Engineered Pertactin Variants For Vaccine Use

VARIANTES INGENIERIZADAS DE PERTACTINA PARA USO VACUNAL.

Campo de Ia técnica

La presente invención se enmarca en el campo de Ia biomediciπa, específicamente en Ia ingenierización de Ia proteína pertactina (Pm) para su uso en vacunas acelulares contra Bordetella pertussis. Las pertactinas ¡ngenierizadas abarcan en su estructura el polimorfismo de diferentes cepas y al ensayarse como vacunas inducen una respuesta de anticuerpos de mayor capacidad protectora y de mayor actividad opsonofagocítica.

Estado de Ia técnica anterior

La Tos Ferina, Coqueluche o Pertussis es una enfermedad respiratoria aguda, altamente infecciosa, causada por Ia bacteria Bordetella pertussis, microorganismo aislado por primera vez en 1906 por Bordet y Gengou [Bordet, J. and O. Gengou. Ann Inst Pasteur (París), 1906. 20: p. 731-41]. Recientemente se estimó que Ia morbilidad anual de infectados en el mundo es de 48.5 millones. En los niños menores de 6 meses Ia enfermedad es particularmente severa, asociándose a este subgrupo poblacional el 90% del total de fallecidos (300-400 mil) [Crowcroft, N. S., et al. Lancet Infect Dis, 2003. 3(7): p. 413-8]. Existen varios tipos de vacunas contra B. pertussis, comprendidas en dos grandes grupos: las vacunas celulares y las más recientes, de tipo acelular. Por efecto de Ia vacunación se ha producido un descenso dramático en Ia incidencia de enfermedad, y también se ha producido un desplazamiento en Ia incidencia de los casos, trasladándose de niños hacia adolescentes y adultos. Numerosos estudios demuestran que los adolescentes son el reservorio fundamental de B. pertussis, y que estos constituyen Ia fuente fundamental de contagio para los niños parcialmente protegidos. Por tanto, Ia Tos Ferina es aún un problema no resuelto, por Io que es necesario el desarrollo de nuevas vacunas para un mejor control de Ia epidemia, los brotes reemergentes y Ia posible erradicación de esta enfermedad en las regiones de endemismo [Cherry, J. D. Pediatrics, 2005. 115(5): p. 1422-7; Singh, M. and K. Lingappan, Chest, 2006. 130(5): p. 1547-53].

El género Bordetella comprende nueve especies, de las cuales cuatro se han asociado a infecciones en mamíferos, a saber B. holmesii, B. bronchiseptica, B. parapertussis y B. pertussis, las dos últimas constituyen los actores fundamentales de las infecciones en humanos [Mattoo, S., et al. Front Biosci, 2001. 6: p. E168-86]. La mayor parte de los factores de virulencia están regulados a nivel transcripcional por un sistema de dos componentes denominado BvgA/S (Bordetella virulence genes Activator/Sensor) [Stibitz, S., et al. Nature, 1989. 338(6212): p. 266-9]. Dentro de los principales se encuentran las toxinas de Pertussis (del inglés pertussis toxin, abreviado PT), Factor de Colonización de Ia Traquea, Adenilato Ciclasa; y las adhesinas Fitohemaglutinina filamentosa (FHA), Fimbria (Fim) y Ia pertactina (Pm), proteína en Ia cual se centra Ia presente invención. La Pm es una proteína de membrana externa, que pertenece a Ia familia de autotransportadores tipo V. Se caracteriza por catalizar su propio transporte a través de Ia membrana externa. [Henderson, I.R.Trends Microbiol, 2000. 8(12): p. 534-5]. La Pm madura es una proteína de 68-kDa, 69-kDa y 70-kDa en B. bronchiseptica [Henderson, I. R. Infecí Immun, 2001. 69(3): p. 1231-43.], B. pertussis[Char\es, LG. , et al. Proc Nati Acad Sci U S A, 1989. 86(10): p. 3554-8.], y B. parapertussis [Li, LJ. , et al. Mol Microbiol, 1991. 5(2): p. 409-17], respectivamente. La estructura consiste en 16 hebras paralelas en hélice β y una sección transversal en forma de V [Emsley, P., et al. Nature, 1996. 381(6577): p. 90-2.]. A partir de este núcleo helicoidal se proyectan numerosos lazos. Uno de estos presenta el tri píete Arg-Gly-Asp (RGD), motivo asociado con Ia adherencia a tejidos [Leininger, E., et al. Infecí Immun, 1992. 60(6): p. 2380-5; Emsley, P., et al. Nature, 1996. 381(6577): p. 90-2.]

La presencia del motivo RGD y numerosas regiones ricas en prolina se relaciona a su función en Ia adhesión. Experimentalmente se ha observado que es capaz de mediar Ia adhesión a células del epitelio respiratorio [Everest, P., et al. Microbiology, 1996. 142 ( Pt 11): p. 3261-8]. No obstante, ensayos de inhibición de Ia adhesión de B. pertussis a Ia línea celular A549 (epitelio alveolar humano) por sueros humanos no evidencian, bajo las condiciones estudiadas, que sea un elemento crucial en Ia misma [Rodríguez, M. E., et al. FEMS Immunol Med Microbiol, 2006. 46(1 ): p. 39- 47.]. La proíeína Pm esíá presente en las vacunas acelulares de tres o más componentes. Las vacunas acelulares pueden estar compuestas por: 1 ) un componente de Toxina de Pertussis (PT), 2) dos componentes: PT y Fitohemaglutinina filamentosa (FHA), 3) tres componentes: PT, FHA y Prn, y 4) cinco componentes, que incluye los tres componentes anteriores y Fimbria 2 (FIM2) y Fimbria 3 (FIM3). En humanos, los niveles de anticuerpos anti-Pm, anti-FIM2 y anti-PT correlacionan con niveles de protección contra Ia enfermedad [Cherry, J. D., et al. Vaccine, 1998. 16(20): p. 1901-6; Storsaeter, J., et al.Vaccine, 2003. 21(25- 26): p. 3542-9.

La inmunización activa con Pm de S. pertussis y B. bronchisepetica genera una respuesta de anticuerpos específicos contra Prn que confiere protección en diferentes modelos animales [ Charles, I. G., et al.Eur J Immunol, 1991. 21(5): p. 1147-53; Roberts, M., et al. Vaccine, 1992. 10(1 ): p. 43-8.]. De igual forma, Ia administración pasiva de anticuerpos monoclonales (AcMs) anti-Prn protege a ratones en el modelo de reto respiratorio [ King, AJ., et al. Microbiology, 2001. 147(Pt 11 ): p. 2885-95.]. La adición de Pm a vacunas conteniendo PT y FHA incrementa los niveles de protección en ratones (modelo intranasal-reto respiratorio) [Guiso, N., et al. Vaccine, 1999. 17(19): p. 2366-76]. Recientemente se observó que Pm es el único componente de las vacunas acelulares que genera un nivel de respuesta de anticuerpos que correlaciona con Ia actividad opsonofagocítica [Hellwig, S. M., et al. J Infect Dis, 2003. 188(5): p. 738-42].

A pesar de Ia existencia de vacunas eficaces, así como de programas de vacunación bien establecidos, Ia Tos Ferina permanece endémica en regiones de América, Europa y Asia, siendo considerada como una enfermedad re-emergente [Raguckas, S. E., et al. Pharmacotherapy, 2007. 27(1 ): p. 41-52]. Una de las hipótesis planteadas, para explicar este fenómeno, es Ia pérdida de eficacia de las vacunas por Ia aparición de cepas resistentes [Mooi, F.R et al. Emerg Infect Dis, 2001. 7(3 Suppl): p. 526-8]. La Prn es una de las proteínas de mayor polimorfismo en B. pertussis. Cuenta con dos regiones variables designadas como región 1 (R1 ) y región 2 (R2), donde se observan secuencias repetidas de aminoácidos ricas en prolina Gly-Gly-X-X-Pro (GGXXP) y Pro-GIn-Pro (PQP), respectivamente. La región R1 se localiza en un lazo protuberante próximo al extremo amino terminal (N-term) y adyacente al motivo RGD, Ia región R2 se ubica hacia el extremo carboxilo terminal (C-term) [Hijnen, M., et al. Infect Immun, 2004. 72(7): p. 3716-23.]. Un total de 12 variantes de Prn (Prn1 , Prn2, Prn3...Pm12) se han identificado, para B. pertussis, hasta la fecha en Ia Base de datos del Nacional Center for Biotechnoloy Information. Las cepas que portan Pm 1 , Prn2 y Prn3 son las de mayor circulación mundial. Numerosos estudios de caracterización de aislamientos, tanto retrospectivos como circulantes, en diversas regiones de América, Europa, Asia y Australia, muestran una tendencia a un desplazamiento gradual de las cepas Pm1 por Prn2, predominando en Ia mayoría de los países las cepas Pm2 [Mooi, F. R., et al. Infect Immun, 1998. 66(2): p. 670-5; Cassiday, P et al. J Infect Dis, 2000. 182(5): p. 1402- 8; Weber, C. et al. J Clin Microbiol, 2001. 39(12): p. 4396-403; Hallander, H. O., et al. J Clin Microbiol, 2005. 43(6): p. 2856-65; van Amersfoorth, S.C., et al. J Clin Microbiol, 2005. 43(6): p. 2837-43; Byrne, S, et al. BMC Infect Dis, 2006. 6: p. 53]. La hipótesis sobre Ia pérdida de Ia eficacia de las vacunas actuales, por Ia aparición de nuevas cepas, tiene a su favor que las secuencias aminoacídicas de Pm en las vacunas celulares (DTPc) y acelulares (DTPa) difieren de las de las cepas circulantes. Estudios de vacunados y no vacunados con DTPc y DTPa, realizados en Holanda e Italia, indican que este tipo de vacuna protege mejor contra cepas circulantes de iguales características [Mooi, F. R., et al. Infect Immun, 1998. 66(2): p. 670-5; Mastrantonio, P., et al. Microbiology, 1999. 145 ( Pt 8): p. 2069-75]. En línea con estos hallazgos, el modelo de ratón muestra que Ia vacunación con DTPc protege diferencialmente a cepas que portan Prn1 y Prn2, indicando que las variaciones en Ia región R1 de Pm pueden conferir grados de resistencia [King, AJ., et al. Microbiology, 2001. 147(Pt 11 ): p. 2885-95]. Sin embargo, estudios de mayor envergadura al estratificar las cepas de B. pertussis atendiendo a: país de origen, estatus de vacunación y tipo de vacuna (DTPc y DTPa), no revelan diferencias significativas en las frecuencias del alelo prn, ptxC, ptxA, tcfA2 para las cepas circulantes y los programas de inmunización [van Amersfoorth, S. C, et al. J Clin Microbiol, 2005. 43(6): p. 2837-43].

Si bien estos hallazgos difícilmente justifican que sea Ia vacunación quien haya originado las nuevas variantes, Ia elevada prevalencia de cepas Prn2 en muchos países es indicativa de que Ia transmisión de las cepas Prn2 está siendo favorecida de algún modo. Por una parte, es llamativo el hecho de que en ese estudio [van Amersfoorth, S. C, et al. J Clin Microbiol, 2005. 43(6): p. 2837-43] las tres cepas clínicas aisladas con alelos similares a los de las vacunas empleadas solo se encontraron en niños no vacunados. De no ser un evento casual, sugiere que las cepas Prn1 son favorecidas en nichos sin inmunidad específica. Por otra parte, Ia identificación reciente de un fago que infecta Bordetella (BPP-1 ), a través de Prn como receptor primario, hace pensar que las variaciones en esta proteína se generan por presiones selectivas diferentes a las del sistema inmune [Liu, M., et al. Science, 2002. 295(5562): p. 2091-4]. No se excluye Ia posibilidad de que ambos fenómenos, junto a otros desconocidos, se armonicen para guiar las variaciones en las poblaciones de B. períussis.

La posible evolución de Ia epidemiología de Pertussis se ha simulado mediante un modelo matemático que integra de manera independiente Ia incidencia de Ia enfermedad y Ia transmisión del patógeno [Aguas, R., et al. Lancet Infect Dis, 2006. 6(2): p. 112-7]. Este modelo predice que dosis regulares de refuerzo no serán capaces de eliminar los grados de severidad de Ia enfermedad observados en Ia epidemia actual. Es muy probable que esto se deba a Ia corta duración de Ia protección conferida (4-12 años) por las vacunas acelulares disponibles, así como a Ia variabilidad de Ia inmunidad generada y Ia diversidad de las vacunas. El modelo prevé que el escenario más optimista sería contar con vacunas que generen una inmunidad superior a Ia natural, paradigma que emplaza las vacunas celulares y acelulares actuales. La presente invención tiene como objetivo principal contribuir al desarrollo de vacunas acelulares más eficaces contra Ia Tos Ferina. Los trabajos principales que preceden Ia presente invención, con vistas a encontrar vacunas más efectivas, se basan en Ia obtención de preparaciones inmunogénicas aplicando mezclas de Pm (Nicole Guiso et al., WO 01/90143 A2 y US 2006/0008474 A1 ) o de péptidos sintéticos de Ia región R1 de Prn (Frederik Mooi et al., WO 02/00695 A2). Por Io tanto, un importante problema de Ia prevención de Ia Tos Ferina es lograr el desarrollo de vacunas acelulares más eficaces.

Explicación de Ia invención

Esta invención contribuye a resolver el problema antes mencionado, y se enmarca en Ia ingenierización del gen prnA, codificante para Ia proteína de membrana externa de β. pertussis denominada Pertactina (Pm). La invención cubre las necesidades evidenciadas en el estado del arte, posibilitando Ia obtención de diferentes variantes de pertactinas ingenierizadas, de modo tal que en una única molécula se comprendan dos dominios polimórficos diferentes de Ia región R1 de Pm. La versatilidad de Ia invención prevé Ia ingenierización de nuevas Pm, comprendiendo adicionalmente tres o más dominios polimórficos diferentes de Ia región R1.

Es objeto dθ Ia presente invención una secuencia polinucleotídica que codifica para una proteína pertactina ingenierizada, que comprende hasta los primeros 300 aminoácidos próximos ai extremo N-terminal de un tipo dado de pertactina natura! madura (PmX300) y una secuencia aminoacídica que comprende hasta los últimos 620 aminoácidos próximos ai extremo C-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura (PmY620), Io que resulta en una pertactina ingenierizada PrnX300- PrnY620.

En el contexto de Ia presente invención, el término "pertactina ingenierizada" se refiere a una proteína que resulta de acoplar, adyacentemente o no, un fragmento comprendiendo hasta los primeros 300 aminoácidos próximos al extremo N-terminal de una molécula de pertactina natural madura a otro fragmento conteniendo hasta los últimos 620 aminoácidos próximos al extremo C- Terminal de una molécula de pertactina natural madura.

Las nuevas variantes de pertactinas ingenierizadas se obtienen mediante mutagénesis molecular, al acoplar adyacentemente secuencias que comprenden hasta los 300 aminoácidos próximos al extremo N-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura, a secuencias que comprenden hasta los últimos 620 aminoácidos cercanos al extremo C-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura. La nueva Pm ¡ngenierizada comprende secuencias de diferentes tipos de Pm en una única molécula, sin afectarse Ia respuesta inmune protectora. En una realización preferida de Ia presente invención se obtienen diferentes variantes de Pm ingenierizadas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos identificadas como SEQ ID No 1- SEQ ID No 6. Al inmunizarse ratones con las diferentes variantes se alcanzan niveles de protección y de actividad opsonofagocitica significativamente superiores a los que se alcanzan con Pm naturales, formuladas independientes o en mezclas. La respuesta inmune generada con las Pm ingenierizadas fue igualmente efectiva contra cepas que expresan diferentes tipos de Pm.

En una realización de Ia invención, el fragmento de los primeros 300 aminoácidos próximos al extremo N-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura (PrnX300) corresponden a pertactinas del género Bordetella. En una realización preferida, este fragmento corresponde a pertactinas de B. pertussis o B. parapertussis, preferentemente a las variantes Pm1 , Pm2 y Prn3 de B. pertussis. En una realización de Ia invención, los últimos 620 aminoácidos próximos al extremo C-terminal de un tipo dado de pertactina natura! madura (PmY620) corresponden a pertactinas del género Bordetella. En una realización particular de Ia invención, el fragmento PmY620 corresponde a pertactinas de fí. pertussis y S. parapertussis, preferentemente a las variantes Prn1 , Pm2 y Prn3 de β. pertussis. La secuencia polinucleotídica de Ia presente invención, codifica para una cadena polipeptídica que comprende cualquier combinación posible de tipos dados de pertactinas en el formato PrnX300-PrnY62Q.

En Ia secuencia polinucleotídica de Ia presente invención las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PrnY620 se acoplan adyacentemente, o mediante el uso de las secuencias IDNATWVMTDN o IDNATWVMTDNIDNATWVMTDN. En Ia presente invención, las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PmY620 pueden estar desprovistas de secuencias repetidas, preferiblemente las secuencias GGXXP y PQP de las regiones R1 y R2. Las evidencias que soportan este rasgo son las siguientes: La región 1 , que comprende las secuencias repetida GGXXP es débilmente reconocida por sueros humanos y de conejos, indicando que no es una región inmunodominante [Hijnen, M., F. R. Mooi, et al. (2004). Infect Immun 72(7): 3716-23]. Por otro lado, trabajos recientes refieren mutantes de Prn donde las secuencias repetidas GGXXP y PQP o regiones comprendiendo estas secuencias aparecen delecionadas. Las deleciones GGXXP no afectan las propiedades fisicoquímicas de los mutantes obtenidos, evidenciándose en Ia utilización de condiciones idénticas en los métodos de expresión y purificación para las Pm mutantes y para las Pm no mutadas [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005). Protein Expr Purif 41(1 ): 106-12]. De igual forma, las deleciones GGXXP no afectan significativamente las propiedades estructurales, ya que Prn mutadas en Ia región 1 son reconocidas por anticuerpos monoclonales (AcM) conformacionales generados contra pertactinas naturales, y no por los AcM secuenciales anti-GGXXP. Adicionalmente, se ha observado que determinadas mutaciones en las región 1 pueden aumentar Ia capacidad de unión de determinados AcM conformacionales. Finalmente existen evidencias que indican que Ia región 1 (GGXXP) y Ia región 2 (PQP) forman un epitopo único [Hijnen, M., R. de Voer, et al. (2007). Vaccine 25(31 ): 5902-14]. Es también objeto de Ia presente invención una secuencia polinucleotídica que codifique para una pertactina ingenierizada, donde las secuencias aminoacídicas PmX300 y PmY620 comprendan péptidos que funcionan como epitopos T cooperadores, preferiblemente epitopos de Difteria, Tétano, HBV, Poliovirus, Vaccina, HIV e Influenza. Es conocido por las personas versadas en este campo de Ia técnica que Ia inserción de este tipo de epitopos conduce a un aumento de Ia respuesta inmune generada por las moléculas que los poseen. Son objeto de Ia presente invención, además, secuencias polinucleotídicas de acuerdo a las reivindicación 1 , donde Ia secuencia polinucleotídica se optimice en su uso de codones, para su expresión en bacterias, levaduras, células de insecto o de mamíferos. Esta forma de aumentar Ia expresión de las moléculas que se obtienen por vía recombinante es ampliamente conocida por aquella personas que se desarrollan en este campo de Ia técnica. Atendiendo a que Ia nueva proteína, objeto de Ia presente invención, será uno de los múltiples componentes de una vacuna combinada, se enfatiza que ninguna de las invenciones precedentes contempla Ia obtención del menor número posible de entidades moleculares que satisfagan las necesidades en este campo de Ia técnica. Finalmente, en el estado del arte hay necesidad de contar con preparaciones vacunales que contemplen protección cruzada entre B. pertussis y B. parapertussis. Atendiendo a Ia alta homología entre las pertactinas de las diferentes especies de Bordetella, Ia presente invención incluye Ia generación de pertactinas ingenierizadas que contemplen en una única molécula diferentes regiones polimórficas provenientes de especies diferentes del género Bordetella. Inesperadamente, Ia pertactina ingenierizada objeto de Ia presente invención, no solo fue capaz de generar una respuesta efectiva contra diferentes cepas de B. pertussis, que expresan Prn1 y Prn2, sino que indujo una respuesta de anticuerpos de mayor efectividad respecto a las proteínas naturales, evidenciado en el modelo de reto respiratorio y en el ensayo de opsonofagocitosis. Sorprendentemente, Ia respuesta inducida por Ia pertactina ingenierizada fue, además, superior a Ia de una mezcla equimolar compuesta por Pm 1 y Prn2 (Pm1 +Prn2).

Las composiciones vacunales a base de mezclas de diferentes pertactinas de una especie o de diferentes especies, aunque cubren el polimorfismo, acarrean dificultades tecnológicas asociadas a los procesos productivos, como el incremento ¡ndeseado en Ia concentración de contaminantes e inconsistencia en Ia producción de los lotes, entre otros. Este es un aspecto de vital importancia para el desarrollo de vacunas combinadas, donde intervienen múltiples antígenos de diferentes características, que puede comprometer Ia inmunogenicidad sistémica de Ia formulación. Por otro lado, es de esperar que con las estrategias basadas en péptidos sintéticos de Ia región R1 se obtengan vacunas menos efectivas que las actuales, al excluirse de Ia respuesta protectora otros epitopos de relevancia presentes en Ia Pm natural.

Para solucionar ese problema de este campo de Ia técnica, Ia presente invención provee de una composición farmacéutica que comprende una o más pertactinas ingenierizadas, codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, que en cantidades suficientes generan una respuesta inmune humoral y celular efectiva contra especies del género Bordetella, mediante un procedimiento de inmunización en mamíferos, preferiblemente en humanos. En una realización de Ia invención, Ia composición farmacéutica comprende una o más pertactinas ingenierizadas genera una respuesta inmune humoral y celular efectiva contra B. pertussis.

Es también objeto de Ia presente invención una vacuna viva o atenuada que comprende una o más pertactinas ingenierizadas, codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, donde Ia pertactina ingenierizada se exprese preferiblemente en Ia membrana extema. En dicha vacuna viva o atenuada las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13 pueden estar comprendidas en un vector plasmídico o en el cromosoma bacteriano. En otra realización de Ia invención, las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, que codifican para pertactinas ¡ngenierizadas, están comprendidas en un vector de expresión en mamíferos. Dicho vector de expresión, que contiene las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, es Ia base de una vacuna de ácidos nucleicos, también objeto de Ia presente invención. En una materialización de Ia invención, las secuencias polipeptídicas codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, pueden ser empleadas en un procedimiento para Ia detección de infección por Bordetella. Es también objeto de esta invención un estuche diagnóstico para Ia detección de presencia o ausencia de anticuerpos contra Bordetella, que comprenda secuencias polipeptídicas codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Experimento de protección en ratones Balb/c vacunados con diferentes variantes de pertactinas recombinantes e ingenierizadas. Las cepas de B. pertussis Tohama I (Pm1 ) y el aislamiento clínico CH53 (Pm2) se usaron para el reto. Las barras representan el promedio del logaritmo de reducción de células viables en el pulmón, respecto al grupo control inmunizado con PBS.

Figura 2. Opsonofagocitosis mediada por sueros de ratones Balb/c vacunados con las diferentes variantes de pertactinas recombinantes e ingenierizadas. El gráfico muestra Ia diferencia de fluorescencia (Ficoeritrina, del inglés phycoerithrin, abreviado PE) en unidades arbitrarias (UA) de las células marcadas con isotiocianato de fluoresceína (del inglés fluorescein isothiocyanate, abreviado FITC), de dos condiciones de incubación (PE4°C - PE37°C).

Figura 3. Respuesta inmune humoral (IgG) contra Prn1 y Pm2CCPrn1 generada en ratones inmunizados con plasmidios que expresan Prn1 , Pm2, Pm2CCPm1 y

Pm2CLPrn1.

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización Ejemplo 1. Construcción de vectores para Ia expresión intracelular en Escheríchia cotí de las variantes de pertactinas ingenierizadas. Purificación.

Los genes prnA1 y prnA2 de las cepas de β. pertussis Tohoma I (Pm1 ) y CH53 (Pm2) se amplificaron mediante Reacción en Cadena de Ia Polimerasa (RCP) a partir de ADN genómico utilizando los oligonucleótidos 1 y 2, previamente reportados [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005). Protein Expr Purif 41 (1 ): 106-12].

Los fragmentos obtenidos, se clonaron en el vector pET-28a (Novagen) usando los sitios Nde I y BamH I. Para Ia obtención de Pm ingenierizadas se utilizó el método de RCP inversa, descrito previamente por Imai y colaboradores en 1991 [Imai, Y., et al. Nucleic Acids Res, 1991. 19(10): p. 2785]. En Ia Tabla 1 se muestran los oligonucleótidos utilizados para Ia amplificación de las diferentes secuencias. El par de oligonucleótidos 1 , 2 se utilizó para linearizar los vectores pET28apm1 y pET28aprn2, correspondiente a las pertactinas 1 y 2, respectivamente. Los fragmentos DomR1 se obtuvieron al amplificar con los oligonucleótidos 3 y 4. Adicionalmente, esta región se amplificó usando los juegos de oligonucleótidos 3,5 y 3,6, para añadir secuencias que codifican para los conectores corto y largo, respectivamente. La Tabla 2 resume las condiciones usadas en Ia amplificación por RCP de los diferentes fragmentos usados en Ia invención.

Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para Ia amplificación de las diferentes secuencias.

Tabla 2. Condiciones para Ia amplificación por RCP de los diferentes fragmentos usados en la invención. Los vectores pET28aprn1 y pET28apm2 lineales, obtenidos por RCP inversa, se ligaron a los diferentes fragmentos codificantes para los dominios que contienen Ia región 1 de las Pm 1 y Prn 2. En estos vectores los nuevos genes ¡ngenieπ'zados quedan bajo el control transcripcional del protomor inducible T7. Los clones con Ia secuencia correcta se introdujeron en Ia cepa BL21-Codonplus(DE3)-RP de E. coli, para su expresión como cuerpos de inclusión [Hijnen, M., et al. Protein Expr Purif, 2005. 41(1): p. 106-12].

Los niveles de expresión de las pertactinas recombinantes 1 y 2, así como de las diferentes variantes se obtuvieron entre 15-20% para todos los casos, evidenciado por densitometría en geles de poliacrilamida teñidos con azul de Comassie.

Para Ia purificación de las proteínas, Ia crema bacteriana correspondiente a cada variante se resuspendió en tampón de ruptura (a una concentración de células de 100 mg/ml) y las células se rompieron por ultrasonido. El precipitado celular se solubilízó en urea 8M y se fraccionó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilo sulfato de sodio (del inglés Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamidθ GeI Electrophoresis, abreviado SDS-PAGE) (12.5 %). El gel se tiñó mediante tinción inversa Imidazol-Zinc, y Ia banda correspondiente a Ia proteína de interés se pasó a través de una membrana de acero de 100μM, en presencia de tampón de extracción. Posteriormente, Ia proteína extraída se renaturalizó y se concentró por Ultrafiltración, usando una celda de concentración Amicon, con membrana de 50 kDa, y Ia concentración se determinó por el método del Acido bicinconinico. No se detectaron contaminantes, al ensayar 15 μg de las proteínas purificadas en geles analíticos de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie, evidenciando que las preparaciones contenían una pureza superior al 95% o más. Las características de las diferentes construcciones y Pm ingenierizadas obtenidas se resumen en Ia Tabla 3.

Tabla 3. Características de las diferentes construcciones y Pm ingenierizadas.

CC: Conector Corto; CL: Conectar Largo Ejemplo 2. Inmunización activa, respuesta de anticuerpos y protección en el modelo de ratón.

Los ratones se inmunizaron con 0.2 μg, 0.02 μg, o en ausencia (PBS), de las proteínas recombinantes Prn1 , Pm2, una mezcla equimolar de Prn1 y Pm2 (Prn1 +Pm2), y de las 6 variantes de las Pm ingenierizadas (mostradas en Ia Tabla 3) formuladas en hidróxido de aluminio. Las dosis se corresponden a 1/40 y 1/400 de Ia dosis empleada en humanos (Infanrix®, 8 μg). La ruta de inmunización empleada fue Ia subcutánea, empleando un volumen de 100 μl. Los sueros de los ratones inmunizados se evaluaron mediante un ensayo inmunoenzimático tipo ELISA. Los títulos de anticuerpos alcanzaron valores medios entre 1.2x103 y 4.6x104. En todos los casos las medias de los títulos correspondientes a Ia dosis mayor difirieron significativamente de los títulos alcanzados con Ia menor dosis usada (p<0.05, Kruskal Wallis-Dunns). No se observaron diferencias para Ia respuesta de anticuerpos generada con las pertactinas 1 y 2, y Ia mezcla equimolar Pm1+Prn2. De igual forma, no se observaron diferencias entre Ia media de los títulos para las distintas variantes ingenierizadas. Sorprendentemente, los títulos de las variantes ingenierizadas fueron significativamente superiores respecto a las pertactinas recombinantes no ingenierizada (p<0.01 , Kruskal Wallis-Dunns). Para el reto intranasal se utilizaron Ia cepa Tohama I (Pm1 ) y el aislamiento clínico CH53 (Pm2). Las bacterias se cultivaron en placas de medio Bordet-Gengou Agar (Sigma) suplementadas con 1 % de glicerol y 14% de sangre de carnero desfibrinada. Las placas se incubaron por 24h (a 37°C) y las colonias se resuspendieron en medio Stainer-Shoulte a una densidad de 108 células/ml. Esta suspensión se utilizó para el reto intranasal. Los ratones inmunizados se retaron 15 días después de Ia última inmunización, mediante Ia instilación de 50 μl (5 x 106 células) de Ia suspensión bacteriana. Cinco días después del reto, los ratones se sacrificaron y los pulmones se extrajeron asépticamente, y se homogenizaron para medir Ia carga bacteriana [Denoel, P., et al. Vaccine, 2005. 23(46-47): p. 5333-41]. Las diferentes variantes mostraron niveles de protección significativamente superiores a los controles no vacunados (p<0.001 ). Inesperadamente, las variantes ingenierizadas mostraron niveles de protección superiores respecto a las pertactinas recombinantes y a Ia mezcla equimolar Prn1 +Prn2 para ambas cepas (pθ.001 ). En Ia menor dosis estudiada pudo observarse que las variantes ingenierizadas protegieron igualmente contra ambas cepas, no así para las pertactinas 1 y 2. Los resultados evidencian que estas variantes poseen propiedades inmunológicas diferentes, y superiores, a las pertactinas recombinante 1 y 2 ensayadas por separado o en forma de mezclas equimolares (Figura 1 ). Ejemplo 3. Actividad opsonofagocítica de los sueros.

La actividad opsonofagocítica mediada por anticuerpos anti-Prn ha mostrado ser un parámetro crucial en Ia respuesta de vacunados con vacunas acelulares [Hellwig, S. M., et al. J Infecí Dis, 2003. 188(5): p. 738-42]. En Ia presente invención se muestra como diferentes variantes de pertactina ingenierizadas fueron capaces de inducir anticuerpos con estas características. La actividad opsonofagocítica se estudió mediante el referido procedimiento adaptado al modelo de ratón. Las cepas Tohama I y CH53 de B. pertussis se crecieron en medio Bordet-Gengou-Agar y se marcaron (2 x 106 unidades formadoras de colonias) con FITC. Posteriormente, las bacterias marcadas se opzonizaron con sueros de ratones inmunizados con las proteínas recombinantes Prn1 , Prn2, Prn1 +Pm2 y con dos variantes de las Prn ingenierizadas (Prn2-CC-Prn1 y Pm2-CL-Pm1 , durante 30 min a 37 0C, en agitador de placas. En el paso de adhesión, las bacterias opsonizadas y el control no opsonizado se incubaron con las células polimorfonucleares (PMN). Las muestras se dividieron y se incubaron por otros 45 min, a 4 0C o 37 0C. Finalmente, las muestras se incubaron otros 30 min a 4 0C con el conjugado de cabra anti-ratón-PE. Las muestras se analizaron por citometría de flujo (PARTEC PAS III). La intensidad de verde y rojo de las células mantenidas a 4 0C se utilizó como control de Adhesión. La diferencia de fluorescencia roja en las células fluorescentes verdes se utilizó para evidenciar Ia actividad fagocítica mediada por los diferentes sueros. En Ia Figura 2 se muestra como las variantes ingenierizadas ensayadas mostraron actividad opsonofagocitica. Sorprendentemente, solo hubo diferencias significativas entre los grupos inmunizados con las Prn ingenierizadas y el grupo de ratones inoculados con PBS (p<0.05, Kruskal Wallis-Dunns). La actividad opsonofagocitica de los sueros generados con las pertactinas recombinantes por separado, y sus mezclas, alcanzaron valores 6 veces mayores que el control PBS, aunque estas diferencias no fueron significativas. Finalmente, los resultados evidencian que las variantes ingenierizadas son capaces de inducir anticuerpos con actividad opsonofagocitica significativa, independientemente del tipo de pertactina que porte Ia bacteria. Ejemplo 4. Construcción de vectores para Ia expresión en mamíferos de variantes de pertactinas ingenierizadas y evaluación de Ia respuesta humoral.

Los genes prnA1, prnA2 y las variantes de genes Prn2CCPrn1 y Prn2CLPrn1 se amplificaron mediante RCP a partir de sus respectivos vectores de expresión (Ver Tabla 3), y usando los oligonucleótidos 1 y 2, previamente reportados [Hijnen, M., P. G. van Gageldonk, et al. (2005). Protein Expr Purif 41 (1 ): 106-12], con una modificación en el oligonucleótido 1 , donde se sustituye el sitio Nde I del oligonucleótido 1 por el sitio BamH I. Los fragmentos obtenidos se clonaron en el vector pAEC-SPE3 usando el sitio BamH I [Herrera AM, Rodríguez EG, et al. (2000) BBRC, 279, 548-551]. Este vector está diseñado para Ia expresión extracelular de antígenos en células de mamíferos. Los vectores fueron purificados usando el estuche comercial (Qiagen®) de purificación de plasmidios. Los grupos de ratones Balb/c hembras (6-7 semanas) se inmunizaron tres veces con 100 μg de ADN, vía intramuscular, a una concentración de 1 μg/μL, en PBS, a intervalos de tres semanas. El grupo control se inmunizó de igual forma, usando el plasmidio sin inserto (pAEC-SPE3). Quince días posteriores a Ia última inoculación los ratones se sacrificaron, y Ia sangre fue colectada para Ia evaluación de los sueros. La IgG específica presente en los sueros se evaluó, mediante Ia técnica de ELISA, usando una dilución 1/1000 y recubriendo con cantidades equimolares de las proteínas Pm1 (2 μg/mL) y Prn2CCPrn1 (2.4 μg/mL). Como se observa en Ia Figura 3, los animales inmunizados con los diferentes plasmidios expresando Pm1 , Pm2, Pm2CCPm1 y Prn2CLPm1 generaron una respuesta inmune específica (IgG), y significativamente superior (p<0.001 ), respecto a los animales inmunizados con pAEC-SPE3 (vector sin inserto). Al igual que los sueros generados en ratones inmunizados con proteína e hidróxido de aluminio (datos no mostrados), los sueros generados en los ratones inmunizados reconocieron en mayor medida (p<0.05) Ia variante ingenierizada Pm2CCPm1 que Ia proteína natural Pm1 , Io cual pudiera deberse a una mejor exposición de los epitopos compartidos en Prn2CCPm1 respecto Pm1.

REIVINDICACIONES

VARIANTES INGENIERIZADAS DE PERTACTINA PARA USO VACUNAL.

1. Secuencia polinucleotídica que codifica para una proteína pertactina ingenierizada que comprende hasta los primeros 300 aminoácidos próximos al extremo N-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura (PmX300) y una secuencia aminoacídica que comprende hasta los últimos 620 aminoácidos próximos al extremo C-terminal de un tipo dado de pertactina natural madura (PmY620), Io que resulta en una pertactina

¡ngenierizada PrnX300-PmY620.

2. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 1 , en Ia cual PrnX300 corresponde a pertactinas del género Bordetella.

3. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 2, en Ia cual PmX3Q0 corresponde a pertactinas de β. pertussis o B. parapertussis.

4. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 3, en Ia cual PmX300 corresponde a las variantes Pm 1 , Pm2 y Prn3 de B. pertussis.

5. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 1 , en Ia cual PmY620 corresponde a pertactinas del género Bordetella. 6. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 5, en Ia cual

PmY620 corresponde a pertactinas de B. pertussis y B. parapertussis.

7. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 6, en Ia cual PrnY620 corresponde a las variantes Prn1 , Prn2 y Pm3 de β. pertussis.

8. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 1 , que codifica para una cadena polipeptídica que comprende cualquier combinación posible de tipos dados de pertactinas en el formato PmX300-PrnY620.

9. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a Ia reivindicación 1 , donde las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PrnY620 se acoplan adyacentemente, o mediante el uso de Ia secuencia IDNATWVMTDN o I DNATWVMTDN I DNATWVMTDN.

10. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a las reivindicaciones 1-9, donde las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PrnY620 están desprovistas de secuencias repetidas, preferiblemente las secuencias GGXXP y PQP de las regiones R1 y R2.

11. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a las reivindicaciones 1-10, donde las secuencias aminoacídicas PrnX300 y PmY620 comprenden además péptidos que funcionan como epitopos T cooperadores, preferiblemente epitopos de Difteria, Tétano, HBV, Poliovirus, Vaccinia, VIH o Virus Influenza. 12. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a las reivindicación 1 , que comprende las secuencias nucleotídicas identificadas como SEQ ID No. 1- SEQ ID No. 6.

13. Secuencia polinucleotídica de acuerdo a las reivindicación 1 , donde Ia secuencia polinucleotídica se optimiza en su uso de codones para su expresión en bacteria, levadura, células de insecto o de mamíferos. 14. Una composición farmacéutica que comprende una o más pertactinas ingenierizadas, codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, que en cantidades suficientes generan una respuesta inmune humoral y celular efectiva contra especies del género Bordetella, mediante un procedimiento de inmunización en mamíferos, preferiblemente en humanos.

15. Una composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicación 14, que genera una respuesta inmune humoral y celular efectiva contra B. pertussis.

16. Una vacuna viva o atenuada que comprende una o más pertactinas ingenierizadas, codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, donde Ia pertactina ingenierizada se exprese preferiblemente en Ia membrana externa.

17. Una vacuna viva o atenuada de acuerdo a Ia reivindicación 16 donde las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13 estén comprendidas en un vector plasmídico o en el cromosoma bacteriano. 18. Un vector de expresión en mamíferos que comprende una o más secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13, que codifican para pertactinas ingenierizadas. 19. Una vacuna de ácidos nucleicos que comprenda un vector de expresión como el de Ia reivindicación 18. 20. Un método para Ia detección de infección por Bordetella, que comprende el uso de secuencias polipeptídicas codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13. 21. Un estuche diagnóstico para Ia detección de presencia o ausencia de anticuerpos contra Bordetella que comprenda secuencias polipeptídicas codificadas por las secuencias polinucleotídicas de las reivindicaciones 1 a Ia 13.

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