Lytic Enzyme Inhibitor, Lysis Inhibitor, Inhibitor Of Degradation Of Poly-?-glutamic Acid, And Method For Production Of Poly-?-glutamic Acid

  • Published: Apr 24, 2008
  • Earliest Priority: Oct 16 2006
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(12) f 許 協 力 条 約 に基 づ いて 公 開 さ れ た 国 際 出願 t

(19) 世 界 知 的 所 有 権 機 関 国際 事 務 局
(43) 国 際 公 開 日 年 4 月 24 日 (24.04.2008)

2008

PCT

(10) I 際 公 開 番 号 l

W O 2008/047936 A l
1 5 番 号 国立 大学 法 人 信 州 大 学 繊 維 学 部 内 Nagano (JP). 原 田宏 (HARADA, Hiroyuki) [JP/JP]; 〒3868567 長 野 県 上 田 市 常 田 三 丁 目 1 5 番 1 号 国立 大 学 法 人 信 州 大 学 繊 維 学 部 内 Nagano (JP).
(74)
); 理 人 : 平 木 祐 輔 , 外 (HIRAKI, Yusuke et 杣・ 〒 1050001 東 京 都 港 区 虎 ノ 門4 丁 目3 番 20 号 神 谷 町 MT ピ ル 19 階 Tokyo (JP).

(51) 国 際 特 許 分 類 C12N タ 99 (2006.01) C12N 1/04 (2006.01) C12N 1/06 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) (21) 国 際 出願 番 号 (22) 国 際 出願 日 (25) 国 際 出願 の 言 語 (26) 国 際 公 開 の 言 語 (30) 優 先 権 子一 タ 特 願 2006-281768

C12N 15/09 (2006.01) C72 21/00 (2006.01) 07 / 2 (2006.01)

PCT/ P2007/070513
2007 年 10 月 16 日 (16.10.2007)

日木 日木

2006 年 10 月 16 日 (16.10.2006)

JP

(71) 出願 人 (米 国 を除 < 全 て の指 定 国 につ いて) 花 王株 式 会 (KAO CORPORATION) [JP JP]; 〒 1038210 東 京 都 中央 区 日 橋 茅 場 町 1 丁 目 1 4 番 1 0 号 Tokyo (JP). 本 国 立 大 学 法 人 信 州 大 学 (SHINSHU UNIVERSITY) [JP/JP]; 〒3908621 長 野 県 松 木 市 旭 三 丁 目 1 番 1 号 Nagano (JP). (72) 発 明者 ; お よ び (75) 発 明 者 / 出願 人 ( 米 国 に つ い て の み) : 荒 勝 俊 (ARA, Katsutoshi) [JP/JP]; 〒3213497 栃 木 県 芳 賀 郡 市 貝 町 赤 羽 2 6 0 6 花 王 株 式 会 社 研 究 所 内 Tochigi (JP). 関 口 I — (SEKIGUCHI, Junichi) [JP/JP]; 〒3868567 長 野 県 上 田 市 常 田 三 丁 目 1 5 番 1 号 国立 大 学 法 人 信 州 大 学 繊 維 学 部 内 Nagano (JP). 山木 博 規 (YAMAMOTO, Hiroki) [JP/JP]; 〒3868567 長 野 県 上 田 市 常 田 三 丁 目

(81) 指 定 国 表 示 の な い限 り 、全 て の種 類 の 国 内保 護 が 可 能 ) : AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BH, BR, BW, BY, BZ, CA, CH, CN, CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DO, DZ, EC, EE, EG, E -. , FI, GB, GD, GE, GH, GM, GT, HN, HR, HU, ID, IL, IN, IS, KE, KG, KM, KN, KP, KR, KZ, LA, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LY, MA, MD, ME, MG, MK, MN, MW, MX, MY, MZ, NA, NG, NI, NO, NZ, OM, PG, PH, PL, PT, R の, R , RU, C , D , E , G , K , SL, SM, SV, SY, TJ, TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VC, VN, ZA, ZM, ZW (84) 指 定 国 俵 示 の な い限 り 、全 ての種 類 の広 域 保 護 が 可 能 ) : ARIPO (BW, GH, GM, KE, LS, MW, MZ, NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), -X ー ラ シ T (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), ヨ ー ロ ツ パ (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, E . , FI, FR, GB, GR, HU, IE, IS, IT, LT, LU, LV, MC, MT, NL, PL, PT, R の, SE, SI, SK, TR), OAPI (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG).
添 付 公 開書 類

電 子 形 式 に よ り別 個 に公 開 さ れた 明細 書 の配 列 表 部 分 、請 求 に基 づ き国 際 事 務 局 か ら入 手 可 能

(54) Title: LYTIC ENZYME INHIBITOR, LYSIS INHIBITOR, INHIBITOR OF DEGRADATION OF POLY- γ -GLUTAMIC ACID, AND METHOD FOR PRODUCTION OF POLY- γ -GLUTAMIC ACID
(54) 発 明 の 名 称 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 、溶 菌 抑 制 剤 及 び ポ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ グ ル タ ミ ン酸 の 製 造 方 法
ミ

ン酸 の分 解 抑 制剤 及 び ポ リ ー ガ ン マ ー

(57) Abstract: The object i s to modulate the cell wall lysis acticity of a lytic enzyme and inhibit the lysis of a microbial cell. Disclosed i s a lytic enzyme inhibitor or a lysis inhibitor comprising a YoeB protein encoded b y a YoeB gene derived from Bacillus subtilis or a homologous gene corresponding to the YoeB gene a s the main ingredient. An example of the YoeB protein i s a protein comprising an amino acid sequence depicted in SEQ ID NO:2.

I t

Yo B YoeB

f

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L

YoeB I

j

J

Yo B
J

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2

7 >5

溶 菌 酵 素 阻 害剤 、 溶 菌 抑 制 剤 及 び 本

リ ー ガン
ミ

マ ー グル タ

ミ

ン 酸 の分 解 抑 制 剤 及 び

ポ リ ー ガ ンマ ー グル タ

ン酸 の製 造 方 法

技術分野

本 発 明 は 、 枯 草 菌 に 由 来 す る 特 定 の 溶 菌 酵 素 の 溶 菌 活 性 を抑 制 す る こ と が で き
る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 、 微 生 物 の溶 菌 を抑 制 で き る 溶 菌 抑 制 剤 、 溶 菌 が 抑 M

れ た微
ミ

生物 、 ポ

リ ー ガ ンマ ー

グル タ

ミ

ン酸 の 分 解 抑 制 剤 及 び ボ

リ ー ガン マー

グル タ

ン

酸 の製 造 方 法 に 関す る 。

背景技 術

枯 草 菌 の溶 菌 酵 素 は 、 細 胞 分 裂 や胞 子 形 成 期 の 母 細 胞 の溶 解 、 胞 子 の発 芽 等 の
生 活 環 の 申で 重 要 な 役 割 を果 た して い る 。 枯 草 菌 に おいて ほ 、 細 胞 分 裂 過 程 や胞

子形 成 過 程 な ど に応 じて 特 異 的 に発 現 す る 溶 菌 酵 素 が 異 な って い る 。 こ れ 引 菌 溶
酵 素 の 多 く は 、 細 胞 壁 に対 す る 結 合 ドメ イ ン と 、 細 胞 壁 を溶 解 す る た め の 活 性 ド
メ イ ン と を有

して い る 。 枯 草 菌 の 対 数 増 殖 期 に発 現 す る 溶 菌 酵 素 と して

B (非

特許文献

及 び 2 を参 照 ) 及 び

(非 特 許 文 献

3 及 び 4 を参 照 )

が 知 られ て い

る 。 ま た 、枯 草 菌 の細 胞 分 裂 の最 終 段 階 に発 現 す る 溶 菌 酵 素 と して

E 非 特許

文献

5 及 び 6 を参 照 )

及び

F

( 特許 文献 非

7及 び 8)

が 知 られ て い る 。

しか しな が ら 、 こ れ ら 枯 草 菌 にお げ る 溶 菌 酵 素 の 細 胞 壁 に対 す る 作 用 機 序 は完
全 に理 解 さ れ て い る わ け で は な く 、 溶 菌 酵 素 の活 性 を抑 制 す る 方 法 は確 立 さ れ て

いな い。 仮 に 、 溶 菌 酵 素 の 活 性 を抑 制 す る こ と が 可 能 と な れ ば 、 微 生 物 の溶 菌 自
体 を抑 制 で き る こ と に な る 。

一方 、 ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸
ル ボ シ キル基 と は 位 のア
ある。 P
ミ

(以 下 、P )

は 、 グ ル タ ミ ン酸 の V 位 の 力

ノ 基 が ぺプチ

ド 合 に よ って 結 合 した高 分 子 化 合 物 で 結

は 、 納 豆菌

(B c a

us

S

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a o)

が 産 生 する 粘 性 物 質 と し

て 知 ら れ て お り 、 種 々 の性 質 か ら 近 年 新 た な 高 分 子 素 材 ど して 注 目 さ れ て い る 。
特 に 、 素 材 と して の種 々 の 用 途 を考 慮 す る と 、 比 較 的 に高 分子 量 の P
が 望まれ

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7 52

発 明の 開示

そ こ で 、 本 発 明 は 、 上 述 した よ

ぅ な 課 題 に鑑 み て 、 溶 菌 酵 素 の 細 胞 壁 溶 解 活 性

を調 節 す る こ と が で き る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 及 び微 生 物 の溶 菌 を抑 制 す る こ と が で き
る 溶 菌 抑 制 剤 を提 供 す る こ と を 目 的 と し、 比 較 的 に高 分 子 量 の P
P

を製 造 で き る

の製 造 方 法 及 び P

の 分 解 抑 制 方 法 を提 供 す る こ と を 目的 と して い る 。

上述 した 目的 を達 成 す る た め 、 本 発 明者 ら が 鋭 意 検 討 した結 果 、機 能 未 知 の 特
定 の遺 伝 子 産 物 が 溶 菌 酵 素 に お け る 細 胞 壁 溶 解 活 性 を抑 制 して い る こ と 、 及 び 当

該 遺 伝 子産 物 が P

の 分 解 ( 低 分 子 化 ) す る 酵 素 の酵 素 活 性 を抑 制 す る こ と を 見

いだ し、 本 発 明 を完 成 す る に至 った。
本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 、 溶 菌 抑 制 剤 及 び P

の分 解 抑 制 剤 は 、 枯 草 菌 由
り コー

来 の oeB 遺 伝 子 又 は 当 該 o e 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同 遺 伝 子 に よ
oeB タ ンパ ク 質 を 主 成 分 と して い る 。

ドさ れ る

こ こ で 、 oeB タ ン パ ク 質 と して は 、 以 下 の ( a ) 乃 至
タ ンパ ク 質 と 定 義 す る こ と が で き る 。

c

いず れ か に記 載 の

( a ) 配 列番 号 2 に示 すア ミ
( b ) 配 列 番 号 2 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質

ノ 酸 配 列 に おいて
ミ

ェ

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の 溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質
( c ) 配 列番 号 2

示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の相 同性 を有 す る ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の 溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活

性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質
ま た 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 は 、特 に 、
タ ンパ ク 質 、 タ ンパ ク

質、

タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 又 は

タ ン パ ク 質 に よ る 溶 菌 作 用 を抑

制 する こ と が で き る 。
こ こで 、

E タ ン パ ク 質 と して は 、 以 下 の ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の

タ ンパ ク 質 と 定 義 す る こ と が で き る 。

( a ) 配 列 番 号 4 に示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 に おい て
ェ

( b ) 配 列 番 号 4 に示 すア ミ

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア
性 を有 す る タ ンパ ク 質
(
C

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活

) 配 列番 号 4 に示 す ア

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の相 同性 を有 す る ア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、枯 草 菌 の細 胞 壁

溶 お 解 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

ま た、

F タ ンパ ク 質 と して ほ 、 以 下 の ( a ) 乃 至 ( C ) いず れ か に記 載 の タ

ンパ ク 質 と 定 義 す る こ と が で き る 。

(a

配 列番 号 6 に示 す ア ミ
ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配列 に
ミ

( b ) 配 列番 号 6 に示 す ア

ぉいて ェ 又 は数 個 の ア ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア
性 を有 す る タ ン パ ク 質
(
C

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活

) 配 列番 号 6 に示 す ア

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を有 す る ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

さ ら に 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 抑 制 剤 は 、 特 に枯 草 菌 の溶 菌 を抑 制 す る こ と が で き

る 。 枯 草 菌 と して は 、 野 生 型 の枯 草 菌 に 限 定 さ れ ず 、 例 え ぼ少 な く と も

ェ

種以上

の 分 泌 型 プ ロ テ ア 一ゼ を欠 損 した 変 異 株 を挙 げ る こ と が で き る 。
ま た、
タ ン パ ク 質 と して は 、 以 下 の ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ

ンパ ク 質 定 義 す る こ と が で き る 。

( a ) 配 列番 号 5 5 に示 すア (b
配 列番 号 5 5 に示 す ア

ミ ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸配列に

ぉいて ェ 又 は数 個 の ア ミ ノ 酸 が 置換 、
溶 む 解 する

欠 失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア

ミ ノ 酸 配 列 か ら な り 、枯 草 菌 の細 胞 壁

活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

(
ミ

C

) 配 列番 号 5 5

示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 。 上 の相 同性 を 有 す る ア 以

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 む 解 す る 活 性 を 有 す る タ ンパ ク 質 溶

ま た、

0 タ ンパ ク 質 と して は 、 以 下 の ( a ) 乃 至 (

C

いずれ か に記 載 の タ

ンパ ク 質 と 定 義 す る こ と が で き る 。

( a ) 配 列番 号 5 7 に示 す ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配列 に
ミ

(b)

列番 号 5 7

示 すア

ミ

ぉいて ェ 又 は数 個 の ア ミ ノ 酸 が 置 換 、

欠 失 、 付 加 或 いほ挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

( c ) 配 列番 号 5 7 に示 すア
ミ

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を有 す る ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の細 胞 壁

溶 む 解 す る 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

ま た 、 d H タ ン パ ク 質 と して は 、 以 下 の ( a ) 乃 至 ( c ) いずれ か に記 載 の タ

ンパ ク 質 と 定 義 す る こ と が で き る 。

( a ) 配 列番 号 5 9 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 におい て
ミ

( b ) 配 列番 号 5 9 に示 すア ミ
欠 失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の細 胞 壁

溶 む 解 する

活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

(c )
ミ

列番 号 5 9 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を有 す る ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

な お 、 発 明 に係 る P 本
W

の分 解 抑 制 剤 は 、 記 溶 菌 酵 素 の ぅ ち C 上
タ ンパ ク 質 又 は

E タ ンパ ク 質 、
リ ー ガン マー

F タ ンパ ク 質 、
ミ

0 タ ンパ ク 質 に よ る ポ

グ

ルタ

ン酸 の 分 解 を抑 制 す る こ と が で き る 。な お、上 記 溶 菌 酵 素 の ぅ ち ddH タ ン
E タ ンパ ク 質 、
w

パ ク質虹 、

F タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 及 び

タ ンパ

ク 質 と は異 な り P

の 分 解 活 性 を示 さ な い。
oeB 遺 伝 子 又 は 当 該
oeB

さ ら に ま た 、 本 発 明 に係 る 微 生 物 は 、 枯 草 菌 由 来 の

遺 伝 子 に対 応 す る 相 同遺 伝 子 を発 現 誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に発 現 す る こ と

で 溶 菌 が 抑 制 さ れ た も の で あ る 。 特 に本 発 明 に係 る 微 生 物 は 、 少 な く と も

ェ

種以

上 の 分 泌 型 プ ロ テ ア 一ゼ を欠 損 して い る こ と が 好 ま しい。
ま た 、 本 発 明 に係 る 微 生 物 は 、 P

産 生 能 を有 す る こ と が 好 ま しい。 本 発 明 に

係 る 微 生 物 に おいて は 、 oeb タ ンパ ク 質 に よ って 上 記 溶 菌 酵 素 の P

分解 活 性 を
と

抑 制 する こ と が で き る 。 こ こで 、 P
え ぼ枯 草 菌 由 来 の

分 解 活 性 を抑 制 す る 溶 菌 酵 素

して ほ 、 例
タ

E タ ンパ ク 質 、

F タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 、 w

ン パ ク 質 及 び 前 記 タ ン パ ク 質 と 機 能 的 に 等 価 な タ ン パ ク 質 を挙 げ る こ と が で き る 。

一方 、 本 発 明 に係 る

P

の製 造 方 法 は 、 P

産 生 能 を有 す る 微 生 物 を 、 枯 草 菌

由 来 の oeB 遺 伝 子 又 は 当 該
る

oeB 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同 遺 伝 子 に よ り コ ー ドさ れ

oeB タ ンパ ク 質 の 存 在 下 に培 養 し、 地 に産 生 き れ た P 培

を 回収 す る も の で あ
o eB 遺

る 。 本 発 明 に係 る P

の製 造 方 法 は 、 枯 草 菌 由 来 の

。 B 。 遺 伝 子又 は 当 該

伝 子 に対 応 す る 相 同遺 伝 子 を発 現 誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に発 現 す る 微 生 物

を使 用 す る も の で あ って も 良 い し、 地 に 培

oe

タ ンパ ク 質 を添 加 す る も の で あ っ

て も よ い。 発 明 に係 る 本

P

の製 造 方 法 に おいて ほ 、 o e b タ ンパ ク 質 に よ って P

本 明 細 書 は本 願 の優 先 権 の 墓 礎 で あ る 日本 国特 許 出願
及 び 又 は 図 面 に記 載 さ れ る 内容 を包 含 す る 。

2

0 06

28 768 号 の 明 細 書

図面 の 簡 単 な 説 明

図

杖、 ( )
)

は
及び
S S

oe

3FL
3

株 か ら抽 出 した抗 株 か ら抽 出 した 抗

FL FL

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ン パ

ク 質 ( レー ン

FL

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ン パ
E

ク 質 ( レー ン 2 ) を

P

(B) E で解 析 した結 果 を示 す写 真 で あ り 、 は (

o e B3F L
S

株 か ら抽 出 した抗

FL

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ンパ ク 質

レー ン

) (

を

P
)

E

で 解 析 した結 果 及 び 基 質 と して 細 胞 壁 成 分 を加 え た ザ イ モ グ ラ フ
結 果 を示 す写 真 で あ る 。

レー ン 2

の

図 2 は 、(
(

)

は
及び
)

E E

E 3FL

株 か ら 抽 出 した抗
3FL

F LA

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ン パ ク 質
FL

レー ン
(

)

5x Ly s
S

株 か ら抽 出 した抗

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ン
E

パ ク質

レー ン 2

をS
FL

P

E で 解 析 した結 果 を示 す写 真 で あ り 、(B) は
(

F3FL

株 か ら 抽 出 した 抗
E

抗 体 で 精 製 した 表 層 タ ン パ ク 質
FL

レー ン
(

)

及び
)

xLysM3FL
DS

株 か ら 抽 出 した抗

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ンパ ク 質

レー ン 2

を

P

E で解 析 した結 果 を示 す写 真 で あ る 。
E TD

図 3 ほ 、 細 胞 壁 成 分 を 基 質 と した と き の 、 H
H
s
2

を加 え た サ ン プ ル 、
E T 及び H
s

E

T

及び H

s

o eB を

で加 え た サ ン プ ル 、 H

s

C

oeB

を

で加 え た サ ン プ ル に お け る 反 応 時 間 と 濁 度 の 減 少 率 と の 関係 を示 す特 性 図

である。

図 4 肚 、細 胞 壁 成 分 を 墓 質 と した と き の 、h
ル 、h
タ ンパ ク 質 及 び
H

S

タ ンパ ク 質 を加 え た サ ン プ

s

oeB を

:2

で加 え た サ ン プ ル に お け る 反 応 時

間 と 濁 度 の 減 少 率 と の 関係 を示 す特 性 図 で あ る 。

図 5 は 、 細 胞 壁 成 分 を基 質 と した と き の 、 6 H
ン プ ル 、6 H
s

s
2

0 タ ン パ ク 質 を加 え た サ

タ ンパ ク 質 及 び H s

o eB を

で加 え た サ ン プ ル にお け る

反 応 時 間 と 濁 度 の減 少 率 と の 関係 を示 す特 性 図 で あ る 。

図 6 ほ 、 細 胞 壁 成 分 を墓 質 と した と き の 、 6 H
ン プ ル 、6 H
s

s

d dH タ ンパ ク 質 を加 え た サ
2

d dH タ ンパ ク 質 及 び

o eB を

で加 え た サ ン プ ル にお け る

反 応 時 間 と 濁 度 の減 少 率 と の 関係 を示 す特 性 図 で あ る 。

図 7 は、 o

eB

タ ン パ ク 質 を大 量 発 現 さ せ た 際 の 分 泌 型 プ ロ テ ア 一 ゼ 欠 損 株

p

8

にお け る 溶 菌 抑 制 作 用 を示 す特 性 図 で あ る 。

図 8 は、

E

タ ンパ ク 質 に よ る

P

分 解 活 性 を、
S

oeB

タ ンパ ク 質 の 存 在 下 又 は
ミ

非 存 在 下 で 比 較 検 討 した 結 果 を示 す
る。

ポ リ ア ク リルア

ド 気 泳 動 写真 で あ 電

図 9 ほ、

F

タ ンパ ク 質 に よ る

P

分解 活 性 を、

oeB

タ ンパ ク 質 の 存 在 下 又 は
ミ

非 存 在 下 で 比 較 検 討 した結 果 を示 す
る。

ポ リ ア ク リル ア

ド 気 泳 動 写真 で あ 電

図

n

は、

タ ンパ ク 質 に よ る

P

分解 活 性 を、
S

oeB

タ ンパ ク 質 の 存 在 下 又
ミ

は 非 存 在 下 で 比 較 検 討 した結 果 を示 す
ある。

ボ リ ア ク リル ア

ド 気 泳 動 写真 で 電

図ェ

ェ

は、

0

タ ンパ ク 質 に よ る

P

分 解 活 性 を、
S S

oeB

タ ンパ ク 質 の 存 在 下 又
ミ

は 非 存 在 下 で 比 較 検 討 した結 果 を 示 す
ある。

ボ リ ア ク リルア

ド 気 泳 動 写真 で 電

図1

2

ほ、

タ ンパ ク 質 に よ る

P

分解 活 性 を、
ボ

oeB

タ ンパ ク 質 の 存 在 下 又

は 非 存 在 下 で 比 較 検 討 した結 果 を 示 す
ある。

リ ア ク リルア ミ

ド 気 泳 動写真 で 電

発 明 を実 施 す る た め の 最 良 の 形 態
以 下 、 図 面 を参 照 して 本 発 明 を詳 細 に説 明 す る 。

本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 、 菌 抑 制 剤 及 び P ㎝ の 分 解 抑 制 剤 は 、 草 菌 溶 枯

o

。
B

遺 伝 子又 は 当 該

o

B

遺 伝 子 に対 応 す る 相 同 遺 伝 子 に よ

り コー

ドさ れ る

oeB

タン

パ ク 質 を 主 成 分 と して い る 。

枯 草菌

oeB

遺 伝 子 の塩 基 配 列 の 一例 を配 列番 号
oeB

ェ

に示 し、 列 番 号 配

工

に示 す塩
2

墓 配 列 に よ って コ ー ドさ れ る

タ ンパ ク 質 の ア

ミ

ノ 酸 配 列 を配 列 番 号
eB

に示

す。 な お 、 枯 草 菌

o

。遺 伝 子 に よ り コ ー
B

ドさ れ る

。

タ ン パ ク 質 と して は 、 配

列 番 号 2 に示 すア
示 すア ミ

ミ

ノ 酸 配列か らな る ボ リペ プ チ

ドに 限 定 さ れず 、 配 列番 号 2 に

ノ 酸 配 列 におい て ェ 又 は複 数 の ア ミ ノ 酸 が 置 換 、 欠 失 、 付 加 又 は挿 入 さ ノ 酸 配列か らな る ポ リペ プチ

れた ア ミ

ド あ って 、 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 で
で あっ
ェ

制 す る 活 性 を有 す る ポ リ ペ プ チ ド ( 以 下 、 変 異 型 ボ リ ペ プ チ ドと 称 す る

て も よ い。 こ こ で 、 置 換 、 欠 失 、 付 加 又 は挿 入 す る ア
個 、 ま しく は ェ 好
ェ

ミ

ノ 酸 は、 例 え ぼ

~

~
ミ

0個 、よ

り好 ま

しく は ェ

~5 個 と す る こ と が で き る 。ま た、
して は 、 え ば 、 例
番 目 の 領 域 を 除 く 領 域 を挙 げ る

又 は複 数 の ア

ミ

ノ 酸 が 置 換 、 失 、 加 又 は挿 入 さ れ る 領 域 と 欠 付
ノ 酸 配 列 に お いて 9

配 列 番 号 2 に示 すア
こ と が でき る。 この

~8

24

~8

番 目 の領 域 は 、 溶 菌 酵 素 に結 合 す る 領 域 と 考 え られ
ェ 又 は複 数 の ア ミ ノ 酸

る た め 、 当 該 領 域 を 除 く 領 域 で あれ ば

が 置換 、 欠 失 、 付 加

又 は挿 入 さ れ た と して も 、 溶 菌 酵 素 の 溶 菌 活 性 に対 す る 抑 制 活 性 を保 持 で き る も
の と 考 え られ る 。
ま た、 枯 草 菌

。 遺 伝 子 に よ り コ ー ドさ れ る eB
ミ

。 タ ンパ ク 質 と して は 、 配 列 B

番 号 2 に示 すア

ノ 酸 配列 か らな る ボ リペ プ チ

ドに限 定 き れず 、 配 列番 号 2 に示

すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の相 同性 、 好 ま し く は 8 0 以 上 の 相 同性 、
以 上 の 相 同 性 を有 す

よ り好 ま しく は 9

0 以 上 の 相 同性 、 最 も 好 ま し く は 9 5

る ボ リペ プチ

ド ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の溶 菌 酵 素 に結 合 し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る か

溶 菌 活 性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る ボ リ ペ プ チ ド ( 以 下 、 同 様 に 、 変 異 型 ボ リ ペ プ
チ ドと 称 す る ) で あ って も よ い。 こ こ で 、 相 同性 の値 は 、 複 数 の ア
ミ

ノ 酸配列間

の 相 同性 を演 算 す る ソ フ ト ウ ェア ( 例 え ぼ 、
ト の 設 定 で 算 出 した値 を意 味 す る 。

N

S

や BL

T) を用 いて デ フ ォル

ま た 、枯 草 菌
ク レオ チ

oeB

遺 伝 子 と して は 、配 列番 号
ェ

ェ

に示 す塩 基 配 列 か ら な る ポ

リヌ

ドに 限 定 さ れず 、 配 列番 号

に示 す塩 基 配 列 か ら な る ボ リ ヌ ク レオ チ ド
ハ イ ブ リ ダイ ズする ボ
リヌ ク

の 相 補 鎖 に対 して ス ト リ ン ジ ェン

トな 条 件 で

レオ チ

ドで あ って 、 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る ボ リ ペ プ チ ドを コ
ー ド るポ す
リヌク

レオ チ ド ( 以 下 、 変 異 型 ボ

リヌク

レオ チ ドと 称 す る ) も 含 ま れ
ミ

る 。 変 異 型 ポ リ ヌ ク レオ チ

ドは 、 配 列 番 号 2 に示 すア

ノ 酸 配 列 と は異 な る ア

ミ

ノ 酸 配列か らな る ポ リ ペ プ チ

ド あ って 、 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 制 す る 活 で

性 を有 す る ボ リ ペ プ チ ド ( 以 下 、 変 異 型 ボ リ ペ プ チ ドと 称 す る ) を コ ー ド る こ す

と と な る。

こ こ で ス ト リ ン ジ ェン ト な 条 件 と は 、 いわ ゆ る 特 異 的 な ハ イ ブ リ ッ ド 形 成 さ が

れ 、 非 特 異 的 な ハ イ ブ リ ッ ド 形 成 さ れ な い条 件 を い う 。 ス が
件 下 と して は 、例 え ば 、相 同性 が 高 い

ト リ ン ジ ェン ト な 条

同 士 (例 え ぼ 5 0 以 上 の 相 同性 を有 同 士が ハ イ ブ
ト リ ン ジ ン トな 条 件 ェ

する
リ ダイ ズ

同

ア) が ハ イ ブ
S

リ

ダ イ ズ し、 れ よ り 相 同性 が 低 そ

しな い条 件 を 挙 げ る こ と が で き る 。 具 体 的 に 、 ス

と

して は 、 通 常 の サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 洗 いの 条 件 で あ る 6 0oC 、

X S S C,O ・

S 、 好 ま しく は、 0 ・

X S S C、 O ・

S

S に相

当 す る 塩 濃 度 で ハ イ ブ リ ダ イ ズ す る 条 件 が 挙 げ られ る 。 変 異 型 ボ リ ヌ ク レオ チ ド

は 、 草 菌 に 由 来 す る 野 生 型 の oeB 遺 伝 子 に対 して所 定 の 突 然 変 異 を導 入 す る こ 枯
と に よ って 取 得 す る こ と が で き る 。 突 然 変 異 を導 入 す る 手 法 は 、 特 に 限 定 さ れ な

いが 、 い わ ゆ る 部 位 特 異 的突 然 変 異 導 入 方 法 を適 用 す る こ と が で き る 。
ま た 、 上 述 した各 種 の 変 異 型 ボ リ ペ プ チ ド 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 制 す が
る 活 性 を有 す る か否 か は 、 以 下 の よ ぅ に して判 別 す る こ と が で き る 。 す な わ ち、

変 異型 ボ

リペプチ

ドを コ ー ド る 遺 伝 子 を 、 生 型 oeB 遺 伝 子 と 置 換 した変 異 株 す 野
リペ プチ

又 は野 生 型

oeB 遺 伝 子 を破 壊 す る と と も に変 異 型 ボ

ドを コ ー ド る 遺 す

伝 子 を導 入 した 変 異 株 を作 製 す る 。 こ の 変 異 株 を培 養 して形 態 観 察 す る 。 変 異 型
ボ
リペ プチ

ドが 溶 菌 酵 素 の溶 菌 活 性 に対 す る 抑 制 活 性 を有 す る 場 合 に は 、 変 異株
く

の 形 態 が 野 生 型 に比 較 して 丸

な る 。 一方 、 変 異 型 ボ リ ペ プ チ ド 溶 菌 酵 素 の 溶 が

菌 活 性 に対 す る 抑 制 活 性 を有 しな い場 合 に は 、 変 異 株 の形 態 が 野 生 型 と 同 様 に桿
状 と な る。 この よ
ぅ に、 変 異 型 ボ リ ペ プ チ

ドを コ ー ド る 遺 伝 子 を発 現 す る 変 異 す
リペプチ

株 の形 態 を観 察 す る こ と に よ って 、 変 異 型 ボ

ド 溶 菌 酵 素 の溶 菌 活 性 を が

抑 制 す る 活 性 を有 す る か否 か判 別 す る こ と が で き る 。

一方 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害剤 、 溶 菌 抑 制 剤 及 び P

の分 解 抑 制 剤 は 、 枯

草 菌 由 来 の oeB 遺 伝 子 が コ ー ド る タ ン パ ク 質 に 限 定 さ れず 、 草 菌 と は 異 な る す 枯
微 生 物 か ら 単 離 さ れ た 、 草 菌 oeB 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同遺 伝 子 に よ 枯
り コー

ドさ

れ る oeB タ ンパ ク 質 を 主 成 分 と す る も の で あ って も よ い。 草 菌 以 外 の微 生 物 と 枯
して は 、 例 え ば 、 Bac

us

c he

o

s 等 の 微 生 物 を挙 げ る こ と が で き る 。

以 下 、 れ ら枯 草 菌 以 外 の微 生 物 か ら oeB 遺 伝 子 の相 同 遺 伝 子 を 単 離 す る 一手 こ

法 を説 明 す る 。 しか しな が ら 、 当 業 者 は 、 以 下 の 手 法 に限 定 さ れず 、 定 法 に従 っ て 目的 と す る 相 同遺 伝 子 を 単 離 す る こ と が で き る 。

先 ず 、 塩 基 配 列 情 報 を格 納 した ヂ 一 タ ベ ー ス を用 いて 、 配 列番 号
配列 を ク エ
リ ー配 列 と

ェ

に示 す塩 基

して 相 同性 の 商 い遺 伝 子 を特 定 す る 。 次 に 、 特 定 した遺 伝
と と も に化 学 的 に合 成 す る 。
DN

子 を 特 異 的 に増 幅 す る た め の プ ラ イ マ ー を設 計 す る
次 に 、 象 の微 生 物 か ら 定 法 に従 って ゲ ノ ム 対
N

を抽 出す る 。抽 出 した ゲ ノ ム
oeB

を鋳 型 と して 上 記 プ ラ イ マ ー を用 いて P

に よ って 、 的 と す る 目

遺 伝 子 の相

同 遺 伝 子 を増 幅 し、 単 離 す る こ と が で き る 。

単 離 した

oeB

遺 伝 子 の相 同 遺 伝 子 が

oeB

タ ン パ ク 質 と 同様 な 機 能 を有 す る か

否 か は 、 単 離 した oeB 遺 伝 子 の 相 同 遺 伝 子 を組 み込 ん だ発 現 ベ ク タ ー を調 製 し、
対 象 の微 生 物 に形 質 転 換 し、 上 記 相 同 遺 伝 子 が 発 現 す る 条 件 下 で形 質 転 換 微 生 物

を培 養 した と き の 形 態 を観 察 す る こ と に よ って確 認 す る こ と が で き る 。 単 離 した
oeB

遺 伝 子 の相 同遺 伝 子 が

oeB

タ ン パ ク 質 と 同 様 な 機 能 を有 す る 場 合 に は 、 上
く

記 形 質 転 換 微 生 物 が 野 生 型 と 比 較 して 丸

な る 。一方 、単 離 した oeB 遺 伝 子 の 相

同遺 伝 子 が

oeB

タ ン パ ク 質 と 同様 な 機 能 を有 す る 場 合 に は 、 記 形 質 転 換 微 生 物 上

が 野 生 型 と 同 等 な 形 態 を示 す。

上 述 した枯 草 菌

oeB

遺 伝 子及 び 当 該

oeB

遺 伝 子 に対 応 す る 相 同 遺 伝 子 を用 い

る こ と に よ って 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 及 び 溶 菌 抑 制 剤 の 主 成 分 と な る
oeB oeB

タ ン パ ク 質 を調 製 す る こ と が で き る 。 上 述 した枯 草 菌

oeB

遺 伝 子又 は 当 該

遺 伝 子 に対 応 す る 相 同 遺 伝 子 を 用 いた

oeB

タ ンパ ク 質 の生 産 は 、 宿 主 菌 体

内 で 複 製 維 持 が 可能 で あ り 、 該 酵 素 を安 定 に発 現 さ せ る こ と が で き 、 該 遺 伝 子 を

安 定 に保 持 で き る べ ク タ ー に 当 該 遺 伝 子 を組 込 み、 得 られ た組 換 え べ ク タ ー を 用

いて宿 主 菌 を形 質 転 換 す る こ と に よ

り行 えば よ

い。
C

ベ ク タ ー と して は 大 腸 菌 を宿 主 と す る 場 合 、 に 限 定 さ れ な いが 、 特

8

p BR 3 2 2

P

3 00P

( ヤ ク ル ト本 社 ) 等 を使 用 す る こ と が で き る 。

ま た 、 枯 草 菌 を宿 主 にす る 場 合 、 特 に 限 定 さ れ な い が 、

0

SP

64

(

ooら
3 00P

B osc

B o e ch

o

B

oce

5 9 2 72

2 75

995) あ る い

は

等 を使 用 す る こ と が で き る 。
トプ ラ ス ト法 、 コ ン ピ テ

宿 主 菌 を形 質 転 換 す る に は プ ロ

ン トセ ル 法 、 エ レク ト

ロ ポ レー シ ョ ン 法 等 を用 いて 行 ぅ こ と が で き る 。 宿 主 菌 と

して は 特 に制 限 さ れ な
トレ

いが バ チ ル ス 属 ( 枯 草 菌 ) 等 の グ ラ ム 陽 性 菌 、 大 腸 菌 等 の グ ラ ム 陰 性 菌 、 ス

プ トマ イ セ ス 属 等 の放 線 菌 、 サ ッカ ロ マ イ セ ス 属 等 の酵 母 あ る いは ア ス ペ ル ギ ル
ス 属 等 の カ ビ が 挙 げ られ る 。

得 られ た形 質 転 換 体 は 、 資 化 し う る 炭 素 源 、 窒 素 源 、 金 属 塩 、 ビ タ ミ ン等 を含

む培 地 を用 いて適 当 な 条 件 下 で培 養 すれ ば よ い。 か く して 得 ら れ た培 養 液 か ら 、

一般 的 な 方 法 に よ って 酵 素 の 分 取 や精 製 を行 い、 限外 ろ過 濃 縮 、 凍 結 乾 燥 、 噴 霧
乾 燥 、 結 晶化 等 に よ って 、 溶 菌 酵 素 の溶 菌 活 性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る かた ち で
oeB タ ン パ ク 質 を得 る こ と が で き る 。

本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 及 び溶 菌 抑 制 剤 は 、 微 生 物 を培 養 して い る 培 地 又

は微 生 物 を懸 濁 した緩 衝 液 に添 加 さ れ る と 、 当 該 微 生 物 が 発 現 した溶 菌 酵 素 の活 性 を低 下 さ せ る こ と が で き 、 当 該 微 生 物 の溶 菌 を抑 制 す る こ と が で き る 。 本 発 明

に係 る 溶 菌 酵 素 阻害 剤 が 阻 害 す る 溶 菌 酵 素 と して は 、 特 に 限 定 さ れ な いが 、 細 胞
周 期 に依 存 して発 現 す る 溶 菌 酵 素 、 細 胞 周 期 に非 依 存 的 に発 現 す る 溶 菌 酵 素 を 挙
げ る こ と が で き る 。 特 に本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 は 、 枯 草 菌 にお け る 溶 菌 酵

素 である

E タ ンパ ク 質 、 w

F タ ンパ ク 質 、

w

タ ンパ ク 質 、

0 タ ンパ ク 質

及 び ddH タ ン パ ク 質 に よ る 溶 菌 作 用 を抑 制 す る こ と が で き る 。

E タ ンパ ク 質 、

F タ ンパ ク 質 、

w

S タ ンパ ク 質 、

w

タ ン パ ク 質 及 び ddH タ ンパ ク 質 は 、枯

草 菌 の 細 胞 分 裂 の 最 終 段 階 に 、 細 胞 分 裂 面 及 び菌 体 の 両 極 に発 現 す る 溶 菌 酵 素 で

あ る こ と が 知 られ て い る 。
タ ンパ ク 質 及 び

w

E タ ンパ ク 質 、

w

F タ ンパ ク 質 、

w

タ ンパ ク 質 、

ddH タ ン パ ク 質 は 、 そ れ ぞ れ N 末 端 側 か ら順 に シ グ ナ ル ペ

プ チ ド 細 胞 壁 結 合 ドメ イ ン及 び 細 胞 壁 溶 解 活 性 ドメ イ ン ( 、

L エ ン ド プチダ ペ

一ゼ ・ メ イ ン) を有 して い る 。本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 及 び溶 菌 抑 制 剤 は 、 ド
これ ら
E タ ンパ ク 質 、

F タ ンパ ク 質 、

S タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 及

び ddH タ ンパ ク 質 にお け る 細 胞 壁 溶 解 活 性 ドメ イ ン に結 合 して 、
質、

E タ ンパ ク

F タ ン パ ク 質 、C

タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 及 び

ddH タ ン パ ク 質 の

細 胞 壁 溶 解 活 性 を抑 制 す る こ と で 溶 菌 を抑 制 す る こ と が で き る 。
ま た 、 本 発 明 に係 る P
る 際 に添 加 さ れ る と 、 P

の分解 抑 制剤 は、 P

産 生 能 を有 す る 微 生 物 を培 養 す

の 分 解 活 性 を有 す る 溶 菌 酵 素 の P

分 解 活 性 を低 下 さ

当 せる こ と が き 、 該微 生物 が 産 生する

P

の低 分 子量 化 を防止 す る こ と が で き る 。
E タン

本 発 明 に係 る P
パ ク質、

の 分 解 抑 制 剤 が 阻 害 す る 溶 菌 酵 素 と して は 、例 え ぼ 、
S

F タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 及 び
P

0 タ ン パ ク 質 を挙 げ る こ と が

で き る 。 これ 引 菌 酵 素 に よ る 溶
に高 分 子 量 の P

分 解 活 性 を低 下 さ せ る こ と に よ って 、 比 較 的

を製 造 す る こ と が で き る 。

E タ ンパ ク 質 を コ ー

ド る遺伝子 ( す
ミ

E 遺 伝 子 ) の塩 基 配 列 を配列番 号 3 に

示 し、

E タ ンパ ク 質 の ア

ノ 酸 配 列 を配 列 番 号 4

に示 す。 ま た、

F タ ンパ ク
w

質 を コ ー ド る遺伝子 ( す
パ ク 質 のア
(
ミ

F 遺 伝 子 ) の塩 基 配 列 を配 列 番 号 5 に示 し、

F タン

ノ 酸 配 列 を配 列 番 号

6 に示 す。

タ ンパ ク 質 を コ ー ド る 遺 伝 子 す

遺 伝 子 ) の塩 基 配 列 を配 列番 号 5

4 に示 し、

S タ ンパ ク 質 の ア

ミ

ノ 酸配

列 を配 列 番 号 5 5

示 す。

タ ンパ ク 質 を コ ー ド る 遺 伝 子 ( す
w

遺 伝 子) の

塩 基 配 列 を配 列 番 号 5 6 に示 し、

タ ンパ ク 質 の ア

ミ

ノ 酸 配 列 を配 列 番 号 5

7

に示 す。 ddH タ ンパ ク 質 を コ ー ド る 遺 伝 子 ( d d H 遺 伝 子 ) の塩 基 配 列 を配 列 番 す
号5
に示 し、 ddH タ ン パ ク 質 の ア
w
ミ

ノ 酸 配 列 を配 列 番 号

5

9 に示 す。
w

枯 草 菌 由来 の

E タ ンパ ク 質 、

w

F タ ンパ ク 質 、

S タ ンパ ク 質 、

タン

パ ク 質 又 は ddH タ ン パ ク 質 と 機 能 的 に等 価 な タ ン パ ク 質 と は 、 配 列番 号 4 、 6 、
55

5 7 又 は 5 9 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に お いて ェ 又 は 数 個 の ア ミ ノ 酸 が 置 換 、
ミ

欠 失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

活 性 を有 す る タ ンパ ク 質 や、 配 列番 号 4 、 6 、 5 5

又 は 5 9 に示 す ア ミ

ノ

酸 配 列 に対 して 7 0 以 上 、 8 0 以 上 ま た は 、 9 0 以 上 の 相 同性 を有 す る タ ンパ ク 質 、 よ り 好 ま し く は 9 5

以 上 、 さ ら に好 ま し く ほ 9 6

以 上 、 特 に好 ま

しく は 9 7 。 上 、 よ 以
の相 同性 を 有 す る ア ミ

り 特 に好 ま

しく は 9 8

以 上 、 最 も 好 ま しく は 9

9

以上

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す

る タ ンパ ク 質 を意 味 す る 。 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 は 、 こ れ ら の タ ンパ ク 質

に対 して も 作 用 す る こ と が で き る 。
こ こ で 、 置 換 、 欠 失 、 付 加 又 は挿 入 す る ア
ミ

ノ酸

は、 例 え ば

4 ~

0個 、 好 ま
ェ

しく は

2 ~
ミ

0個 、 よ

り好 ま

しく は ェ ~ 0 個

と す る こ と が で き る 。 ま た、

又

は複 数 の ア

ノ 酸 が 置 換 、 欠 失 、 付 加 又 は挿 入 さ れ る 領 域 と
ミ

して ほ 、 例 え ば 、 配

列番 号 4 に示 すア

ノ 酸 配 列 に おいて 3 7

~ 4

番 目の領 域 、 列番 号 6 に示 す ア 配

ミ

ノ 酸 配 列 に おいて 2 8

334 ~

番 目 の領 域 、 列番 号 5 5 に示 すア 配

ミ

ノ 酸 配 列 にお

いて

2 ~9 0番 目の領 域 、 配 列番 号 5
ミ

7 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に お いて

343 ~

番目

2 ~06 番 目 の領 域 を 除 く 領 域 を挙 げ る こ と が で き る 。 こ の 配 列 番 号 4 に 示 す ア ノ 酸 配 列 に お け る 3 7 ~ 488 334 番 目 の領 域 、配 列番 号 6 に示 すア ノ 酸 配 列 にお け る 2 8 ~ 番 目 の領 域 、配 列 番 号 5 5 に示 すア ノ 酸 配 列 に おいて ~9 0番 目の領 域 、 列番 号 5 7 に示 すア 2 配 ノ 酸 配 列 におい ノ 酸 配 列 に おいて ~ 343 番 目 の領 域 、 列 番 号 5 9 に示 す ア 配 て 1~6 0番 目 の領 域 は 、 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 が 結 合 す る 領 域 と 考 え られ 2 本

の領 域 、 列番 号 5 9 に示 すア 配

ノ 酸 配 列 に お いて

ミ

ミ

ミ

ミ

ミ

る た め 、 当 該 領 域 を 除 く 領 域 で あれ ば

又 は複 数 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠 失 、 付加

又 は挿 入 さ れ た と して も 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 にお け る 抑 制 活 性 を保 持
で き る も の と 考 え られ る 。
以 上 説 明 した よ ぅ に 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 及 び 溶 菌 抑 制 剤 に よ れ ば 、
oe

タ ンパ ク 質 が

E タ ンパ ク 質 、

F タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 又 は

d H タ ンパ ク 質 と い った溶 菌 酵 素 の 細 胞 壁 溶 解 活 性 ドメ イ ン に

結 合 す る こ と に よ って 、 該 溶 菌 酵 素 の 細 胞 壁 溶 解 活 性 を抑 制 す る こ と が で き る 。 当
こ れ に よ り 、 上 記 溶 菌 酵 素 を発 現 す る 微 生 物 は 、 溶 菌 が 抑 え ら れ比 較 的 に長 時 間

の培 養 が 可 能 と な る 。 え ば 、 草 菌 な ど の微 生 物 を用 いて 物 質 生 産 を行 例 枯
個 々 の 菌 体 の 培 養 時 間 を長
く

ぅ場 合 、

で き れ ば 、 物 質 の 生 産 量 も 向上 す る と い え る 。 所 望

の 物 質 を 生 産 す る 微 生 物 を培 養 す る 際 に 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害剤 を 添 加 す
る こ と に よ って 、 当 該 物 質 の 生 産 効 率 の 向上 を期 待 す る こ と が で き る 。

本 発 明 に係 る 溶 菌 抑 制 剤 は 、 広

く 微 生 物 に適 用 す る

こ と が で き る が 、 特 に、 枯

草 菌 等 の Bac

s 属 に属 す る 細 菌 に対 して適 用 す る こ と が 好 ま しい。 発 明 に係 本

る 溶 菌 抑 制 剤 が 対 象 と す る 微 生 物 は 、 野 生 型 の微 生 物 に 限 定 さ れ ず 、 例 え ぼ 種 々

の 突 然 変 異 を有 す る 変 異 株 を対 象 と す る こ と も で き る 。 本 発 明 に係 る 溶 菌 抑 制 剤
が 対 象 と す る 微 生 物 の 一例 と して は 、 少 な く と も
工

種 以 上 の 分 泌 型 プ ロ テ ア 一ゼ

を欠 損 した変 異 株 を挙 げ る こ と が で き る 。 こ の 変 異 株 は 、 分 泌 型 プ ロ テ ア 一ゼ を
欠 損 して い る の で 、 有 用 タ ンパ ク 質 等 の 物 質 を菌 体 外 に産 生 す る 宿 主 と して 好 適

で あ る 。 こ の 変 異 株 を用 いて 当 該 物 質 を生 産 す る 系 に お いて 、 本 発 明 に係 る 溶 菌

抑 制 剤 を添 加 す る こ と に よ って 変 異 株 の 溶 菌 を抑 制 す る こ と が で き 、 比 較 的長 期

に亘 って 変 異 株 を培 養 す る こ と が で き る 。 そ の結 果 、 当 該 物 質 の 生 産 効 率 を 向上
さ せ る こ と が で き 、 物 質 の製 造 コ ス ト を低 減 す る こ と が で き る 。

ま た 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害剤 及 び溶 菌 抑 制 剤 の 添 加 量 は 、 特 に 限 定 さ れ

ず、

E タ ンパ グ 質 、 w

F タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 、

0 タ ンパ ク 質 又 は

ddH タ ン パ ク 質 と い った 溶 菌 酵 素 の 細 胞 壁 溶 解 活 性 ドメ イ ン に結 合 し ぅ る 範 囲

で適 宜 規 定 す る こ と が で き る 。
ま た 、 以 上 説 明 した よ
う

に 、本 発 明 に係 る

P

の分解 抑 制 剤 に よ れ ば 、 o e
タ ンパ ク 質 又 は

タ

ンパ ク 質 が

w

E タ ンパ ク 質 、

F タ ンパ ク 質 、

タ ンパ

ク 質 と い った P

の 分 解 活 性 を有 す る 溶 菌 酵 素 の 細 胞 壁 溶 解 活 性 ドメ イ ン に結 合
P

す る こ と に よ って 、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る
こ れ に よ り 、P

分 解 活 性 を抑 制 す る こ と が で き る 。
の分解 抑

産 生 能 を有 し、上 記 溶 菌 酵 素 を発 現 す る 微 生 物 は 、P

制 剤 の 存 在 下 に お い て培 養 さ れ る と 、 比 較 的 に高 分 子 量 の P

を産 生 す る こ と が
の分 解 抑 制 剤

で き る 。 こ こ で 、 比 較 的 に高 分 子 量 の P
の 非 存 在 下 に おいて微 生 物 が 産 生 した P

と は 、 本 発 明 に係 る P

の 平 均 分 子 量 と 比 較 して 有 意 に 高 分 子
の 分 解 抑 制 剤 は 、 上述 した よ

量 で あ る こ と を意 味 す る 。 ま た 、 本 発 明 に係 る P

ぅ に微 生 物 の溶 菌 を抑 制 す る こ と も で き る た め 、 比 較 的 に 高 分 子 量 の P

を長 時

間 に亘 って 産 生 す る こ と が で ぎ る 。
本 発 明 に係 る P
の 分 解 抑 制 剤 は 、P 産 生 能 を有 す る 微 生 物 に広
く 利 用 する

こ と が で き る 。 こ こで、 P

産 生 能 を 有 す る 微 生 物 と して は 、 Bac
o

u s S ub
u s an

s

va
Bac

na

o、 ac B

us

c he

s

ac

s m e 呂a e
a ca
yd

ac

s ha o du ans や、 a N

a ba ae g y P

a 等 を挙 げ る こ と が で き る 。
う

一方 、 本 発 明 に よ れ ば 、 上述 した溶 菌 酵 素 阻 害 剤 或 いは溶 菌 抑 制 剤 を コ ー ド す
る 遺 伝 子 が 発 現 誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に発 現 す る よ

に改 変 した微 生 物 を

提 供 す る こ と が で き る 。 本 発 明 に係 る 微 生 物 を発 現 誘 導 条 件 下 で 培 養 す る こ と に
よ って 、 上 述

した溶 菌 抑 制 剤 が 培 地 中 に分 泌 さ れ る 結 果 、 比 較 白りに長 期 間 に亘 っ

て 溶 菌 を抑 制 す る こ と が で き る 。

した が って 、 こ の よ

う

に構 成 さ れ た本 発 明 に係 る 微 生 物 を利 用 して 、 有 用 タ ン

パ ク 質 等 の 物 質 を 生 産 す る こ と に よ って 当 該 物 質 の 生 産 効 率 を 高 め る こ と が で き
る 。 特 に 、 本 発 明 に係 る 微 生 物 は 、 少 な く と も
ェ

種 以 上 の 分 泌 型 プ ロ テ ア 一ゼ を

欠 損 した変 異 株 を宿 主 と し、 上述 した溶 菌 酵 素 阻 害 剤 或 い は溶 菌 抑 制 剤 を コ ー ド

す る 遺 伝 子 が 発 現 誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に発 現 す る よ

う

に改 変 した も の で

あ る こ と が 好 ま しい。 こ の よ ぅ に構 成 す る こ と に よ って 、 生 産 対 象 の 有 用 タ ン パ
ク 質 等 の 分 解 を 防 止 す る こ と が で き 、 よ り 優 れ た生 産 効 率 を達 成 す る こ と が で き

る。
立 こ こ で 発 現 誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー と は 、 所 定 の 物 質 の 存 在 を 条 件 と し 下 流 [こィ て

置 す る 遺 伝 子 の発 現 を尤 進 す る 機 能 を有 す る プ ロ モ ー タ ー を意 味 す る 。 本 発 明 に
係 る 微 生 物 に おいて 、 発 現 誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー と して は 、 特 に 限 定 さ れず 、 一例
と

して a c オ ペ ロ ン の リ プ レ ッサ 一 で あ る a c に よ って 制 御 さ れ

PT

の存 在 下

で 下 流 遺 伝 子 の発 現 誘 導 す る プ ロ モ ー タ ー ( P ,。 を挙 げ る こ と が で き る 。 。) ,

特 に 、 本 発 明 に係 る 微 生 物 と して は 、P
述 した P

産 生 能 を有 す る 微 生 物 に対 して 、 上

の分 解 抑 制 剤 を コ ー ド る 遺 伝 子 が 発 現 誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー の制 御 下 す
う

に発 現 す る よ

に改 変

さ れた も の で あ る こ と が 好 ま

しい。 こ の微 生 物 を培 地 に培

養 す る こ と に よ って 、 比 較 的 に高 分 子 量 の P
こ の微 生 物 を培 地 に培 養 して 高 分 子 量 の P

を製 造 す る こ と が で き る 。 な お 、 を製 造 す る に 際 して 、 当 該 培 地 に対

して別 途 準 備 した P

の 分 解 抑 制 剤 を添 加 して も 良 い。

以 下 、 実 施 例 を 用 いて 本 発 明 を よ り 詳 細 に説 明 す る が 、 本 発 明 の 技 術 的範 囲 は
以 下 の 実 施 例 に 限 定 さ れ る も の で は な い。
(実施例
oeB タ ン パ ク 質 と 溶 菌 酵 素 と の相 互 作 用 検 討

本 実 施 例 で ほ 、 oeB 遺 伝 子 ( 配 列番 号

) に よ り コ ー ドさ れ る
り コー

oeB

タ ンパ ク

質 ( 配 列番 号 2 ) と 、

E

遺 伝 子 ( 配 列番 号 3 ) に よ

ドさ れ る

E タン

パ ク 質 と の 相 互 作 用 を検 討 した。

具 体 的 にほ、 先ず、

oeB

L

タ ンパ ク 質 を P T

に よ る 誘 導 に よ って発 現

する
する
H・e

E

o e B3 F L 株 と 、

E

L

タ ン パ ク 質 を P T に よ る 誘 導 に よ って発 現
o e B3 F L 株 及 び
E3 FL

E E 3 F L 株 と を構 築
a ・ 20 3 ,0

した。 E
・ on o亡 ・
士

株 は、 E 株 (

, ,

""

。, 。

Lo c a

・ za

he v e ge a
s u㎡ace

・e ce v

a
,

hyd
・y

L ases Ly , y E ,
0

Ly F 0 n
o oe
W

he
a

BaC ・

u s s ub 士 ・
ex

s

C

e

a nd s a b

hese
8 5 6666

e nzymes
一 6677

bo d O

ace

a

P

o eases
o
ex

, ,

J ・BeC

・ e 丁ェ
Se

。・

)

を用 いて 作 製 した。 こ の E 株 は 、

ace u a

ne P

ea s e であ

る
ce

ep
W

遺 伝 子 を テ ト ラ サ イ ク リ ン耐 性 遺 伝 子 を挿 入 す る こ と で 欠 損 す る と と も に
a

assoc

aeP

o ease

で あ る wp

遺 伝 子 を カ ナ マ イ シ ン耐 性 遺 伝 子 を

挿 入 す る こ と で 欠 損 した遺 伝 子型 を有 して い る 。
E

o e B3 F L 株 は 、 P

誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー の 下流 に

oeB

L

タ ンパ ク 質

を コ ー ド る 遺 伝 子 を配 したべ ク タ ー p す
よ って 作 製 した。 E E 3 F L 株 は 、 P T

3 F L o e B を E 株 に形 質 転 換 す る こ と に

誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー の下流 に

E

L

タ ン パ ク 質 を コ ー ド る 遺 伝 子 を配 したぺ ク タ ー p す
る こ と に よ って 作 製 した。 な お 、3 X FL

3 F L E を E 株 に形 質 転 換 す
ma

と 融 合 さ れ た タ ン パ ク 質 は 、s

社製

のa

FL

2

o
E

o c on a

a

b o dy に よ って 検 出す る こ と が で き る 。

次 に 、 築 した 構

o e B3 F L 株 及 び E E 3 F L 株 か ら そ れ ぞ れ表 層 タ ンパ ク 質 を抽

出 した。 具 体 的 に は 、 各 株 を そ れ ぞ れ 皿 寒 天 培 地 に植 菌 し、

Cで

2

時 間前 々

培 養 を行 った後 、 ら れ た シ ン グ ル コ ロ 二 一 を 5 m の 皿 液 体 培 地 に植 菌 して 3 0C 得
m で 0時 間 前 培 養 を行 った。 前 培 養 後 、 5 0 の山B 液 体 培 地 に

0 の値 が 0 ・ と

な る よ ぅ に植 菌 し、

の値 が
0

2 ・ に な る ま で本 培 養 0

を行 った。 培 養 終 了後 、 培
り

養液 を
T

0

p

で

分 間 の 条 件 で 遠 心 分 離 した 。 上 清 を 取

除き、
に

m

s

H
(2 5

(PH7 2 ) で 洗 浄

した 。 洗 浄 後 の 沈 殿 を

0は

となるよ ぅ

3

L

T

s

H

PH 7

) に懸 濁 し、 氷 上 に 2 0分 間静 置 した。 そ の 後 、 4 C
5

p で 0分 間 の 条 件 で遠 心 分 離 した。上 清 を 回収 し、終 濃 度 が

とな る よ

㍉こ T
後 、4 C

( ト リ ク ロ ロ 酢 酸 ) を加 え て よ く 懸 濁 し、 氷 上 に 6 0分 間 静 置 した。 そ の

50 0 p 0

で

5

分 間 の 条 件 で 遠 心 分 離 を行 った。 上 清 を 取
T

り 除 き 、 沈殿

を
E

70

ェタ ノ ー ル で リ ン ス を して
バ

を充 分 に 除 去 した。 以 上 の よ ぅ に して 、

o e B3F L

株 及 び E E 3 F L 株 か ら表 層 タ ンパ ク 質 を そ れ ぞ れ抽 出 した。

次 に、 T B

ッフ ァー
(n
FL
。

(
2

T

s

H

、

0

Na

(PH7

4) ) に置 換 した ア フ

ィニ テ ィー ゲ

n

y

e

F eeze

ae

( g a 社製 ) ) を 2 0 0

加 え て 混 合 した。 4 C で
で

時 間緩 や か に ( 8 p m) 撹 絆 した。 そ の 後 、 5 0 0 p 0
ぅ に留 意

分 間 の 条 件 で遠 心 分 離 した。 沈 殿 した ゲ ル を 扱 引 しな い よ

な が ら、

上 清 を 除 去 した。 そ の 後 、T B バ ッフ ァー を 5 0 0
ルを p n
し、
0 9

加 え て懸 濁 した。 そ の 後 、 ゲ
o u ns

ou

(

c

o

Bo

p

h

o

a og

aphy

( B

ア製

) に移

で

30

秒 間 の 条 件 で遠 心 して ゲ ル を ト ラ ップ さ せた。 そ の 後 、 5 0 は 0

の
yc

B

バ ッフ ア ー で

3

回、 浄 した。 次 に 、 洗

yc ne H

e
0 9

on b
で

e (0

e

を 0は 0
り返

ず つ加 え 、 よ く 撹 絆 した。 分 後 、
した も の を併 せて溶 出溶 液 を得 た。
SD

3 0秒 間 で 溶 出

し、 こ れ を 2 回繰

次 に 、 得 ら れ た溶 出溶 液 について

P

E を用 い て バ ン ド タ ー ン を調 べ た。 パ

な お、 電 気 泳 動 に は 、 菌 体 0 。 2 0 か ら抽 出 した 量 に相 当 す る タ ンパ ク 質 を各 二0

レー ン に チ ヤ 一 ジ した 。 結 果 を 図
E o e B 3 F L 株 か ら抽 出 した抗 F L

に 示 す。 図

に お い て 、 レー ン

ェ

は

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ンパ ク 質 で あ り 、 レー

ン 2 は E E 3 F L 株 か ら抽 出 した抗 F L

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ンパ ク 質 で あ る 。
o e B 3 F L 株 か ら抽 出 した抗 F L

図

の レー ン ェ か ら判 る よ

う

に、 E

抗 体 で精

製 した表 層 タ ン パ ク 質 に は 、
ク 質 の位 置 にバ ン

E タ ンパ ク 質 、

F タ ンパ ク 質 及 び o L タ ン パ
ェ

ド 検 出 さ れ た 。 こ の と き の 積 算 値 と そ の 比 率 と を表 が

に示 し

た。 」

こ の結 果 よ り 、 菌 体 菌 体

D

が 2 ・ の 時 に oeB タ ン パ ク 質 は 、 0

E タ ンパ ク

質 、 w F タ ンパ ク 質 及 び o 孔 タ ンパ ク 質 と 結 合 して い る こ と が 示 さ れ た。な お 、
o

L タ ンパ ク 質 は P e p

do

yc a n

hy d o ase ( L

e

dop ep

da s e

am
ぅ に、

y
E 3FL

と して 知 ら れ て い る 成 分 で あ る 。 た 、 ま 図

の レー ン 2 か ら判 る よ

株 か ら抽 出 した抗 F L

抗 体 で精 製 した表 層 タ ン パ ク 質 に は 、 oeB タ ン パ ク 質 の

位 置 にバ ン ド 検 出 さ れ た。 が
ま た 、 oeB タ ン パ ク 質 と 相 互 作 用 して い る タ ン パ ク 質 が
る こ と を確 認 す る た め 、 質 と 基
E タ ンパ ク 質 で あ

して 細 胞 壁 成 分 を使 用 したザ イ モ グ ラ フ を行 った。
した。 す な わ ち、 先 ず 、 枯 草 菌 168 株 を 4 L の 系
溶 液 に懸 濁 し、 5 分 間煮 沸 した。 室 温 ま
め

細 胞 壁 成 分 は以 下 の よ

ぅ に調 製

で 培 養 して集 菌 した後 、 菌 体 を 4 L で 冷 却 した後 、溶 液 に ガ ラ ス ビー ズ (

ザ ー を用 い 0 ・ m) を加 え 、 ホ モ ジ ェナ イ

て

時 間破 砕 し、続 いて超 音 波 を用 いて
0p 0

3 0分 間破 砕

した。得 られ た破 砕 液 を静 置

して 上 清 の み を 回収 した。

で

5

分 間遠 心 分 離 した 後 の 上 清 を 回収 す る こ
0 分 間遠 心 分 離 す る
D

と で 、 ガ ラ ス ビ ー ズ を完 全 に 除 去

した。 次 に 、 3 0 0 p で 0
(W v ) の
DS

こ と で 沈 殿 画 分 に細 胞 壁 成 分 を 回収 した。次 に 、4

溶 液 に沈 殿 画 分 を

懸 濁 し、 5 分 間煮 沸 した。 室 温 ま で 冷 却 した後 、

を完 全 に 除 去 で き る ま で イ

オ ン 交 換 水 で 洗 浄 した 。 得 られ た溶 液 を細 胞 壁 成 分 溶 液 と した。 な お、 細 胞 壁 成

分 溶 液 の 濃 度 は 、細 胞 壁 成 分 溶 液 の
のとき ・ g
と

540 m n

にお け る

を測 定 し、

の値 が

0 ・

して 算 出 した。
S

ザ イ モ グ ラ フ ィは 以 下 の よ ぅ に行 った。 ず 、 先
ge
5 終濃度 0 0 ・

P

E を行

う

際 に、 e p a s

a on

と な る よ ぅ に上 述
e

3 した 細 胞 壁 成 分 を加 え た。 動 終 了後 、 7 C 泳

で
T

~6 時 間 の条 件 で ゲ ル を
o
0)

a

a on B

e

( 5㎜ 2

T

s

H
me

(pH7 2

内 で 緩 や か に振

とぅ

した。そ の 後 、 色 液 ( 0 0 染

hy e e b

e

00 ・

K H ) に浸 して室温 で 穏 や か に振 と ぅ し、イ オ ン 交 換 水 で 活 性 バ ン ド 目視 が

で き る ま で 脱 色 した。
結 果 を図
B

に示 す。 図

B

において 、 レー ン

ェ

は

E

o e B 3 F L 株 か ら抽 出 した

抗 FL

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ン パ ク 質 で あ り 、 ー ン 2 は基 質 と して 細 胞 壁 成 分 レ
B

を加 え た ザ イ モ グ ラ フ で あ る 。 図
と相 互作 用

の レー ン 2

示す よ

う

に、

oeB

タ ンパ ク 質

して いた タ ンパ ク 質 と して 、

E タ ンパ ク 質 を 同 じ位 置 に ほ ぼ 同 じ強

度 で バ ン ド 検 出 さ れ た。 が
以 上 、図

及 び B の結 果 か ら 、

。 タ ンパ ク 質 と 。 B

w

E タ ンパ ク 質 が 結 合 す る

こ と が 示 さ れ た。

次 に、

oeB

タ ンパ ク 質 が

E タ ン パ ク 質 の ど の ド イ ン に結 合 して い る の か メ

を調 べ た。 な お 、

E タ ン パ ク 質 は 、 N 末 端 か ら順 に シ グ ナ ル ペ プ チ ド 細 胞 壁 、

結 合 ドメ イ ン及 び活 性 ドメ イ ン を有 して い る 。 こ で 、 性 ドメ イ ン を有 しな い、 そ 活
N

末 端 か ら順 に シ グ ナ ル ペ プ チ ド 細 胞 壁 結 合 ドメ イ ン及 び F L 、
E

タ グか らな る変
E 5 x Ly s 3 几

異型

3 X FL

タ ンパ ク 質 を P

に よ る 誘 導 に よ って発 現 す る

株 を構 築 した。

そ して 、 述 した E E 3 F L 株 及 び 上

E 5 x LysM3FL

株 を用 いて 上 述 した 実 験 と 同様
S

に して 、 抗 F L

抗 体 を用 いて表 層 タ ンパ ク 質 を精 製 し、

P

E を 用 いて バ ン

ド タ ー ン を調 べ た。な お、電 気 泳 動 に 際 して は 、 E E 3 F L 株 の場 合 に は菌 体 パ
0 二 2 0 か ら抽 出 した量 に相 当 す る タ ンパ ク 質 を 、 E

。0 。

x LysM3FL 株 の場 合 に は 菌 体

D。 0 。。 20 0 か ら抽 出 した量 に相 当 す る タ ン パ ク 質 を各 レー ン に チ ヤ 一 ジ した。 0

結 果 を図 2

に示 す。 図 2

の レー ン

は

E3F

株 か ら抽 出 した抗 F L

抗体

で精 製 した表 層 タ ンパ ク 質 で あ り 、 レー ン 2 ほ
FL

E 5 x LysM3FL 株 か ら抽 出 した抗

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ンパ ク 質 で あ る 。 図 2
oeB

か ら判 る よ

ぅ に、

レー ン

で

は

タ ン パ ク 質 の バ ン ド 検 出 さ れ て い る が レー ン 2 で は検 出 さ れ て い な い。 が
E タ ンパ ク 質 に お け る 活 性

こ の結 果 か ら 、 oeB タ ンパ ク 質 は 、

ドメ イ ン に結 合

して い る こ と が 明 か と な った。

一方 、図

に示 した よ

ぅ に 、 oeB タ Y

ンパ ク 質 は

F タ ン パ ク 質 と も 結 合 して

い る こ と が 明 か と な った。 そ こ で 、
と の 相 互 作 用 部 位 を検 討

F タ ン パ ク 質 について も 、 oeB タ ン パ ク 質
w

した。 な お 、
w

F タ ンパ ク 質 は 、枯 草 菌 に お け る 主 要 な

細 胞 壁溶解酵素 であ り 、

E タ ンパ ク 質 と 同様 な 局 在 パ タ ー ン ( す な わ ち、 分 裂

面 及 び 両 極 ) を示 す こ と が 知 ら れ て い る 。
本 実 験 でほ、
w

F

3 X FL

タ ンパ ク 質 を

PT

に よ る 誘 導 に よ って発 現 す る

E F 3 F L 株 と 、活 性

ドメ イ ン を有 しな い、N 末 端 か ら順 に シ グ ナ ル ペ プ チ ド 細 胞 、
タ グ か らな る 変 異型
E 3 x Ly s 3 F L
w

壁 結 合 ドメ イ ン及 び F L

F

L

タ ンパ ク 質 を

PT

に よ る 誘 導 に よ って発 現 す る
E

株 を構 築 した。 れ ら こ

F3FL 株 及 び

x LysM3FL 株 を用 いて 、 上 述
S

した実 験

と 同様

に して 、 抗 F L

抗 体 を 用 いて 表

層 タ ンパ ク 質 を精 製 し、
結 果 を図 2
B

P
B

E を 用 いて バ ン ド タ ー ン を 調 べ た 。 パ

に示 す。 図 2

の レー ン

は

E F 3FL

株 か ら抽 出 した抗 F L

抗体

で精 製 した表 層 タ ンパ ク 質 で あ り 、 レー ン 2 は
FL

E 3 x LysM3FL

株 か ら抽 出 した抗
ぅ に、

抗 体 で 精 製 した表 層 タ ンパ ク 質 で あ る 。 図 2 B か ら判 る よ
oeB

レー ン

工

で

は

タ ン パ ク 質 の バ ン ド 検 出 さ れ て い る が レー ン 2 で は検 出 さ れ て い な い。 が
F タ ン パ ク 質 に対 して も
W

こ の結 果 か ら 、 oeB タ ンパ ク 質 は 、
と 同様 に 、 活 性

Eタ

ンパ ク 質

ドメ イ ン に結 合 して い る こ と が 明 か と な った。

(実施例 2

溶 菌 酵 素 活 性 に対 す る

。 B 。 タ ン パ ク 質 の抑 制 作 用 ェ
oeB

本 実 施 例 で ほ 、 菌 酵 素 の も つ細 胞 壁 溶 解 活 性 に対 して 溶

タ ンパ ク 質 が ど の

よ ぅ に作 用 す る の か を 、 液 体 中 に お け る 活 性 測 定 に よ り 調 べ た。 本 実 施 例 で ほ 、

実施例

ェ

と 同様

に して調 製 した細 胞 壁 成 分 を基 質 と して 、
E

oeB

タ ンパ ク 質 の 存 在

下又 は非 存 在 下 で
定 した。

の

末 端 側 活 性 ドメ イ ン (

ET)

の 細 胞 壁 溶 解 活 性 を測

本 実 施 例 に お いて 、 細 胞 壁 溶 解 活 性 測 定 に は 、 全 て 2 0 刷

E

b

( 「PH6

5) を

用 いた 。 こ の 測 定 用

bu

e

二・ で 、 0 。。 0 6 に相 当 す る 量 の 細 胞 壁 成 分 を洗 浄 し、
4

遠 心 分 離 して 細 胞 壁 を沈 澱 さ せた。 上清 を 取

り 除 き 、沈 澱

に2

の測 定 用

bu

e

を加 え て 懸 濁 し、最 終 的 に
と

,3 。。 0 ・ と な る よ う

に細 胞 壁 成 分 を調 整 し、基 質 溶 液

した。
活 性 測 定 に 際 して は 、 H
s

a

を融 合 さ せた

E

の

末 端 側 活 性 ドメ イ ン

(H
H

E

TD)

を 基 質 溶 液 に 作 用 さ せ、 基 質 溶 液 の 濁 度 を測 定 した 。 す な わ ち 、

E

T

に よ る 細 胞 壁 溶 解 活 性 を濁 度 の減 少 率 と して評 価 した。 基 質 溶 液 の

濁 度 は、

560 型 紫 外 可 視 分 光 光 度 計

(

日本 分 光 社 製 )

を用 いて 測 定 した。 濁 度
2

の減 少 率 は 、 測 定 開 始 後 0 分 の
D

値を 0 0 と し、 5 、 0

0及 び

3

0分後 の

。。 か ら算 出 した。 。値

本 実 施 例 で は 、 基 質 溶 液 に 2 n mo
基 質 溶 液 に 2 n mo

(29

の

H

s

wE
(38
s

を加 え た サ ン プ ル 、
)

( 2

9

の

H

s

w E T 及び 2 n o
o
(2 )

のH

s

oe B を
o
(7 6 ・

加 え た サ ン プ ル 、 び に基 質 溶 液 に 2 並
は9)

のH

E T 及び 4

の

H

s

o e B を加 え た サ ン プ ル について 測 定 した。
ぅ に、 墓 質 溶

反 応 時 間 と 濁 度 の減 少 率 と の 関係 を 図 3 に示 す。 図 3 か ら判 る よ 液にH
s

E

を加 え た サ ン プ ル で は 、 定 開 始 直 後 か ら 0 。。 が 著 し く 減 少 測 値
4

した こ と か ら 、 H

s

W

E

T

が 細 胞 壁 に対 して 強 い溶 解 活 性 を持 つ こ と が 分 か っ
s

た。 こ れ に対 して 、基 質 溶 液 に等 モ ル 量 で H

E T 及び H

s
s

o e B を加 え た サ
C ECTD の み を
s

D ン プ ル で は 、 測 定 開 始 直 後 か ら 0 。値 の減 少 は み られ る が 、H 0

加 え た ザ ン プ ル と 比 べ て緩 や か な 曲線 が 得 られ た こ と か ら 、等 モ ル 量 の H
を加 え た こ と に よ
H

o eB

りHs

ET
2

の活 性 が 抑 制 さ れた と いえ る 。 さ ら に、

s

E TD と

H

s

oeB

とを

の モ ル 比 で加 え た サ ン プ ル の場 合 、測 定 開 始 直

後 から
H

値 の 減 少 は ほ と ん ど み られ ず 、 ほ ぼ 一 定 で あ った 。 こ の こ と か ら 、
E TD に対 して 2 倍 の モ ル 量 の H
s

s

o e B を加 え る こ と に よ

り、 s H

ET

の 活 性 ほ ほ ぼ 0 阻 害 さ れ る こ と が 分 か った。 0
20

(実 施 例 3

溶 菌 酵 素 活 性 に対 す る oeB タ ンパ ク 質 の 抑 制 作 用 2
ェ

本 実 施 例 で ほ、実施 例

と 同様

B に して調 製 した細 胞 壁 成 分 を基 質 と して 、 o 。
C

タ ンパ ク 質 の 存 在 下 又 は非 存 在 下 で C

0 及 び d H の C 末 端 側 活 性 ドメ イ

ン の 細 胞 壁 溶 解 活 性 を測 定 した。
冬

の

末 端 側 活 性 ドメ イ ン の調 整 ノ

L エ ン ド プ チ ダ 一 ゼ ・ メ イ ン 第 2 9 0番 目 か ら終 止 コ ドン お よ び 6 bp の 転 ペ ド
写 終 結 様 配 列 を含 む に相 当 す る c
BF

遺伝子の 3 末端
cg

N

配 列 を、 プ ラ イ マー
KR

JL

gcgc

ga c o c a a a c a

caa a a gg

配 列 番 号 6 0) 及 び

JL

( g 。。 g

"c

。。 g
N

"" ca

c

配 列番 号 6

) を用 いて 、枯 草 菌 6 8 株 か ら
JL

抽 出 した ゲ ノ ム
及び K

を鋳 型 と し、 P

に て増 幅 した。な お 、 記 プ ラ イ マ ーBF 上

J L にお け る 下線 の塩 基 配 列 は 、 れ ぞ れ Ba H 及 び Kp そ

限酵 素 認 識
で

配 列 を示 す。P R に よ る 増 幅 後 、得 られ た P
処 理 し、 イ ン サ ー ト を得 た。
次 い で 、プ ラ ス 結 し、プ ラ ス
ミ
ミ

産 物 を制 限酵 素 Ba H 及 び Kp

ドp E3 0 を Ba

H

及 び Kp

で 処 理 し、上記 の イ ン サ ー ト と 連
ミ

ドp

孔 を構 築 した。 な お、 プ ラ ス

ドp E 3 0 ほ 、大 腸 菌 に お
ミ

いて H s タ グ 融 合 タ ンパ ク 質 を発 現 さ せ る た め に 開 発

さ れたプ ラ ス

ドで あ る 。

イ ン サ ー ト部 分 の DN 配 列 が 正 し く 挿 入 さ れ た か否 か を シ ー ケ ン ス に よ り 確 認、

した。正 し く 挿 入 さ れ た こ と を確 認 で き た プ ラ ス
法 によ
り 大腸 菌

ミ

ドp E A o L を 、コ ン ピ テ ン
ミ

ト

J

0 株 に導 入 した。以 後 、プ ラ ス 9
「

ドp E ム 。 が 導 入 さ れ た 大 孔

腸菌

EP 4 ) 株 を
p E ム o L) を 、

3( p

L) 」 と 呼ぶ 。

の ア ン ピ シ リ ン、 2 5

の カ ナ マイ シ ン 、 2
0 ・

の グ ル コ ー ス を含 む LB 培 地 ( 2 0 ) に て 、 7 0 3 の と き、 終濃度 が 最
mM

C で 培 養 した。培 養 液 の 0 6 0 が 0
s op o p y

にな る よ

う

に

T

「

ho

j

a

a c o s de)

を培 地 に添 加 し、さ ら に 5 時 間培 養 した。培 養 後 、培 養 物 を遠 心 分 離 ( 8 0 0 p 0

「

0

分 ,4
含む

) に供 す る こ と で集 菌 し、 菌 体 を 開始 バ ッフ ァー ( 5
) X リ ン 酸 バ ツ フ ァー (pH7 0 ) に懸 濁 した。
0 5 秒 、o ・

da z o e を

次 いで 、 超 音 波 破 砕 ( o

秒

o

0秒 、 o

: 0秒 、 計 0分 ) に供

した後 、 さ ら に遠 心 分 離
は

2

p

0分 、4 で) に供
り 抽 出 した h

した。 得 られ た上 清 を 0 4 5 ・
タ ンパ ク 質 の 精 製 は 、

フ ィル タ ー に て濾 過 した。 過 に よ 濾

E

ヘ ル ス ケ ア バ イ オ サ イ ェン ス 社 の

H

T ap

カ ラ ム 精 製 の 定 法 に従 い行 った。

精 製 した h A W
透 析 し、 h

m タ ンパ ク 質 溶 液 を 2 0

) の リ ン酸 バ ッフ ァー (PH 7 0 で さ ら に

タ ン パ ク 質 溶 液 を調 製 した。

く

の

夫 端 側 活 性 ドメ イ ン の 調 整 ノ

L ェン ド プ チ ダ ペ

ゼド 』・

メ イ ン ( 第 343
c

番 目か ら終 止 コ ドン お よ び
3

84 bp

の転

写 終 結 様 配 列 を含 む) に相 当 す る
BF

0

遺伝子の

末端

DN

配 列 を、 プ ラ イ マー
K

E

( gc g o

a

ccga a ggcgcga

cagcg a

配列番 号 6 2 ) 及 び

E

(gcgcg

g accgctcaacac
N

a

aaa

配 列番 号 6 3 ) を用 いて 、枯 草 菌

68

株か

ら抽 出 した ゲ ノ ム
BF

を 鋳 型 と し、 P

に て 増 幅 した。 な お 、 上 記 プ ラ イ マ ー
及 び Kp

E 及び K

E に お け る 下 線 の塩 基 配 列 は 、そ れ ぞ れ B a

制限

酵 素 認 識 配 列 を示 す。
得 られ た P
産 物 を用 いて 、上記 く
ミ
w

S

の

末 端 側 活 性 ドメ イ ン の調 整 ノ と 同
E E

様 な 方 法 に よ って プ ラ ス
(p E E)

ドp E
3
P E

E

を作 製 し、 p
E)

を導 入 した 大 腸 菌
Sの

3

を得 た。 得 ら れ た

を用 いて 、上 記 く
s

末端側活性 ド

メ イ ン の 調 整 ノ と 同様 な 方 法 に よ って 同様 に して 6

w

タ ンパ ク 質 溶 液 を

調 製 した。

く
D

ddH

の

夫 端 側 活 性 ドメ イ ン の 調 整 ノ

翻 訳 領 域 を含 む) に相 当 す る
(

卜

ペ エ ン ド プ チ ダ 一ゼ

・ドメ イ ン ( 第
ddH

20 6

番 目か ら 終 止 コ ドン お よ び
N

gbp

の非
H
DDH

遺伝子の ダ 末端
g

配 列 を、 ラ イ マ ーB F プ

gc g c g

a

c c ga

ca

ga aa cgg ca

配列番号 6

4)

及び

K

(g cgc gg a c c ca c c c a

a

aa
と

cg

配 列 番 号 6 5 ) を 用 いて 、枯 草 菌 6 8 株 か
R

ら抽 出 した ゲ ノ ム
BF

DN

を鋳 型

し、 P

に て 増 幅 した 。 な お 、 上 記 プ ラ イ マ ー
H

H 及び

K

H

にお け る 下線 の塩 基 配 列 は 、そ れ ぞ れ B a

及 び Kp

制限

酵 素 認 識 配 列 を示 す。
得 られ た P
産 物 を用 いて 、上 記 く
ミ
w

の

末 端 側 活 性 ドメ イ ン の調 整 ノ と 同
E H

様 な 方 法 に よ って プ ラ ス
(p E H)

ドp
3( P

ED H
E H

を作 製 し、 P

を 導 入 した 大 腸 菌

3

を得 た。 得 ら れ た

を 用 いて 、 上 記 く

の

末端側活性 ド

メ イ ン の調 整 ノ と 同様 な 方 法 に よ って 同様 に して 6 H s

d dH タ ン パ ク 質 溶 液 を

調 製 した。

く細 胞 壁 溶 解 活 性 を測 定 及 び結 果 ノ
細 胞 壁 溶 解 活 性 の測 定 は 、 実 施 例
2

に記 載 した方 法 に準 じて行 った。 な お 、 本
s

実 施 例 で は、h
ンパ ク 質 に対 して
H

タ ンパ ク 質 、 6 H

タ ンパ ク 質 又 は

6H

s

d dH タ
S

o e B タ ン パ ク 質 を 2 倍 の モ ル 比 で 加 え た。

タ ンパ ク

質 に よ る 細 胞 壁 溶 解 活 性 を測 定 した結 果 を 図 4 に示 し、
胞 壁 溶 解 活 性 を測 定 した結 果 を 図 5

タ ンパ ク 質 に よ る 細

示 し、

dH

タ ンパ ク 質 に よ る 細 胞 壁 溶 解 活

性 を測 定 した 結 果 を 図 6 に示 す。
図4

~
6
ddH

に示 す よ

う

に、

oeB

タ ンパ ク 質 は 、

タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク

質及 び

タ ン パ ク 質 と い った溶 菌 酵 素 に お け る 細 胞 壁 溶 解 活 性 も 抑 制 で き る
oeB

こ と が 明 ら か に な った。特 に 、 2 倍 の モ ル 比 で

タ ン パ ク 質 を作 用 さ せ る こ と
0 0

に よ って 、 こ れ ら溶 菌 酵 素 の 細 胞 壁 溶 解 活 性 は ほ ぼ
と な った。

阻害 さ れ る こ と が 明 か

実施例 4

溶 菌 酵 素 活 性 に対 す る

。

eB

タ ンパ ク 質 の 抑 制 作 用

3
D

本 実 施 例 で は 、 8 種 類 の 分 泌 型 プ ロ テ ア 一 ゼ を欠 損 す る 枯 草 菌 変 異 株
e

p

「

8

(A

p

Wp

mp

np B

bp

Dp E

Vp

ap E において 、

oeB

タ ンパ ク

質 を過 剰 に発 現 さ せた場 合 に お け る 溶 菌 抑 制 効 果 を 検 討 した。 な お 、 D p 8 株 は 、
既 知 分 泌 型 プ ロ テ ア 一ゼ
8

種 類 を欠 失 して い る た め 野 生 型 と 比 較 して溶 菌 しやす

い と いった 特 徴 を有 して い る 。
p
8 「 株 は以 下 の

よ

う

D に構 築 した。 p

8 「 株 の構 築 に 際 して使 用 した プ ラ イ マ ー の

一覧 を表

2

に示 す。

ま た 、 各 遺 伝 子 の欠 損 用 に使 用 した プ ラ イ マ ー を表 3 に纏 め た。

表3

先 ず 、 生 型 で あ る 枯 草 菌 6 8 株 か ら e p 遺 伝 子 を欠 損 さ せ る 方 法 を説 明 す る 。 野
枯 草 菌 6 8 株 か ら抽 出 した ゲ ノ ム D N を鋳 型 と し、 2 に示 した e p 表
及び ep
と ep

Up 、

N

と ep

v

ep

の 各 プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 用 いて 、 ノ ム 上 の e p 遺 伝 子 ゲ
、及 び 下 流 に 隣接 す る 0 ,5 k b 断 片 (B) を そ れ ぞ

の上 流 に 隣接 す る 0 6 k b 断片 ( ・

れ調 製 した。 ま た別 途 プ ラ ス

ミ

ドp

94 ( J

Ba c e

o
ミ

0 () 2

8 5 ( 982) )
0( P a s
es
く

由 来 の ク ロ ラ ム フ ェニ コ ー ル 耐 性 遺 伝 子 の 上流 に プ ラ ス
93

ドp UB
c ds

5

( 9 8 6 ) ) 由 来 の ep 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 領 域

(N

cec

7

44 0

( 9 8 9 ) を連 結 した ・ k b 断 片 ( ) を調 製 した。 次 に 、 得 ら れ た 2

() () 3 B
E

断 片 を混 合 して鋳 型 と し、表 2 の プ ラ イ マ ー e p
行
ぅ こ と によ

2と

v2 を用 いた S

P

を

って 、3 断 片 を

()

( ) ( ) の 順 に な る 様 に結 合 さ せ、2 ・ k b の D N B 2
5

断 片 を得 た。こ の D N 断 片 の 末 端 を平 滑 化 及 び
( e hods Enzy

リ

ン酸 化 し、 ラ ス プ

ミ

ドp U

8

" 「・
ドp U

53

3 ( 987) ) の
8

"

制 限酵 素 部 位 に挿 入 して 。 遺 伝 子 p
2 ・ kb

欠 失用 プ ラ ス

ミ

m

p

を構 築 した。 な お、 上記

) 断片 ( 0 は 、

C のプ ライ マ ー セ ッ ト ( 表 2 ) 及 び鋳 型 と して プ ラ ス ミ ドp UB 0 托U を 用 いて調 製 した epU遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー 領 域 を含 む 0 4 k b 断 片 ( ) と 、 U ep ・

eU

と

と

v

の プ ラ イ マ ー セ ッ ト及 び鋳 型 と して プ ラ ス

ミ

ドp

9 4 を用 いて 調 製 した
と を混 合

ク ロラム

フ ェニ コ ー ル 耐 性 遺 伝 子 を含 む 0 8 k b 断 片 (E) ・
と

して鋳 型 と し、

表2

Z

示 した プ ラ イ マ ー epU

v

を 用 いた

E

P

を行 な ぅ こ と に よ って

調 製 した。
次 に 、 上 述 の よ ぅ に作 製 した e p
コ ン ピ テ ン トセ ル 形 質 転 換 法 ( J

遺 伝 子欠 失 用 プ ラ ス
Ba c e
o

ミ

ドp U

8

p

を

93

925

( 9 6 7 ) ) に よ って枯 草 菌

6 8 株 に導 入 し

重 交 差 の相 同組 換 え に よ
コ ー ル 耐 性 を指 標

「 ・

。 p

遺 伝 子 上流 領 域 、 或 いは 下流 領 域 の相 当 す る 領 域 間 で の
りゲノ ム

N

と融合

した形 質 転 換 株 を 、 ク ロ ラ ム フ ェニ

に取 得 した。得 られ た形 質 転 換 株 を L B 培 地 に接 種 し、
う

C にて

2 時 間培 養 後 、 再 度 、 コ ン ピ テ ン ス 誘 導 操 作 を行

こ と に よ り 、 ゲ ノ ム 上 で重 複

して 存 在 す る 。 遺 伝 子 上 流 領 域 、 或 い ほ 下 流 領 域 の 間 に お け る ゲ ノ ム 内相 同組 p
換 え を誘 導 した。 プ ラ ス
こ った 場 合 に は 、 プ ラ ス
pU
8
ミ ミ

ド 入 の 際 と 異 な る 領 域 で 、 ゲ ノ ム 内相 同組 換 え が 起 導

ドに 由 来 す る ク ロ ラ ム フ ェニ コ ー ル 耐 性 遺 伝 子 及 び

ベ ク タ ー 領 域 の脱 落 に伴 って e p 遺 伝 子 が 欠 失 す る こ と に な る 。 次 に 、 ク

ロ ラ ム フ ェニ コ ー ル 感 受 性 と な った株 の 存 在 比 率 を 高 め る 為 、 以 下 の 要 領 で ア ン

ピ シ リ ン 濃 縮 操 作 を行 な った。 コ ン ピ テ ン トセ ル 誘 導 後 の培 養 液 を 終 濃 度

pp

の ク ロ ラ ム フ ェニ コ ー ル 及 び終 濃 度
培地
L に 60 0

pp

の ア ン ピ シ リ ンナ

ト リ ウム

を含 む

にお け る 濁 度 (
0

) が 0 0 3 に な る よ ぅ に接 種 した。 3 7 ・0

Cに

て

5

時 間培 養 後 、

pp

の ア ン ピ シ リ ンナ ト リ ヴ ム 水 溶 液 を 0

添 加 して

更 に 3 時 間培 養 した。 培 養 終 了後 、 2 塩 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 に て 菌 体 を遠 心 洗 浄

した後 、

L の 2 塩 化 ナ ト リ ヴ ム 水 溶 液 に懸 濁 し、 懸 濁 液

0 0 ば L を LB 寒 天 培 地

に塗 洙 した。3 7 C にて約 5 時 間 イ ン キ ュベ ー シ ョ ン し、生 育 した 菌 株 の ぅ ち、プ
ラス
ミ

ド 域 の 脱 落 に伴 って ク ロ ラ ム フ ェニ コ ー ル 感 受 性 と な った も の を選 抜 し 領
N

た 。 選 抜 した 菌 株 の ゲ ノ ム
ep

を 鋳 型 と し、 表 2
ぅ こ と によ り ep

示 「 すプ ラ イ マ

p

と

v

ep

を 用 いた P

を行 な

遺 伝 子 欠 失 の確 認 を行 な い、e p

遺 伝 子 欠 失 株 を取 得 した。
次 に 、得 られ た e p
ep

遺 「 伝 子欠 失株 に対 し、次 の 欠 失

と

して p

遺 伝 子 の欠 失 を 遺 伝 子欠 失 用 プ ラ
N

遺 「 伝 子欠 失
ミ

と 同様
ム

に行 な った。 す な わ ち、 同様 に して w p
p 仏 を構 築 し、 築 した プ ラ ス 構
ミ

ス

ドp U
く

8

ドの ゲ ノ ム

へ の導 入 と
遺伝子 と

そ れ に続
p

ゲ ノ ム 内相 同 組 換 え に よ る

p

遺 伝 子 の欠 失 に よ

り ep

「 遺 伝 子 の 2 重 欠 失株 を取 得 した。以 降 同様 の操 作 を繰
p

り 返 すこ と に よ り 、 p

np B bp

E

Vp

a

E の各 遺 伝 子 を順 次 欠 失 さ せ、 最 終 的 に 8 種 類 の プ ロ

テ ア 一ゼ 遺 伝 子 が 欠 失 した プ ロ テ ア 一ゼ 8 重 欠 失 株 を構 築 し、 p

8 株 と 命 名 した。

一方 、 p 「 株 に導 入 す る y 。 大 量 発 現 用 プ ラ ス 8 eB
作 製 し た 。 先 ず 、 yoeB
TTT T TT

ミ

ドp

4 8 B は以 下 の よ ぅ に
oeBSa

遺伝子増 幅用 プ ラ イマ

F2 ( 5
(

( 列番 号 配
53)

52)

及 び yoeBSp h

T

TT T T
と

T

T

TT

( 列番 号 配

を用 い て 枯 草 菌 野 生 株 染 色
及 び ph

体N

を鋳 型

して P

幅 した。 得 られ た増 幅 断 片 (595 bp ) を a

で 制 限 酵 素 処 理 した。 こ の 断 片 を 、 同様 に S a
ラ

及 び p h で 制 限 酵 素 処 理 した プ

ク ミ ドp U

8 に ラ イ ゲ ー シ ョ ン し、p 8 B を得 た。 挿 入 断 片 の塩 基 配 列 を確 認、

後 、p 8 B を a

及 び p h で 制 限酵 素 処 理 した。 切
及 び ph

り 出 さ れた

yoeB 遺 伝 子 断 片

(575 bp ) を 、 同様 に a
ン し、 目的 と す る p

で 制 限 酵 素 処 理 した p
48 は、 P T

48 に ラ イ ゲー シ ョ

4 8 B を 得 た。 な お 、 p

によ

り 発 現誘 導 さ れ

る プ ロ モ ー タ ー を有 す る マ ル チ コ ピ ー プ ラ ス
e

ミ

で Bac ド あ り、

us

e

ne

c

ock

e か ら入 手 す る こ と が で き る 。
以 上 の よ ぅ に作 製 した D
48 B を p

8 株 に導 入 し、 以 下 の 実 験 を行 な った。
60 0

前培 養 は 邱 培 地 で
7 ,5

o

C

時 間 培 養 した。 培 養 液 前

を 7・ 5

マル トー ス 、
X

g

n 0 お よ び 0は g m の カ ナ マ イ シ ン を含 む 3 0m

の2

培 地 添 加 し、

本 培 養 を 開 始 した。 yoeB の 大 量 発 現 を誘 導 す る た め 、 培 養 開 始 0 8 、 2 0 時 間 後 、

に そ れ ぞ れ終 濃 度

m

と な る よ ぅ に本 培 養 液 に P

を添 加 した。 ま た

PT

を加

え な いサ ン プ ル を コ ン ト ロ ー ル と した。 0 。0 に て 培 養 液 濁 度 を経 時 的 に測 定 し、 。

溶 菌 抑 制 効 果 を検 討 した。
結 果 を 図 7 に示 す。図 7 か ら 判 る よ
ぅ に、 P

を加 え な いサ ン プ ル において ほ 、

培 養 開 始 3 0時 間 を超 え た あ た り か ら濁 度 の減 少 、 す な わ ち p
さ れ た。 こ れ に対

8 株 の溶 菌 が 観 察

して 、

PT

添 加 に よ って

oeB

タ ンパ ク 質 を 大 量 に発 現 さ せ た

サ ン プ ル に お いて ほ 、 養 開 始 3 0 時 間 を超 え て も 濁 度 の減 少 は観 察 さ れ な か った。 培
B こ れ に よ り 、 № 。 タ ン パ ク 質 を 大 量 発 現 した
Dp

8 株 にお い て は 、 溶 菌 が 抑 制 さ

れ て い る こ と が 明 か と な った。
(実施例 5 )
oeB

タ ンパ ク 質 に お け る
oeB

P

分解 抑制 活 性
)

本 実 施 例 で ほ、

遺伝子 (
P

列番 号

によ

り コー

ドさ れ る

oeB

タ ンパ ク

質 ( 配 列番 号 2 ) に よ る
の分 子量 を も つ P

分 解 抑 制 効 果 を検 討 した。 具 体 的 に は 、 所 定 の 範 囲
の分 解 ( 低 分

に対 して 各 種 溶 菌 酵 素 を作 用 さ せた と き の P

子化 ) を 、

。 。 タ ンパ ク 質 の 存 在 下 或 い は 非 存 在 下 で 比 較 した。 な お、 本 実 施 例 B
oeB

で使 用 した各 種 溶 菌 酵 素 及 び を用 い た。
ま た 、本 実 施 例 に お い て 、P

タ ンパ ク 質 は 、 施 例 2 及 び 3 で 使 用 した も の 実

と

して は 、平 均 分 子 量 が 4 , 0

ka

60 ~,

k aで

あ る製 品 ( 和 光
リ

No

68

243
) 0

を用 いた。 P

の分解 反 応 は 、
2g

リ

ン酸 ナ ト
oeB

クムバ

ッフ ァー

(pH7

中で n o

の溶 菌 酵 素 と
と

の
37

P

を用 い た。
と

タ ン パ ク 質 を添 加 す る 場 合 に は 2 n mo

した。 反 応 温 度 は

C

した。 所 定 の反

応 時 間 が 経 過 した後 、 0 C で 5 分 間煮 沸 す る こ と に よ って反 応 を停 止 した。反 応 0 停 止 後 のサ ンプル を
4

ボ

リ ア ク リルア ミ

ドゲ ル を用 いた 電 気 泳 動 に供 し、

メ チ レ ン ブル ー 染 色 に よ り P

の 分 解 を確 認 した。

詳 細 に、

E

タ ン パ ク 質 について ほ 、下 記 表
P

4

に示 す組 成 の 反 応 溶 液 を調 整 し

た。
表
4

E

タ ンパ ク 質 に よ る

分 解 活 性 を検 討 した結 果 を 図 8 に示 す。

サ ンプ ル N
P

2

00

p2

H H
B
To

s s

E o eB
e
a

g

00

2

00

口 口
1

2

一

23

p

mo

)

23
8
400

n nm

O

一
300
400

一

96 p
u

2

o)

y

p 400 p
277

F

タ ンパ ク 質 について は 、下 記 表
P

5

に示 す組 成 の反 応 溶 液 を調 整 した。

W

F

タ ンパ ク 質 に よ る

分 解 活 性 を検 討 した結 果 を 図 9 に示 す。

表

5
2
3

サ ンプル N
P

00

2

H H B
To

s s

F o eB
e
a

g)

00

p2
n

m

g
o

00

2
廿

一 一 300

63

63
46

(

一
237
400

2

g o
n

O

)

9
p
400

p
p

400

S

タ ン パ ク 質 に つ い て は 、下 記 表
P

6

に示 す組 成 の反 応 溶 液 を調 整 した。

S

タ ンパ ク 質 に よ る

分 解 活 性 を検 討 した結 果 を 図

0に示 す。

表

6
N
2
3

サ ンプル
P

00

p2

a

H H
B
To

s

s

S oeB
e
a

g

00

2

mg )

00

P
u
(

m

g)
o

一
一

40

口1 (

mo )

40
46

n

一
廿

n
廿

300
400

p 400 p
260

400 p

タ ンパ ク 質 に つ い て は 、 下 記 表 タ ンパ ク 質 に よ る
P

7

に示 す組 成 の反 応 溶 液 を調 整 した。
ェ

w

分 解 活 性 を検 討 した結 果 を 図 ェ

に示 す。

表

7

サ ンプル N
3

(

00
3

(
n

00

me

s
e

o)

3

a
mo

46
00

e
To a

287
400

4

400

400

な お 、 図 9 に おいて 、 レー ン

は サ ン プ ル No ・ェ の反 応 溶 液 で あ り 、 レー ン 2

~5 は反 応 時 間 を そ れ ぞ れ 0・5 時 間 、 ・0時 間 、2 ・0時 間及 び 4 ・0時 間 と したサ ン プ ル No ・ の 反 応 溶 液 で あ り 、 レー ン 6 ~ 0は反 応 時 間 を そ れ ぞ れ 0時 間 、 0 5 2 ・
0 時 間 、 ・ 時 間 、 2 ・ 時 間及 び 4 ・ 時 間 と した サ ン プ ル N 0 0

3 ・

の反 応 溶 液 で あ る 。

ま た、 図

0~

に おいて 、 レー ン

ェ

は サ ン プ ル N。ェ の反 応 溶 液 で あ り 、 レ ・

ーン 2

6 ~ は反 応 時 間 を そ れ ぞ れ 0・5 時 間 、 ・0時 間 、2 ・0時 間 、4 ・0時 間及 び 6 ・0 時 間 と した サ ン プ ル No ・ の反 応 溶 液 で あ り 、 ー ン 7 ~ 2 は反 応 時 間 を そ れ ぞ 2 レ
0 0 0 0 ・ 時 間 、 2 ・ 時 間 、 4 ・ 時 間 及 び 6 ・ 時 間 と した サ ン プ ル

れ 0時 間 、 0 5 時 間 、 ・

3 N ・ の反 応 溶 液 で あ る 。

図9
質、

~

に示 す よ

ぅ に、

oeB タ ン パ ク 質 の 非 存 在 下 に おいて 、

E タ ンパ ク
を分 解

F タ ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 及 び

0 タ ンパ ク 質 は 、 全 て P
w

して低 分 子化 す る 活 性 を有 す る こ と が 判 る 。 ま た 、 こ れ ら
タ ンパ ク 質 、 w S タ ンパ ク 質 及 び

E タ ンパ ク 質 、

F

タ ンパ ク 質 に お け る P

分 解 活 性 は 、 oeB

タ ン パ ク 質 の 存 在 下 に お いて 阻 害 さ れ 、 P

は 分 解 さ れず所 定 範 囲 の 分 子 量 を維
り、

持 す る こ と が 明 ら か と な った。 本 実 施 例 に よ

。 。 タ ンパ ク 質 に は 、 溶 菌 酵 素 B

によ る

P

分 解 活 性 を抑 制 す る 新 規 な 作 用 が あ る こ と が 明 ら か と な った。
の 分 解 活 性 を有 す る

ま た 、 比 較 の た め 、 細 胞 壁 の 分 解 活 性 を有 しな いが 、 P

こ と が 知 られて い る

タ ンパ ク 質 につい て も 、 oeB タ ン パ ク 質 に よ る P

分

解 抑 制 効 果 が み られ る か検 討 した。

遺 伝 子 の 塩 基 配 列 を配 列 番 号 6 6 に 示 し

D タ ンパ ク 質 の ア

ミ

ノ 酸 配 列 を配 列 番 号

6 7 に示 した。
の 末 端 側 活 性 ドメ イ ン の 調 整

タ ン パ ク 質 に つ いて は 、 施 例 実

3 のく

ノ と 同様 な 方 法 に よ って 取 得 した。 す な わ ち、

L ェン ド プ チ ダ 一ゼ ・ メ イ ン ペ ド
L
F

を含 む

D

遺伝子の

DN

配列を、プライマ一

( gc g c g acC a aca ca cagaa ga g

列番号 6 8

及び

v

(g

。 。。 c a 9

a

g

。。 g 。
"
N

""

。

C

配 列番 号

6

9 ) を用 いて 、 枯 草 菌

68

株か

ら 抽 出 した ゲ ノ ム

を鋳 型 と し、 P

に て 増 幅 した 。 な お 、 上 記 プ ラ イ マ ー
及びP s

FL F 及 び

FL v に お け る 下 線 の塩 基 配 列 は 、 れ ぞ れ K p そ

制 限 酵 素 認 識 配 列 を示 す。

得 られ た P

産 物 を用 いて 、上 記 く
ミ

S

の

末 端 側 活 性 ド イ ン の調 整 ノ と 同 メ
E
)

様 な 方 法 に よ って プ ラ ス
M

ドp

E

D

を 作 製 し、 p
3 (p

を 導 入 した 大 腸 菌 を 用 いて 、上記 く
タ ンパ

3

( P

EP4

P

E

)

を 得 た。 得 ら れ た M

EP4

p

E

の C 末 端 側 活 性 ドメ イ ン の 調 整 ノ と 同様 な 方 法 に よ って 同様 に して h
ク 質 溶 液 を調 製
8

した。得 ら れ た

D

タ ン パ ク 質 を 用 いた P

分 解 反 応 は 、下記 表

に示 す組 成 の反 応 溶 液 を調 整 して 、 上 述 した方 法 と 同様 に して 行 った。
8

表
P

サ ンプル N
00 口 (2
m

2

3
00

H H

s
s

D

g
一
223
口

mg

p

2
2n
o

一 一

o eB
e
a

96
27

B
To

300

40 u 0

40 口 0

40 0

そ の結 果 を 図

2 に示 す。 な お 図

2 において レー ン ェ は サ ン プ ル

No , ェ

の反

応 溶 液 で あ り 、 レー ン 2
及び
4 ,0

~5

牡 反 応 時 間 を そ れ ぞ れ 0 5 時 間 、 ・ 時 間 、2 ・ 時 間 0 0 ・
No ・ 2

時 間 と した サ ン プ ル

の反 応 溶 液 で あ り 、 ー ン 6 レ

~

反応 時間
N
3 ・

を そ れ ぞ れ 0 時 間 、 ・ 時 間 、 ・ 時 間 、 ・ 時 間及 び 4 ・ 時 間 と したサ ン プ ル 05 0 20 0

の反 応 溶 液 で あ る 。 図

2 か ら判 る よ

ぅ に、 o e
P

タ ンパ ク 質 の 存 在 下 及 び 非 存 在

下 の いず れ に おいて も 、

タ ンパ ク 質 に よ る

分 解 活 性 に変 化 は 見 ら れ な か
P

った。 すな わ ち、

oeB

タ ンパ ク 質 は 、

タ ンパ ク 質 に お け る

分解 活 性 を阻

害 しな い こ と が 明 ら か と な った。
以 上 の結 果 か ら 、
P

。B タ ンパ ク 質 は 、細 胞 壁 溶 解 活 性 を有 す る 溶 菌 酵 素 に よ る 。
分解 酵 素 に よ る
P

分 解 活 性 を 阻 害 し、 細 胞 壁 溶 解 活 性 を 有 しな い P

分解

活 性 を 阻 害 しな い こ と が 明 ら か と な った。

産 業 上 の利 用 可能 性

本 発 明 に よ れ ば 、 例 え ぼ 枯 草 菌 由 来 の溶 菌 酵 素 の活 性 を効 果 的 に抑 制 す る こ と
が で き る 新 規 な 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 、 及 び 、 例 え ぼ 枯 草 菌 の 溶 菌 を抑 制 す る こ と が で

き る 溶 菌 抑 制 剤 を提 供 す る こ と が で き る 。 す な わ ち、 本 発 明 に係 る 溶 菌 酵 素 阻 害

剤 は 、 枯 草 菌 由 来 の溶 菌 酵 素 を は じ め と して 、 各 種 の溶 菌 酵 素 の溶 菌 活 性 を 阻 害

す る こ と が で き る 。 ま た 、 本 発 明 に係 る 溶 菌 抑 制 剤 は 、 枯 草 菌 を は じ め と して各
種 の微 生 物 の溶 菌 を抑 制 す る こ と が で き る 。
ま た 、 本 発 明 に よ れ ば 、 溶 菌 酵 素 の 作 用 に よ る 溶 菌 が 抑 制 さ れ た微 生 物 を提 供

す る こ と が で き る 。 本 発 明 に係 る 微 生 物 に よ れ ば 、 溶 菌 が 抑 制 さ れ て い る た め 、
例 え ぼ 物 質 生 産 の 宿 主 と して使 用 す る こ と に よ って 当 該 物 質 の 生 産 性 を 向上 さ せ
る こ と が で き る。
さ ら に、 本 発 明 に よ れば 、 溶 菌 酵 素 の作 用 に よ る P

の 分 解 を抑 制 す る P
と比較

の

分 解 抑 制 剤 を提 供 す る こ と が で き る 。 ま た 、 本 発 明 に よ れ ば 、 野 生 株

して

高分 子量 の P

を製 造 す る 方 法 を提 供 す る こ と が で き る 。

本 明 細 書 で 引用 した全 て の 刊 行 物 、 特 許 お よ び 特 許 出願 を そ の ま ま 参 考 と して
本 明細 書 に と
り 入れ る も の と す る 。

請 求 の範 囲

・
よ り コー

枯 草 菌 由 来 の oeB 遺 伝 子 又 は 当 該 oeB 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同 遺 伝 子 に

ドさ れ る oeB タ ン パ ク 質 を 主 成 分 と す る 、 溶 菌 酵 素 阻 害 剤 。

2

・

上記 oeB タ ンパ ク 質 は 以 下 の ( a ) 乃 至 ( c ) いずれ か に記 載 の タ ンパ
載 の溶 菌 酵 素 阻 害 剤 。

ク 質 で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項

( a ) 配 列 番 号 2 に示 すア ミ ( b ) 配 列 番 号 2 に示 すア ミ
失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 に お いて
ミ

又 は数 個 の ア ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の 溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 制 す る 活 性 を 有 す る タ ンパ ク 質

( c ) 配 列 番 号 2 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 。 上 の 相 同性 を有 す る ア 以

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活

性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

3

・

枯 草 菌 由来 の

E タ ンパ ク 質 、

F タ ンパ ク 質 、

Sタ

ンパ ク 質 、

タ ンパ ク 質 、 ddH タ ンパ ク 質 及 び前 記 タ ンパ ク 質 と機 能 的 に等 価 な タ ンパ ク 質 か
ら な る 群 か ら 選 ぼ れ る 少 な く と も 一種 の溶 菌 酵 素 の溶 菌 活 性 を 阻 害 す る こ と を特

徴 と する 請 求 項

ェ

又 は 2 E 載 の 溶 菌 酵 素 阻 害剤 。
乃至 ( c

4

・

上記

E タ ンパ ク 質 は ( a

いずれ か に記 載 の タ ンパ ク 質 で

あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項 3 記 載 の溶 菌 酵 素 阻 害剤 。

(a

m 列 番 号 4 に示 すア ミ ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質
示 すア
ミ

( b ) 配 列番 号

ノ 酸 配 列 に お いて
ミ

ェ

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア
性 を有 す る タ ン パ ク 質

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活

(c

配 列 番 号 4 に示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の相 同性 を有 す る ア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の細 胞 壁

を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

5・

上記

F タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質 で

あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 3 記 載 の溶 菌 酵 素 阻 害 剤 。

(a ) (b )

列番 号 6 に示 すア ミ 列番 号 6 に示 すア
ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 に お いて

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア
性 を有 す る タ ンパ ク 質

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活

( c ) 配 列番 号 6 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 。 上 の相 同性 を有 す る ア 以

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

6

・

上記

タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ン パ ク 質 で

あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項 3 記 載 の溶 菌 酵 素 阻 害剤 。

( a ) 配 列番 号 5 5 に示 すア ( b ) 配 列番 号 5 5 に示 すア

ミ ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 にお い て
ミ
ェ

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、

欠 失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

(c )
ミ

番 号 5 5 に示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を有 す る ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

7・

ア

C

0 タ ンパ ク 質 は ( a

乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質 で

あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 3 E 載 の 溶 菌 酵 素 阻 害剤 。

( a ) 配 列番 号 5 7 に示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 に お いて
ミ
ェ

( b ) 配 列番 号 5 7 に示 すア ミ
欠 失 、 付 加 或 い ほ挿 入 さ れ た ア 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

又 は数 個 の ア ミ

ノ 酸 が 置換 、

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

( c ) 配 列 番 号 5 7 に示 す ア
ミ

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 。 上 の 相 同性 を有 す る ア 以

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

8

・

上記 ddH タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質 で

あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項 3 記 載 の 溶 菌 酵 素 阻 害剤 。

( a ) 配 列番 号 5 9 に示 すア
( b ) 配 列番 号 5 9 に示 すア

ミ ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質
ノ 酸 配 列 にお い て
ミ
ェ

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、

欠 失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

( c ) 配 列番 号 5 9 に示 すア
ミ

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同 性 を有 す る ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質

9・

桔 草 菌 由 来 の o e 遺 伝 子 又 は 当 該 oeB 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同遺 伝 子 に

よ り コー

ドさ れ る oeB タ ン パ ク 質 を主 成 分 と す る 、 溶 菌 抑 制 剤 。

0・

上 記 oeB タ ン パ ク 質 は 以 下 の ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ン

パ ク 質 で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項 9 記 載 の 溶 菌 抑 制 剤 。

( a ) 配 列番 号 2 に示 すア ミ ( b ) 配 列番 号 2 に示 すア ミ
失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質

ノ 酸 配 列 にお い て
ミ

ェ

又 は数 個 の ア ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 制 す る 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質

( c ) 配 列番 号 2 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 。 上 の相 同性 を有 す る ア 以

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の 溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活

性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質
ェェ

・

枯 草 菌 の溶 菌 を抑 制 す る こ と を特 徴 と す る 請 求 項 9 又 は

0記 載 の 溶

菌抑制剤。

2・

上記 枯 草 菌 は 、 少 な く

とも

ェ

種 以 上 の 分 泌 型 プ ロ テ ア 一ゼ を欠 損 した

変 異 株 で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項

ェェ

記 載 の溶 菌 抑 制 剤 。

3・
によ
り コー

枯 草 菌 由 来 の o e B 遺 伝 子 又 は 当 該 oeB 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同遺 伝 子

ドさ れ る oeB タ ンパ ク 質 を 主 成 分 と す る 、 リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン ボ

酸 の分 解 抑 制 剤 。

4 ・ 上記
分 解 抑 制剤 。

oeB タ ン パ ク 質 は 以 下 の ( a ) 乃 至 ( c ) いずれ か に記 載 の タ ン

パ ク 質 で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項

3 記 載 の ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸 の

( a ) 配 列 番 号 2 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 に お いて
ミ

( b ) 配 列 番 号 2 に示 すア ミ
失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

( c ) 配 列番 号 2 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の相 同性 を 有 す る ア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の 溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活

性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

5・

上 記 oeB タ ンパ ク 質 に よ って 、 枯 草 菌 由 来 の
タ ンパ ク 質 、

E タ ンパ ク 質 、

F

タ ンパ ク 質 、

0 タ ン パ ク 質 及 び前 記 タ ンパ ク 質 と 機 能 的 に等

価 な タ ンパ ク 質 か ら な る 群 か ら 選 ぼ れ る 少 な く と も 一種 の溶 菌 酵 素 の溶 菌 活 性 を

阻 害 す る こ と で 、 ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン 酸 の 分 解 を抑 制 す る こ と を特 徴 と す
る請 求項

3 又は
上記

4

S 載 の ボ リ ー ガ ンマ ー グ ル タ

ミ

ン酸 の 分 解 抑 制 剤 。

6

・

E タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c )

いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質

で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項
制剤。

5 記 載 の ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸 の 分 解 抑

( a ) 配 列番 号 4

示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質

( b ) 配 列 番 号 4 に示 すア ミ
失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア
性 を有 す る タ ン パ ク 質

ノ 酸 配 列 に お いて
ミ

又 は数 個 の ア ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活

(c

列番 号

Z 示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を有 す る ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質

7・

上記

F タ ン パ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質

で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項
制剤。

5 記 載 の ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸 の 分 解 抑

(a

配 列番 号 6 に示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質
ノ 酸 配 列 に お いて ェ 又 は数 個 の ア
ミ

( b ) 配 列 番 号 6 に示 す ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア ミ
性 を有 す る タ ン パ ク 質

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の細 胞 壁

を溶 解 す る 活

(c)

列 番 号 6 に示 す ア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を有 す る ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質

8・

上記

S タ ンパ ク 質 は

( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質

で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項
制剤。

5 3 載 の ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸 の 分 解 抑

( a ) 配 列 番 号 5 5 に示 すア (b
配 列番 号 5 5 に示 す ア

ミ
ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質

ノ 酸 配 列 に お いて
ミ

ュ

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、

欠 失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

(c

列番 号 5 5 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を有 す る ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質

・

上記

タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c )

いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質

で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項
制剤 。

5 記 載 の ボ リ ー ガ ンマ ー グ ル タ ミ ン酸 の 分 解 抑

( a ) 配 列番 号

7 に示 すア ミ
に示 すア
ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質

( b ) 配 列番 号

ノ 酸 配 列 に お いて
ミ

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、

欠 失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

(c)
ミ

列番 号

に示 す ア

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を 有 す る ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

g n・
9

枯 草 菌 由来 の

。 。 B B 。 遺 伝 子 又 は 当 該 。 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同遺 伝 子

を発 現 誘 導 型 プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に発 現 す る こ と で溶 菌 が 抑 制 さ れ た微 生 物 。
・

上記 neR 遺 伝 子 は 以 下 の ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ンパ ク

質 を コ ー ド る も の で あ る こ と を特 徴 と す る 請 求 項 2 0 載 の 微 生 物 。 す 記

( a ) S B列番 号 2 に示 す ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質
ノ 酸 配 列 にお い て
ェ

b ) 配 列 番 号 2 に示 すア ミ

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、 欠

失 、 付 加 或 い ほ挿 入 さ れ た ア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の 溶 菌 酵 素 に結 合

し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活 性 を抑 制す る 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質
( c ) 配 列 番 号 2 に示 す ア ミ
ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 。 上 の 相 同 性 を有 す る ア ミ 以
し、 当 該 溶 菌 酵 素 に よ る 溶 菌 活

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 由 来 の溶 菌 酵 素 に結 合

性 を抑 制 す る 活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

2 2・
又は 2
R
ェ

少なく とも

種 以 上 の 分 泌 型 プ ロ テ ア 一ゼ を欠 損 して い る 請 求 項 2 0

記 載 の微 生 物 。
・

枯 草 菌 由 来 の株 で あ る こ と を特 徴

と する請 求項

2 0乃 至 2 2 いず れ か

項 記 載 の微 生 物 。

9

・

ポ
R

リ ー ガン

マ ー グル タ

ミ

ン酸 産 生 能 を 有 す る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項

g n 乃至
,

いずれ か 項 記 載 の微 生 物 。
りコ

上 記 oeB 遺 伝 子 又 は 当 該 oeB 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同 遺 伝 子 に よ
E タ ンパ ク 質 、

ー ドさ れ る n R タ ンパ ク 質 に よ って 、枯 草 菌 由 来 の

F タン

パ ク質、

タ ンパ ク 質 、

0 タ ン パ ク 質 及 び前 記 タ ンパ ク 質 と 機 能 的 に等 価 な

タ ンパ ク 質 か ら な る 群 か ら 選 ば れ る 少 な く と も 一種 の溶 菌 酵 素 の 溶 菌 活 性 を 阻 害

す る こ と で 、 ポ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸 の低 分 子 化 を抑 制 す る こ と を特 徴 と す
る請 求項

2 4 E載 の 微 生 物 。
上記
E タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c )

2 6・

いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質

で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 2 5 記 載 の微 生 物 。

( a ) 配 列 番 号 4 に示 す ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質
ノ 酸 配 列 に おい て ェ 又 は数 個 の ア ミ ノ 酸 が 置 換 、 欠
ミ

( b ) 配 列番 号 4 に示 す ア ミ
失 、 付 加 或 い ほ挿 入 さ れ た ア
性 を有 す る タ ン パ ク 質

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の細 胞 壁 む 解 す る 活 溶

( c ) 配 列番 号 4 に示 すア

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の相 同性 を有 す る ア

ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

2 7・
(a )

上記

F タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c

いずれ か に記 載 の タ ンパ ク 質

で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 2 5 記 載 の微 生 物 。

列 番 号 6 に示 す ア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質

( b ) 配 列番 号 6 に示 す ア ミ

ノ 酸 配 列 に おい て
ミ

ェ

又 は数 個 の ア ミ ノ 酸 が 置 換 、 欠

失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア
性 を有 す る タ ン パ ク 質

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活

( c ) 配 列番 号 6 に示 す ア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の相 同性 を 有 す る ア ミ

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を有 す る タ ン パ ク 質

2 8・

上記

S タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c ) いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質

で あ る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項 2 5 記 載 の微 生 物 。

(a )

列番 号 5 5 に示 すア

ミ
ミ

ノ 酸 配 列 か らな る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 にお い て
ミ
ェ

( b ) 配 列番 号 5 5 に示 すア

又 は数 個 の ア

ミ

ノ 酸 が 置換 、

欠 失 、 付 加 或 いは挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

( c ) 配 列番 号 5 5 に示 すア
ミ

ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の 相 同性 を有 す る ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の細 胞 壁

を溶 解 す る 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質

29

ア

C

タ ンパ ク 質 は ( a ) 乃 至 ( c )

いず れ か に記 載 の タ ンパ ク 質

で あ る こ と を特 徴

とする請 求項

2 5 記 載 の微 生 物 。
ノ 酸 配 列 か ら な る タ ンパ ク 質 ノ 酸 配 列 において ェ 又 は数 個 の ア ミ ノ 酸 が 置 換 、
ミ

( a ) 配 列番 号

に示 すア

ミ
ミ

b

配 列番 号

に示 すア

欠 失 、 付 加 或 い は挿 入 さ れ た ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る

活 性 を有 す る タ ンパ ク 質

c ) 配 列番 号
ミ

7 に示 すア ミ

ノ 酸 配 列 に対

して 7 0 以 上 の相 同性 を有 す る ア

ノ 酸 配 列 か ら な り 、 枯 草 菌 の 細 胞 壁 を溶 解 す る 活 性 を 有 す る タ ン パ ク 質

n・

ポ リ ー ガ ンマ ー グル タ

ミ

ン酸 産 生 能 を 有 す る 微 生 物 を 、 枯 草 菌 由 来 の

遺 伝 子又 は 当 該

R 遺 伝 子 に対 応 す る 相 同遺 伝 子 に よ り コ ー

ドさ れ る oeB

タ ン パ ク 質 の 存 在 下 に培 養 し、 培 地 に産 生 さ れ た ポ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン 酸 を

回収 す る こ と を特 徴
R
・

と す る 、 ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン 酸 の製 造 方 法 。

上 記 ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸 は 、上 記 oeB タ ンパ ク 質 の 非 存 在 下
と比較

で 産 生 さ れ る ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸
とする請 求項
F

して 高 分 子 量 で あ る こ と を特 徴

記 0 載 の ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン 酸 の製 造 方 法 。

2・

上記 微 生 物 は 、 請 求 項 2 4 乃 至 2 9 いず れ か

項 記 載 の微 生 物 で あ る

こ と を特 徴 と す る 請 求 項

0又 は 3

載 の ポ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸 の製 造

方 法。
R
・

上記 o

タ ン パ ク 質 を培 地 低添 加 す る こ と を 特 徴 と す る 請 求 項

30 乃

至3

2

いず れ か ェ 項 記 載 の ボ リ ー ガ ン マ ー グ ル タ ミ ン酸 の製 造 方 法 。

INTERNATIONAL SEARCH REPORT
A.

International application No.

PCT/JP2007/070513
CLASSIFICATION OF SUBJECT MATTER C12N9/99(2006 .01) i , C12N1/04 (2006 .01) i , C12N1/06 (2006 (2006. 01)i, C12N15/09(2006 .01) i , C12P21/00 (2006 .01) i ,

.01) i , C12N1/21 C07K14/32 (2006 .01) n

According t o International Patent Classification (IPC) or t o both national classification and IPC B. FIELDS SEARCHED

Minimum documentation searched (classification system followed b y classification symbols)

C12N9/99,

C12N1/04,

C12N1/06,

C12N1/21,

C12N15/09,

C12P21/00,

C07K14/32

Documentation searched other than minimum documentation t o the extent that such documents are included in the fields searched

Jitsuyo Shinan Koho Kokai Jitsuyo Shinan

Koho

1922-1996 1971-2007

Jitsuyo Toroku

Shinan Jitsuyo

Toroku Shinan

Koho Koho

1996-2007 1994-2007

Electronic data base consulted during the international search (name of data base and, where practicable, search terms used)

CA/BIOSIS/ EDLINE/WPIDS (STN) , GenBank/E BL/DDBJ/GeneSeq, SwissProt/PIR/Geneseq, J EDPlus/JST7580/JSTPlus (JDream2
C.

)

DOCUMENTS CONSIDERED T O B E RELEVANT Category Citation of document, with indication, where appropriate, of the relevant passages Relevant t o claim No.

A

MARGOT, P . e t a l ., Bacillus subtilis 168 gene lytF encodes a gamma-D-glutamate-mesodiaminopimelate muropeptidase expressed b y the alternative vegetative sigma factor, sigmaD, Microbiology, 1999, Vol. 145, p .57-65, particularly, page 57, Abstract, page 6 1 MARGOT, P . e t a l ., The lytE Gene o f Bacillus subtilis 168 Encodes a Cell Wall Hydrolase, J . Bacteri . , 1998, Vol. 180, N o .3 , p .749-752, particularly, page 749, Abstract, page 750, left column, Fig. 4

1-33

A

1-33

Further documents are listed in the continuation of Box C .
*
"A"

See patent family annex.
"T"

"E" "L"

"O" "P"

Special categories of cited documents: document defining the general state of the art which i s not considered t o b e of particular relevance earlier application or patent but published on or after the international filing date document which may throw doubts o n priority claim(s) o r which i s cited t o establish the publication date o f another citation o r other special reason (as specified) document referring t o a n oral disclosure, use, exhibition or other means document published p π or t o the international filing date but later than the p π oπty date claimed

later document published after the international filing date or p π oπty date and not in conflict with the application but cited t o understand the p π nciple or theory underlying the invention document of particular relevance; the claimed invention cannot b e considered novel o r cannot b e considered t o involve a n inventive step when the document i s taken alone document of particular relevance; the claimed invention cannot b e considered t o involve a n inventive step when the document i s combined with one or more other such documents, such combination being obvious t o a person skilled in the art document member of the same patent family

"X"

"Y"

"&"

Date of the actual completion of the international search 1 9 December , 2 007 (19 . 12 . 07 )

Date of mailing of the international search report

0 8 January,

2008

(08.01.08)

Name and mailing address of the ISA/

A thonzed officer

Japanese
F

Patent Office
Tele hone No.

。 imile

No

Form PCT/ISA/210 (second sheet) (April 2007)

INTERNATIONAL

SEARCH

REPORT

International application

No.

PCT/JP2007/070513
C
(Continuation).

DOCUMENTS

CONSIDERED T O B E RELEVANT
Relevant to claim No.

Category

Citation o f document, with indication, where appropriate, o f the relevant passages

A

FUKUSHI A , T . e t a l . , A new D ,L-endopeptidase gene product, YojL (renamed CwIS), plays a role i n cell separation with LytE and LytF in Bacillus subtilis, J . Bacteri . , 2006.08, Vol. 188, No. 15, p .5541-5550, particularly, page 5541, Abstract YAMAGUCHI, H . e t a l . , Characterization of a new Bacillus subtilis peptidoglycan hydrolase gene, yvcE (named cwlO) , and the enzymatic properties o f its encoded protein, J . Biosci. Bioeng., 2004, Vol. 98, N o .3 , p .174-181, particularly, page 174, Abstract Takeko KODAMA e t a l ., Karekusakin spoOA Hen' ikabu n o Yokin Yokusei n i Kansuru Kaiseki", Dai 2 7 Kai Annual Meeting o f the Molecular Biology Society o f Japan Program Koen Yoshishu, 2004, page 868, 3PA-272 Database NCBI Protein [online], Accessin No. CAB13721, 2006.01.16 uploaded, DEFINITION yoeB [Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168], <http ://www.ncbi .nlm.nih.gov/entrez/viewer . fcgi?db=protein id=2 63422 1 > TANAKA, H . e t a l . , Control o f autolysis of Bacillus subtilis for selective production o f the intracellular enzyme glucose- 6 -phosphate dehydrogenase i n aqueous two-phase systems, J . Ferment. Bioeng., 1993, Vol. 75, N o .6 , p .424-429, particularly, page 424, Abstract, page 426, right column, lines 3 t o 11, FIG. 4 TAKAGI, M . e t a l . , Nucleotide sequence and cloning i n Bacillus subtilis o f the Bacillus stearothermophilus pleiotropic regulatory gene degT, J . Bacteri . , 1990, Vol. 172, No.l, p .411-418, particularly, page 411, Abstract, page 416, left column, FIG. 5 Tomoaki IWASHITA e t a l ., Karekusakin n o Saibo Bunri o Sogai suru YoeB n o Kino Kaiseki", Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry 2007 Nendo (Heisei 1 9 Nendo) Taikai Koen Yoshishu, 0 5 March, 2007 (05.03.07), page 49, 2A12plO SALZBERG, L . I . and HELMANN, J . D., A n antibiotic-inducible cell wall-associated protein that protects Bacillus subtilis from autolysis, J . Bacterid., 2007.07, Vol. 189, No. 13, p .4671-4680, particularly, page 4671, Abstract

1-33

A

1-33

A

1-33

A

1-33

A

1-33

A

1-33

P ,X P ,A

1-12,20-29 13-19,30-33

P ,X P ,A

1-12,20-29 13-19,30-33

Form PCT/ISA/210 (continuation of second sheet) (April 2007)

国際 調 査 報 告
A・

国際 出願 番 号
)
i,

発 明 の属 す る 分 野 の分類 (国際 特 許 分類 ( I PC)
Int.Cl.

C12N9/99(2006. 01) i , C12Nl/04(2006. 01) i , C12N1/06 (2006. 01) i , C12N1/21 (2006. 01) C12N15/09(2006. 01) i , C12P21/00(2006. 01) i , C07K14/32(2006. 01) n

調 査 を行 た分 野 調 査 を行 た最 小 限 資 料 ( 国際 特許 分類 ( I P C ) )
B・

Int.Cl.

C12N9/99, C12N1/04, C12N1/06, C12N1/21, C12N15/09, C12P21/00,

C07K14/32

最 小 限資 料 以 外 の資 料 で調 査 を行
日本 国実 用 新 案 公 報 日本 国公 開 実 用 新案 公 報 日本 国実 用 新 案 登 録 公 報 日本 国登 録 実 用 新案 公 報

た分 野 に含 ま れ る も の 1 1 1 1 9 9 9 9 2 7 9 9 2 1 1 2 6- 2 4- 2 9 0 0 0 9 0 0 0 6年 7年 7年 7年

国際 調 査 で使 用 した電子デ

タ

ス

デ

タ

ス の名 称 、 調 査 に使 用 した用 語
SwissProt/PIR/Geneseq

CA/BIOSIS/MEDLINE/WPIDS (STN) , GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq, JMEDPlus/JST7580/JSTPlus(JDream2)

関連 す る 引用 文 献 の
C・

認 め られ る 文 献
引用 文 献 名
MARGOT,

カテ

ホ

及び

部 の箇 所 が 関連 す る
subtilis

き は 、 そ の 関連 す る 箇 所 の表 示

関連 する 請 求 の範 囲の番 号
1- 3 3

A

P.

e t al. , Bacillus meso

168 gene

lytF

encodes

a gam

a-D-

glutamate vegetative

diaminopimelate factor,

muropeptidase

expressed

b y the alternative

sigma

sigmaD,
p . 5 7 65,

Microbiology,

1999,

Vol. 145,

f

57

Abstract

f

61

汀
ホ

C 欄 の続 き に も 文 献 が 列 挙 さ れて

る。

汀

テ

ト

ア

に 関する 別紙 を参 照 。

引用 文 献 の カ テ Γ A 特 に 関連 の あ る 文 献 で は な < 、 般 的技 術 水 準 を示す もの ΓE 国際 出願 日前 の 出願 ま た は特 許 で あ る が 、 国際 出願 日 以 後 に公 表 さ れた も の ΓL 優 先 権 主 張 に疑 義 を提 起 す る 文 献 又 は他 の 文 献 の発 行 日若 し は他 の 特 別 な 理 由 を確 立 す る た め に 引 用 す る 文 献 理 由 を付 す ΓO 口頭 に よ る 開 示 、 使 用 、 展 示 等 に言及 す る 文 献 優 先 権 の 主 張 の基 礎 な る 出願 r p 国際 出願 日前 で 、

ΓT ΓX Γ Y
r&j

の 日の役 に公 表 さ i た文 献 国際 出願 日又 は優 先 日後 に公 表 さ れた文 献 で あ て 出願 矛 盾 す る も の で は な 、 発 明 の原 理 又 は理 論 の理 解 の た め に 引用 する も の 特 に 関連 の あ る 文 献 で あ て 、 当 該 文 献 のみで発 明 の新 規 性 又 は進 歩 性 が な 考 え られ る も の 特 に 関連 の あ る 文 献 で あ て 、 当 該 文 献 他 の i 以 上 の文 献 の 、 当 業 者 に て 自 明 であ る組 合 に よ て進 歩 性 が な 考 え られ る も の 同 テ 文献 トア

国際 調 査 を完 了 した 日
1 9. 1 2. 2 0 0 7

国際 調 査 報 告 の発 送 日
0 8. 0 1. 2 0 0
特許 庁 審 査 官
権 限 のあ る 職員
4N

国際 調 査 機 関の名 称 及 び あ て先 日本 国特 許 庁 ( I S A ノ J P ) 郵 便番号 1 0 0 - 8 9 1 5 東 京 都 千代 田 区霞 が 関三 丁 目 4 番
様 式 PCT

3335

吉田
号
(2007

知美
101

電話 番 号

03-3581-1

内線

3488

ノI

SA

ノ 210

(第 2

ジ)

年4 月

国際 調 査 報 告
C ( き) ・ 続 引用 文 献 の
カテ

国際 出願 番 号

ノ

関連 する

認 め られ る 文 献
及ひ
部 の箇 所 か 関連 す る
き は 、 そ の 関連 す る 箇 所 の表 示
subtilis 168 Encodes a Cell Wall

y

ホ

引用 文 献 名
MARGOT,
P.

関連 する 請 求 の範 囲の番 号

A

e t al. , The lytE Gene o f Bacillus

1- 3 3

Hydrolase,
J.

Bacteri 749

. , 1998,

Vol. 180,

No. 3 ,p . 749

752,

特 に、 第

頁 Abstract 、 第 750 頁左 欄 、 Fig ・ 4
e t al. , A new
D , L-endopeptidase

A

FUKUSHIMA, CwIS),

T.

g n e product,

。

YojL m

(renamed

1- 3 3

plays

a role

m

cell separation

with LytE and LytF

Bacillus

subtilis,
J.

Bacteri

. , 2006. 08,

Vol. 188,

No. 15,

p . 5541

5550,

特 に、 第

5541

頁 Abstract

A

YAMAGUCHI,

H.

e t al. , Characterization

o f a new Bacillus (named cwlO),

subtilis

1- 3 3

peptidoglycan properties
J.

hydrolase

g ne,

。

yvcE

and the enzymatic

o f its encoded

protein,

Biosci. Bioeng. , 2004, Vol. 98, No. 3 , . 174-181, p

特 に、 第

174

頁 Abstract

A

児 王武 子,外

名 ,桔 草 菌

spoOA 変 異 株 の溶 菌 抑 制 に 関ず る 解 析 ,

1- 3 3
3PA-272

第 2 7 回 日本 分 子 生 物 字会 年会 プ n ク ラ ム

・ 偵 要 旨集 ,2004 ,p ・ 溝
CAB13721, subtilis 2006.01.16
str.

A

Database NCBI Protein DEFINITION <http yoeB

[online], AccessmNo.

uploaded

,

1- 3 3

[Bacillus

subtilis

subsp.

168],

//www. ncbi. nlm. nih. gov/entrez/viewer.

fcgi?db=protem

id=2634221

A

TANAKA,

H.

e t al. , Control

o f autolysis enzyme

o f Bacillus

subtilis

for selective dehydrogenase

1- 3 3

production m aqueous

o f the intracellular two-phase Bioeng., systems,
1993,

glucose-6-phosphate

J ・ Ferment.

Vol. 75,

No. 6 ,p . 424-429,

特 に、 第

424

頁 Abstract 、 第 426 頁 右欄 第 3-1

、 FIG ・ 4

A

TAKAGI,

M.

e t al. , Nucleotide

sequence

and cloning

m

Bacillus gen

subtilis

of

1- 3 3

the Bacillus
J.

stearothermophilus
1990,

pleiotropic

regulatory

。degT,

Bacterid., 411

Vol. 172,

No. 1,p . 411-418,

特 に、 第

頁 Abstract 、 第 416 頁左 欄 、 FIG ・ 5

PX PA

岩 下智 昭,外

名 ,桔 草 菌 の細 胞 分 離 を阻害 ず る

。 。 の機 能 解 析 ,
p . 49,

1-12, 20-29
13-19, 30-33

日本 農 芸 化 字会 2007
2A12plO

年度 ( 成

19

年J )大 会 溝 偵 要 旨集 ,2007.03.05,

PX PA

SALZBERG,

L・

I.

and HELMANN, protein

J・

D .,

A n antibiotic-mducible Bacillus subtilis

cell from autolysis,

1-12, 20-29
13-19, 30-33

wall-associated
J.

that protects

Bacterid.,

2007. 07, Vol. 189, No. 1 3 , . 4671-4680, p

特 に第 4671 頁 Abstract

様式 P

C T ノ I S A ノ 2 1 0 (第 2

の続 き )

( 2 0 0 7 年 4 月)

国際 調 査 報 告
欄
ヌク

国際 出願 番 号 (第 1
ジの
・

ノ

オチ ド は ア 又

ノ 酸 配列

の続 き
き 国際 調 査 を行

さ ・ こ の 国際 出願 で 開示 れた ヌ ク
・ タイ プ

オ チ ド はア 又

ノ 酸 配 列 に 関 して 、 以 下 に基

た。

戸

配列表 配 列表 に 関連 する テ

r
・

ブJ

7ォ

ツト

紙形式 汗

電 子形 式

・ 提 出時期

出願 時 の 国際 出願 に含 ま れて
汗
こ の 国際 出願

たもの
提 出 さ れた も の

共 に電 子形 式 に よ

r
・庄

出願 後 に、 調 査 の た め に 、 こ の 国際調 査 機 関 に提 出 さ れた も の

ブ を提 出 した場 合 に、 出願 後 に提 出 した配 列若 し は追 加 して提 出 した配 列 が 出願 時 に提 出 した配 列 > 同 — で あ る 旨、 又 は 、 出願 時 の 開示 を超 え る 事 項 を含 ま な 旨の陳 述 書 の提 出が あ た。

さ ら に、 配 列 表 又 は配 列 表 に 関連 す る テ

・ 補足 意 見

式P C

I S A / 2 1 0 (第 1

ジ の続 葉 ( 1 ) )

( 2 0 0 7 年 4 月)



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