obtenu à l'étape 5).

15. Kit utile pour un procédé selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend : - des réactifs d'amplification d'ADN comprenant des amorces d'amplification et sonde de détection de dite Archaea M. luminyensis, comprenant des oligonucléotides constituants des dites amorces et sonde tirées de SEQ.ID.N°1, de préférence choisies parmi SEQ.ID.N°2 à 4, et

- de préférence, des amorces spécifiques de toute Archaea de séquences SEQ. ID. n°5 et 6, et

- de préférence encore, des réactifs d'extraction d'ADN comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et un réactif de lyse chimique et/ou enzymatique.

REVENDICATIONS MODIFIÉES

reçues par le Bureau international le 23 October 2012 (23/10/2012)

Revendications

1. Archaea Methanomassiliicoccus luminyensis isolée et établie en culture, comprenant la séquence spécifique du gène 165 de l'ADN ribosomal SEQ. ID. n°l du listage de séquences ou une séquence complémentaire. 2. Archaea selon la revendication 1, telle que déposée à la collection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne) sous le numéro DSM 24529.

3. Procédé de culture d'une Archaea selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes successives suivantes :

1- on inocule un échantillon biologique contenant une dite Archaea dans un milieu de culture en anaérobie, ledit milieu de culture comprenant un milieu de base de culture d'Archaea méthanogène comportant en outre :

- du méthanol à une concentration molaire de 5 à 100 mM, de préférence de 10 à 50 mM, et

- un sel de tungstate et un sel de sélénite à une concentration molaire de 5.10"3 à 0,5 mM, de préférence 5.10'2 à 0,5 mM chacun, et

2- on place ledit milieu de culture sous une atmosphère d'anaérobiose contenant au moins 50% d'hydrogène à une pression inférieure ou égale à 2 atm, èt

3- on réalise une incubation à une température de 20 à 40°0, de préférence

37°C. 4. Procédé de culture selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre :

- un sel de molybdate et un sel de nickel à une concentration molaire de 103 à 10'2 mM chacun, et

- un sel de formate à une concentration molaire de 1 à 10 mM, de préférence 6 mM.

5. Procédé de culture selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend en outre les composants choisis parmi les composants suivants, aux concentrations suivantes : a- sel de sélénite Na2Se03, à une concentration de 0,001 mg/l à 0,1 mg/l, de préférence 0,015 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2Se03.5H20, b- sel de tungstate Na^WO-t, à une concentration de 0,001 mg/l à 0,1 mg/l, de préférence 0,02 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na2W04.2H20, c- sel de molybdate Na2MoO^, à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/l, de préférence 0,02 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate Na?Mo04.2H20, d- sel de nickel NiCI2 à une concentration de 0,01 à 0,1 mg/l, de préférencé 0,7 mg/l, de préférence encore sous forme d'hydrate NiCl2.6H20, et e- sel de formate NaHC02f à une concentration de 0,1 à 1 g/1, de préférence

0,4 g/1.

6. Procédé de culture selon Tune des revendications 3 à 5, caractérisé en ce que ledit milieu de culture comprend en outre des acides gras volatiles comprenant une chaîne carbonée courte de moins de 6 atomes de carbone, chacun à une concentration molaire de 1 à 10 mM, de préférence de 5 à 7 mM.

7. Procédé de culture selon la revendication 6, caractérisé en ce que lesdits acides gras volatiles comprennent les acides suivants : acide valérique, âcide isovalérique, acide 2- méthyl butyrique, acide isobutyrique et acide 2-méthylvalérique.

8. Procédé de culture selon l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que ledit milieu de base comprend au moins :

- plusieurs sources de carbone et d'azote, de préférence choisies parrrii un extrait de levure, un sel d'acétate et une peptone trypsique, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate,

- une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium, - au moins un sel de chacun des métaux K, Mg, Na et Ca, de préférence NdCI,

- une substance réductrice, plus particulièrement choisie parmi la cystéine-HCI et Na2S,

- une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 8, de préférence IMaHC03 pour ajuster le pH à 7,5,

- des oligoéléments, de préférence des sels choisis parmi des sels de B, Fe/ Cu, Zn, W, Se, Cu, Mn, Ço, Ni et Mo, de préférence encore des oligoéléments du milieu de Widdel,

- des vitamines, de préférence les vitamines du milieu de Balch, et - de préférence, un indicateur d'oxydoréduction de contrôle de l'anaérobiô, de préférence la résazurine.

9. Procédé de culture selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que ledit milieu comporte les espèces suivantes : KH2P04, K2P04, MgS04.7H20, NaCI, KCI, KOH, NH4CI, CaCI2.2H20, OH, NaCOOCH3 cystéine, extrait de levure, trypticase peptone, NaOH, NaHC02, CH3OH, Na2S, NaHC03, NaHCO?, Na2Se035H20/ Na2W042H20, Na2Mo04.2H20, NiCI2.6H20, FeS04.7H20, des oligoéléments de widdel, des vitamines de Balch et de préférence résazurine; le pH étant ajusté à 7,5.

10. Procédé de culture d'une Archaea M. luminyensis selon l'une des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que, à l'étape 3, on atteint une phasè de croissance exponentielle avec dégagement de méthane en au moins 1 jour, de préférence pas plus de 7 jours.

11. Procédé de détermination de la présence d'une Archaea dans un échantillon biologique, de préférence dans un échantillon de selles animales ou humaines selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'on extrait l'ADN dudit échantillon biologique et on détecte et de préférence on quantifie spécifiquement l'ADN de ladite Archaea par amplification enzymatique du type PCR de préférence du type PCR en temps réel avec un couple d'amorces et de préférence une sondé, de séquences tirées du gène 16S ADNr de séquence SEQ.ID N°l.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on mét en œuvre un dit couple d'amorces et de préférence une dite sonde de séquences chdisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr

Amorce 5' directe : SEQ.ID. N° 2 = 5'-GTTCGTAGCCGGTCTGGTAA-3'

Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 3 = 5'-CCAAGTCTGGCAGTCTCCTC-3' Sonde : SEQ.ID.M°4 = 5'-TCGGGAAGGTTAACTTTCCGACTTCC-3'

13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que l'on réalise au préalable une amplification enzymatique du type PC de préférence du type PCR en temps réel , spécifiquement de l'ADN de toutes Archaea contenues dans ledit ADN extrait de l'échantillon avec un couple d'amorces consensus de séquences choisies parmi les séquences suivantes et séquences complémentaires tirées du gène 16S ADNr :

Amorce 5' directe ; SEQ.ID. N° 5 =5'-AGCCGCCGCGGTAAYAC-3' Amorce 3' inverse : SEQ.ID. N° 6 = 5 -CYGGCGTTGAVTCCAATT-3'.

14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que pour réaliser l'extraction de l'ADN procaryote dudit échantillon de selles, on réalise les étapes dans lesquelles :

1) on réalise une suspension homogène dudit échantillon de selles dans une solution tampon, à une dilution de 0,01 à 1 g/1, de préférence à une dilution de 0, g/1, et

2) on réalise une lyse mécanique automatisée par mélange et agitation de ladite suspension de l'étape 1) avec un produit pulvérisant abrasif, de préférence de la poudre de verre de préférence lavée à l'acide, dans un appareil du type réalisant une agitation forte, de préférence par rotation multidirectionnelle, et

3) de préférence encore, on chauffe la suspension obtenue à au moins 100°C pendant au moins 10 minutes, et 4) on réalise une lyse chimique et/ou enzymatique par mélange et agitation du surnageant de la suspension obtenue à l'étape 2) ou 3) avec un ou des tamporis de lyse chimique et/ou enzymatique, puis

5) on répète l'étape 2) de lyse mécanique mais avec le mélange obtenu à l'étape 4), et

6) de préférence, on répète l'étape 4) de lyse chimique et/ou enzymatique avec le mélange obtenu à l'étape 5).

15. Kit utile pour un procédé selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'il comprend : - des réactifs d'amplification d'ADN comprenant des amorces d'amplification et sonde de détection de dite Archaea M. luminyensis, comprenant des oligonucleotides constituants des dites amorces et sonde tirées de SEQ.ID.N°1, de préférence chôisies parmi SEQ.ID.N°2 à 4, et

- de préférence, des amorces spécifiques de toute Archaea de séquences SEQ. ID. n°5 et 6, et

- de préférence encore, des réactifs d'extraction d'ADN comprenant au moins un produit pulvérulent abrasif, de préférence de la poudre de verre et un réactif de lyse chimique et/ou enzymatique.

DECLARATION SELON L'ARTICLE 19

Dans le nouveau jeu de revendications, les revendications 3 et 10 sont modifiées comme suit :

- la nouvelle revendication 3 combine les anciennes revendications 3 et 10, et

- la nouvelle revendication 10 reprend les caractéristiques préférées de l'étape 3 de l'ancienne revendication 10.

Les nouvelles revendications 1 à 2, 4 à 9 et 11 à 15 sont inchangées.

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