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The disclosed reagent for tumor testing contains a probe for the FEAT gene or a primer for amplifying the FEAT gene, or, an antibody against the FEAT protein or a fragment of said antibody. The disclosed pharmaceutical composition for tumor prevention recognizes tumor cells by using the FEAT gene or the FEAT protein as a tumor marker.","lang":"en","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}],"fr":[{"text":"L'invention concerne un nouveau réactif pour tester des tumeurs et une nouvelle composition pharmaceutique pour la prévention tumorale. Le réactif de l'invention pour tester des tumeurs contient une sonde pour le gène FEAT ou une amorce pour l'amplification du gène FEAT, ou un anticorps dirigé contre la protéine FEAT ou un fragment dudit anticorps. La composition pharmaceutique de la présente invention pour la prévention tumorale reconnaît des cellules tumorales par l'utilisation du gène FEAT ou de la protéine FEAT en tant que marqueur tumoral.","lang":"fr","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}],"ja":[{"text":"本発明は、新規な腫瘍の検査用試薬及び腫瘍の予防用医薬組成物を提供することを目的とする。 本発明は、FEAT遺伝子に対するプローブ若しくはFEAT遺伝子の増幅用プライマー、又はFEATタンパク 質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬を提供する。また、本発明は、FEAT遺伝子 又はFEATタンパク質を腫瘍マーカーとして腫瘍細胞を認識する腫瘍の予防用医薬組成物を提供する。","lang":"ja","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}]},"abstract_lang":["en","fr","ja"],"has_abstract":true,"claim":{"ja":[{"text":"FEAT遺伝子に対するプローブ若しくはFEAT遺伝子の増幅用プライマー、又はFEATタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"以下の(a)若しくは(c)の物質又は(b)の細胞を含む、腫瘍の予防用医薬組成物。 (a)FEAT遺伝子の発現若しくはFEATタンパク質の活性を阻害する物質 (b)FEATタンパク質に反応する免疫細胞 (c)FEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記(a)の物質若しくは前記(b)の細胞を担持した物質","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"FEAT遺伝子の発現を阻害する物質がFEAT遺伝子に対するsiRNAである請求項2に記載の医薬組成物。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"FEATタンパク質の活性を阻害する物質がFEATタンパク質に対する抗体である請求項2に記載の医薬組成物。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"免疫細胞がT細胞、B細胞又は樹状細胞である請求項2に記載の医薬組成物。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"生体から採取された被験試料と請求項1に記載の試薬とを反応させることを特徴とする、腫瘍の検出方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"被験試料が血液、体液又は組織切片である請求項6に記載の方法。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"},{"text":"FEAT遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}]},"claim_lang":["ja"],"has_claim":true,"description":{"ja":{"text":"本発明は、FEAT遺伝子に対するプローブ若しくはFEAT遺伝子の増幅用プライマー、又はFEATタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬及び予防用医薬組成物に関する。 癌形成の分子生物学的メカニズムの解明は進歩しているが、未だに癌の効果的なスクリーニング及び予防法は確立されていない(非特許文献1)。従って、分子標的を用いた癌のスクリーニング及び予防法を確立するためには、多種多様な癌と関連する癌遺伝子を発見し、特徴付け、そして分類していくことが必要である。 しかしながら、タンパク質をコードするエキソン領域の網羅的シークエンシング(非特許文献2~4)、全ゲノムシークエンシング(非特許文献5)、及び体細胞における遺伝子転座を同定するためのペアード・エンド・シークエンス(paired−end sequencing)(非特許文献6)等の手法を用いて癌遺伝子を網羅的に同定しようとした結果判明したことは、ヒトの腫瘍形成過程が多様かつ複雑に入り組んでいるということであり、現時点では種々の癌に共通する特徴を見い出すことには成功していない。ヒトの癌化に関わる遺伝子変異は、癌の種類によっても大きく異なり、また、同種の癌であっても個々の腫瘍組織において異なっている(非特許文献7)。従って、現時点では、多種多様な癌において、共通して異常が認められる癌の分子生物学的特徴が存在するのかどうかさえ不明である。 癌においては異常が見られる癌遺伝子の組合せには統一性が無く(非特許文献7~9)、個々の遺伝子よりは、むしろシグナル経路の異常によって腫瘍形成が促されることが示されている(非特許文献10)。また、癌において異常が見られる共通のシグナル経路においても、異常が生じた構成要素は個々の腫瘍組織において異なっている(非特許文献2~4)。 このような背景から、多数の癌組織で共通して高発現しているタンパク質の高発現は、腫瘍に特徴的な形質(解糖、高分子合成、DNA複製といった代謝の増大)及びこれによって生じる細胞内ストレスを反映する副次的な変化に過ぎないものとみなされていた(非特許文献10~12)。従って、このようなタンパク質の高発現が、癌の治療又は予防のターゲットとして注目されることはほとんどなかった。 従来の腫瘍の検出用試薬は、特定の種類の腫瘍に特異的なマーカーを指標として腫瘍を検出するものであったため、患者体内に生じうる腫瘍を網羅的に検出するためには、多種類の検査用試薬の同時使用を必要とした。多種類の検査用試薬を用いることは、コストが高く費用効果比が著しく低下するだけではなく、医療従事者の作業負担並びに患者の心理的及び生理的負担が増大するという問題がある。 また、従来の腫瘍の検出用試薬の多くは、腫瘍性形質変化後に生じる腫瘍マーカーを指標として腫瘍を検出するものであるため、腫瘍形成の早期段階又は前癌段階で腫瘍を検出することができない。従って、従来の検出用試薬を用いて腫瘍が検出された場合には、既に腫瘍疾患のステージが進行してしまっており、有効な治療の選択範囲が制限されるという問題もある。 このような状況から、種々の腫瘍において普遍的に発現するマーカーをターゲットとした検査用試薬及び治療用医薬組成物の開発が待たれている。そこで、本発明は、種々の腫瘍又は癌において普遍的に発現するマーカーをターゲットとした検査用試薬及び治療用医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、腫瘍形成の早期段階で腫瘍を検出可能な検出用試薬を提供することを目的とする。 本発明者らは、鋭意研究を行った結果、多種多様なヒトの癌組織において早期のステージからFEATタンパク質(faint expression in normal tissues,aberrant overexpression in tumors)が共通して過剰発現していることを見出した。本発明者らは、発現マイクロアレイ解析を行い、FEATにより癌化シグナル経路が誘導されることを見出した。また、本発明者らは、FEATを過剰発現させるトランスジェニック(Tg)マウスを作製し、該Tgマウスを用いた実験により、FEATがin vivoにおいても腫瘍形成を促進することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。 従って、本発明は、以下を提供する。 [1] FEAT遺伝子に対するプローブ若しくはFEAT遺伝子の増幅用プライマー、又はFEATタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬。 [2] 以下の(a)若しくは(c)の物質又は(b)の細胞を含む、腫瘍の予防用医薬組成物。 (a)FEAT遺伝子の発現若しくはFEATタンパク質の活性を阻害する物質 (b)FEATタンパク質に反応する免疫細胞 (c)FEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記(a)の物質若しくは前記(b)の細胞を担持した物質 [3] FEAT遺伝子の発現を阻害する物質がFEAT遺伝子に対するsiRNAである前記[2]に記載の医薬組成物。 [4] FEATタンパク質の活性を阻害する物質がFEATタンパク質に対する抗体である前記[2]に記載の医薬組成物。 [5] 免疫細胞がT細胞、B細胞又は樹状細胞である前記[2]に記載の医薬組成物。 [6] 生体から採取された被験試料と前記[1]に記載の試薬とを反応させることを特徴とする、腫瘍の検出方法。 [7] 被験試料が血液、体液又は組織切片である前記[6]に記載の方法。 [8] FEAT遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物。 本発明の試薬により、多様な種類の癌又は前癌病変を検出することができる。また、本発明の試薬を用いることにより、腫瘍形成の早期段階で腫瘍を検出することが可能である。さらに、本発明の医薬組成物を用いることにより、腫瘍を効果的に治療又は予防することができる。 FEATタンパク質の生化学的精製の過程、種間での保存、酵素活性の検討結果を示す図である。 アポトーシス細胞死におけるFEATタンパク質のカスパーゼによる切断部位の同定及びヒトFEATタンパク質の構造を示す図である。図2F:human FEAT中の黄色で表示される部分は、S−アデノシルメチオニン(SAM)結合部分を示す。 FEATタンパク質発現レベルとアポトーシスの逆相関及び細胞内でのFEATタンパク質の分布を示す図である。 ヒト由来の各種細胞株全てでのFEATタンパク質の発現を示すウェスタンブロットの結果、並びに野生型FEAT、変異型FEAT及びFEAT断片によるアポトーシス抑制効果を示す図である。 ヒト正常組織内及び腫瘍組織内でのFEAT発現を示すウェスタンブロットの結果及びFEATタンパク質による癌化シグナル経路の誘導を示す図である。 non−Tgマウス及びTgマウスの各種器官内でのFEAT発現を示すウェスタンブロットの結果、Tgマウスの胸腺細胞のアポトーシス細胞死の低下、およびTgマウスに発生した腫瘍の頻度を示す図である。 Tgマウスに発生した腫瘍の肉眼所見(矢印)並びにこれらマウスの非担癌生存率(tumor−free survival)を示す図である。 Tgマウス及び同腹non−Tgマウスの非担癌生存率(tumor−free survival)(A)、肝癌の原発巣(B)と肺転移巣(C)での組織学的特徴、並びにFEAT Tgマウスに発生した肝癌のアレイCGHで検出されたコピー数変化遺伝子のヒト染色体上での分布(D)を示す図である。 FEAT Tgマウスに発生した各種腫瘍組織の顕微鏡写真である。 アレイCGHで検出された、マウス染色体のうち肝癌で増幅していた個所(赤色)及び欠失していた個所(緑色)を示す図である。 図10Aの続きの図である。 種々のヒト正常および癌組織におけるFEAT発現を示す免疫組織化学所見である。 種々のヒト癌組織におけるFEAT発現の上昇を示す図である。 肝癌に隣接する前癌病変としての肝硬変におけるFEAT発現の上昇を示す図である。 以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。 なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2010年8月16日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願(特願2010−181835号)の明細書及び図面に記載の内容を包含する。 本発明者らは、FEATタンパク質が多種多様な腫瘍組織において過剰発現しており、FEATタンパク質が腫瘍形成に寄与することを見出した。 FEAT遺伝子及びタンパク質は、正常組織では殆ど全ての組織で発現が認められず、僅かに精巣、脳、肝臓に弱く発現しているのみである。一方、FEAT遺伝子は、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、皮膚癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌を含む多種多様な腫瘍組織において、普遍的に発現している(図5B)。 本発明者らは、ヒトの癌形成において、FEATタンパク質が、腫瘍性形質変化に先立って生じていることを見出した(図13)。また、本発明者らは、FEATタンパク質を培養細胞で過剰発現させることにより、発癌経路であるチロシンキナーゼ受容体のシグナル経路及びHedgehogシグナル経路が活性化されることを見出し(図5D)、更に、FEATタンパク質を過剰発現させたトランスジェニックマウスにおいて、種々の器官で腫瘍組織が形成されることを確認している(図7A~図7C)。 従って、現時点では腫瘍化していない細胞であっても、FEATタンパク質を発現している細胞は、将来腫瘍化する可能性が高い細胞(前癌細胞)であるといえる。 ここで、本発明において腫瘍マーカーとして使用されるFEATについて説明する。 FEATタンパク質は、「comparative gene identification−01(CGI−01)」、「KIAA0859」又は「methyltransferase like 13(METTL13)」とも呼ばれる遺伝子にコードされるタンパク質である。 FEATタンパク質は、カスパーゼ3により切断されるが、カスパーゼ6では切断されない(図2B)。また、FEATタンパク質は、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する(図4C)。 ヒトFEAT遺伝子のヌクレオチド配列及びヒトFEATタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1(Accession Number:NM_015935)及び2に示す通りである。また、野生型FEATタンパク質(配列番号2)だけではなく、その変異体、例えば、カスパーゼ3により切断される部位の第274番目(配列番号2)のアスパラギン酸がアラニンで置換されたD274A変異及びカスパーゼ3により切断される部位の第288番目(配列番号2)のアスパラギン酸がアラニンで置換されたD288A変異又はこれらの両変異を有する変異体は、カスパーゼ3により切断されにくいため、より強いアポトーシス抑制機能を有する(図3B)。また更に、完全長FEATタンパク質(配列番号2)だけではなく、その断片、特にFEATタンパク質のアミノ酸配列の第289~699番目のアミノ酸からなる配列を含む断片は、アポトーシス抑制機能を有する。 また、FEATタンパク質は、2つのS−アデノシルメチオニン結合モチーフ(SAM結合モチーフ)を含む。SAM結合モチーフは、メチル基転移酵素及びその関連酵素に特徴的なモチーフであるが(図1B)、FEATタンパク質が、メチル基転移酵素活性を有するかどうかはまだ明らかではない。SAM結合モチーフのコンセンサス配列としては、例えば、以下の配列が挙げられる。 上記のFEATタンパク質及びFEAT遺伝子は、後述の実施例に記載した手法、公知の遺伝子工学的手法、公知の合成手法等によって取得することが可能である。 1.腫瘍の検出用試薬 本発明は、FEAT遺伝子に対するプローブ若しくはFEAT遺伝子の増幅用プライマー、又はFEATタンパク質に対する抗体若しくはその断片を含む、腫瘍の検出用試薬を提供する。 FEAT遺伝子又はFEATタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞で広く特異的に発現されており、正常細胞では殆ど発現されていないため、被検細胞からFEAT遺伝子又はFEATタンパク質が検出された場合には、該被検細胞は、腫瘍細胞又は前癌細胞であると判断することができる。 ここで、「FEAT遺伝子」には、上記で述べた配列番号1に示す塩基配列を有するヒトの野生型FEAT遺伝子の他に、ヒト以外の種に由来するFEATホモログ遺伝子並びにこれらの変異型遺伝子が含まれる。 具体的には、FEAT遺伝子の例として、以下の(a)~(e)からなる群より選択されるいずれか1つのポリヌクレオチドが挙げられる。 (a)配列番号1に示す塩基配列を含むポリヌクレオチド (b)配列番号2に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド (c)配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド (d)配列番号2のアミノ酸配列に対して、60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド (e)配列番号1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、腫瘍促進機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド 上記(a)~(e)のポリヌクレオチドのうち、(a)及び(b)は、ヒト野生型FEAT遺伝子であり、(c)~(e)は、ヒト以外の種に由来するFEATホモログ遺伝子及び変異型FEAT遺伝子である。FEAT遺伝子は、DNA又はRNA(メッセンジャーRNA)のいずれであってもよい。 本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Sambrook & Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2001”及び”Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987−1997”などに記載されている方法を利用することができる。 本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5%SDS、50%ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。 なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1%(w/v)SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたDNAを検出することができる。 上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号1に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号2に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドと50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上、又は99.9%以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。 塩基配列の同一性は、FASTA(Science 227(4693):1435−1441,(1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264−2268,1990;Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTN、BLASTXやBLASTPと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul SF,et al:J Mol Biol 215:403,1990)。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore=100、wordlength=12とする。 上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法又は公知の合成手法によって取得することが可能である。 本発明において、FEAT遺伝子に対するプローブ(以下、「本発明のプローブ」という)又はFEAT遺伝子の増幅用プライマー(以下、「本発明のプライマー」という)の例としては、FEAT遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。「ストリンジェントな条件」は、先に述べたとおりである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、5~500bp、より好ましくは、10~200bp、さらに好ましくは、10~100bpの長さのヌクレオチド鎖を意味する。オリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置(例えば、AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関(例えば、Promega社又はTakara社)等に委託することもできる。 本発明の試薬が、FEAT遺伝子に対するプローブを含む場合、腫瘍を検出するためのアッセイ方法としては、該腫瘍に発現しているFEAT遺伝子に対するノーザンブロッティング(Sambrook,Fritsch and Maniatis,”Molecular Cloning:A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)、マイクロアレイ(Affymetrix社;米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照)又はTaqMan PCR(Sambrook,Fritsch and Maniatis,”Molecular Cloning:A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)が挙げられる。また、本発明の試薬が、FEAT遺伝子に対するプライマーを含む場合、腫瘍の検出方法としては、該腫瘍に発現しているFEAT遺伝子に対するPCR増幅又はシークエンス(Sambrook,Fritsch and Maniatis,”Molecular Cloning:A Laboratory Manual”2nd Edition(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press)が挙げられる。本発明の試薬は、プローブ及びプライマーの両方を含んでいてもよい。 本発明において、「FEATタンパク質」には、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるヒト野生型FEATタンパク質だけではなく、ヒト以外の種に由来するFEATホモログタンパク質並びにこれらの変異型タンパク質が含まれる。また、FEATタンパク質の切断により生じた断片であって、腫瘍促進機能を有する断片も、FEATタンパク質に含まれる。 FEATタンパク質の具体例としては、以下の(f)、(g)若しくは(h)のポリペプチド又はその断片が挙げられる。 (f)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド (g)配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチド (h)配列番号2に示すアミノ酸配列に対して60%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチド 上記(g)又は(h)に記載のポリペプチドは、代表的には、ヒト以外の種に由来するFEATホモログタンパク質又は野生型FEATタンパク質の変異タンパク質であるが、これら以外にも、例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをベースに、”Sambrook & Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”、”Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987−1997”、”Nuc.Acids.Res.,10,6487(1982)”、”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)”、”Gene,34,315(1985)”、”Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)”、”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるポリペプチドも含まれる。 本明細書中、「配列番号2に示すアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチド」としては、配列番号2に示すアミノ酸配列において、例えば、1~100個、1~90個、1~80個、1~70個、1~60個、1~50個、1~40個、1~30個、1~20個、1~10個、1~9個(1~数個)、1~8個、1~7個、1~6個、1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、又は1個のアミノ酸残基が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチドが挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加の数は、一般的には小さい程好ましい。 また、このようなポリペプチドとしては、配列番号2に示すアミノ酸配列と60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.5%以上、又は99.9%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍促進機能を有するポリペプチドが挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。 アミノ酸配列の同一性は、FASTA(Science 227(4693):1435−1441,(1985))や、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムBLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264−2268,1990;Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTN、BLASTXやBLASTPと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul SF,et al:J Mol Biol 215:403,1990)。アミノ酸配列の解析には、一般的にBLASTPが用いられ、アミノ酸配列の同一性を解析する場合であって、60%以上の同一性を有するアミノ酸を検索するときには、パラメーターは、例えばscore=60、wordlength=3とする。 被検タンパク質が、腫瘍促進機能を有するかどうかは、被検タンパク質又はその遺伝子を、FEATを発現しない適切な正常宿主細胞(例えば、ヒト好中球)に導入し、該宿主細胞を適切な培養条件下でインキュベートし、宿主細胞の腫瘍形成を観察することにより、確認することができる。 ある態様では、腫瘍促進機能は、アポトーシス抑制機能である。被検タンパク質が、アポトーシス抑制機能を有するかどうかは、被検タンパク質又はその遺伝子を、FEATを発現しない適切な宿主細胞(例えば、ヒト好中球)に導入し、該宿主細胞を適切な培養条件下でインキュベートし、宿主細胞群に含まれる断片化DNA含有アポトーシス細胞の量をフローサイトメトリーで解析して、アポトーシス細胞数を測定することにより、確認することができる。 本発明において、1以上のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加された形態としては、同一配列中の任意かつ1若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1又は数個のアミノ酸残基の欠失、置換若しくは付加が生じていてもよく、欠失、置換及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。また、アミノ酸残基の付加が生じている場合、該アミノ酸残基は、アミノ酸配列中に挿入される態様で付加されていてもよく、あるいはアミノ酸配列のN末端又はC末端に付加されていてもよい。 以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。 A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、o−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン; B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸、2−アミノスベリン酸; C群:アスパラギン、グルタミン; D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸、2,3−ジアミノプロピオン酸; E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン、4−ヒドロキシプロリン; F群:セリン、スレオニン、ホモセリン; G群:フェニルアラニン、チロシン。 また、上記FEATタンパク質は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法によっても製造することができる。また、Advanced Automation Peptide Protein Technologies社製、Perkin Elmer社製、、Protein Technologies社製、PerSeptive社製、Applied Biosystems社製、SHIMADZU社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。 FEATタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞において発現しているが、アポトーシス細胞死を起こした場合、細胞に内在するカスパーゼ3により切断されるため、腫瘍細胞又は前癌細胞には、FEATタンパク質の断片も含まれることもある。従って、本発明の試薬は、FEATタンパク質の全長または断片を検出する。 前記断片は、特に限定されないが、好ましくは、配列番号2に示すアミノ酸配列の第289~699番目のアミノ酸からなる配列を含む断片である。この断片は、全長よりも弱いながらも腫瘍促進機能を有する点で好ましい。 FEATタンパク質(又はその断片)に対する抗体(以下、「本発明の抗体」)は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。 (1)ポリクローナル抗体の作製 上記抗体を作製するに当たり、まず、免疫源(抗原)として用いるFEATタンパク質を調製する。抗原となるFEATタンパク質は、FEATタンパク質のアミノ酸配列に基づいて遺伝子工学的に作製することができる。 次に、得られた精製FEATを動物に免疫する。免疫は、FEATタンパク質を含む溶液を、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ等)に投与することにより行う。投与は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入して行う。必要に応じて適宜アジュバントを添加することもできる。続いて、免疫により得られる血清(抗血清)を採取する。血清の採取は限定されるものではなく、常法に従い、最終投与日から1~28日後に免疫した動物の血液から採取することができる。採取した抗血清の中から、公知の免疫検定法(immunoassay)を用いて目的の抗血清をスクリーニングする。上記スクリーニングによる目的の抗血清に含まれる抗体はポリクローナル抗体である。当該抗体の精製を必要とする場合は、例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を単独で、又は2種以上を組み合わせることができる。 (2)モノクローナル抗体の作製 抗原及びその溶液の調製、並びに免疫方法は、上記ポリクローナル抗体の作製の場合と同様に行うことができる。 抗原の最終投与の日から1~14日後に、抗体を産生する細胞(抗体産生細胞)を採取する。抗体産生細胞としては、例えば、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が好ましく、脾臓細胞がより好ましい。採取した抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行うことにより、融合細胞(ハイブリドーマ)を得る。 ミエローマ細胞としては、例えば、PAI、P3X63−Ag.8.U1(P3U1)、NS−1などを用いることができる。上記細胞融合は、例えば、RPMI−1640培地等の動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合して融合反応させることにより行う。融合反応は、一般には、ポリエチレングリコール等の細胞融合促進剤の存在下で行うことが好ましい。あるいは、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。 融合反応後の細胞は、例えばHAT選択培地による培養を行う。上記培養後、HAT選択培地での増殖が認められる細胞が融合細胞(ハイブリドーマ)となる。上記培養により得られたハイブリドーマから、目的のハイブリドーマをスクリーニングする。硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の公知の精製方法を、単独で、又は適宜組み合わせて用いることで前記ハイブリドーマからモノクローナル抗体を精製することができる。モノクローナル抗体の作製方法については、米国特許第4,816,567号を参照することができる。 また、本発明においては、ヒト型化抗体、ヒト抗体、前記抗体の断片も使用することが可能である。 ヒト型化抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、具体的には、その超可変領域の相補性決定領域(CDR)の一部又は全部がマウスモノクローナル抗体に由来する超可変領域の相補性決定領域であり、その可変領域のフレームワーク領域(FR)がヒト免疫グロブリン由来の可変領域のFRであり、かつその定常領域がヒト免疫グロブリン由来の定常領域である抗体である。 ヒト抗体とは、免疫グロブリンを構成する全ての領域がヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体をいう。 ヒト型化抗体及びヒト抗体の作製方法については、以下の文献を参照できる:Riechmann L.et al.(1988)Nature 332(6162):332−323;特許公報第2912618号。 (3)抗体断片 抗体断片とは、上記抗体の抗原結合領域を含む部分断片を意味し、具体的にはF(ab’) 2 、Fab’、Fab、Fv(variable fragment of antibody)、scFv(single chain Fv)、dsFv(disulphide stabilised Fv)等が挙げられる。 本発明の試薬が、FEATタンパク質に対する抗体を含む場合、腫瘍を検出するためのアッセイ方法としては、該腫瘍に発現しているFEATタンパク質に対する免疫組織染色法(Lorette C.Javois ed.“Immunocytochemical Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology)”Humana Press;2nd edition(February 15,1999))、免疫沈降法、アフィニティークロマトグラフィー、プルダウンアッセイ、Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)及びウェスタンブロッティング(Gary C.Howard and Matthew R.Kaser ed.“Making and Using Antibodies:A Practical Handbook”CRC Press;1st edition(December 13,2006))、抗体マイクロアレイ(Chaga GS(2008).”Antibody arrays for determination of relative protein abundances”.Methods Mol.Biol.441:129−51;Rivas LA,Garc▲i▼a−Villadangos M,Moreno−Paz M,Cruz−Gil P,G▲o▼mez−Elvira J,Parro V(November 2008).”A 200−antibody microarray biochip for environmental monitoring:searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling”.Anal.Chem.80(21):7970−9)等が挙げられる。 2.腫瘍の予防用医薬組成物 本発明者らは、腫瘍形成過程において、FEATタンパク質が、極めて早期の段階(腫瘍性形質変化前)から発現しており、さらにFEATタンパク質の発現が腫瘍形成を促進することを見出した。 従って、既に腫瘍化したFEAT発現細胞を破壊すると同時に、前癌段階のFEAT発現細胞も破壊することにより、腫瘍の発達を阻害し、腫瘍形成を予防することが可能である。 また、本発明者らは、FEATタンパク質自体がアポトーシス抑制機能を有しており、FEATタンパク質の発現によって癌化シグナル経路が活性化されていることを見出した。 従って、FEATタンパク質又はその遺伝子の機能を阻害して、腫瘍細胞又は前癌細胞のアポトーシス細胞死を誘導することにより、腫瘍の形成を予防することも可能である。 よって、本発明は、以下の(i)若しくは(ii)の物質又は(iii)の細胞を含む、腫瘍の予防用医薬組成物を提供する。 (i)FEAT遺伝子の発現若しくはFEATタンパク質の活性を阻害する物質 (ii)FEATタンパク質に反応する免疫細胞 (iii)FEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記(i)の物質若しくは前記(ii)の細胞を担持した物質 (i−1) FEAT遺伝子の発現を阻害する物質 上記(i)に記載の「FEAT遺伝子の発現を阻害する物質」の具体例としては、FEAT遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)の発現量を低下させる物質、例えば、低分子化合物、ホルモン、タンパク質及び核酸等が挙げられ、1つの実施態様では、FEAT遺伝子の機能又は発現を抑制する核酸である。このような核酸の例としては、RNA干渉(RNAi)用のsiRNA(small interfering RNA)を生じさせる、ヘアピン状のshRNA(Short Hairpin RNA)、二本鎖RNA(Double Stranded RNA:dsRNA)、アンチセンス核酸、デコイ核酸、又はアプタマーなどが挙げられる。これらの阻害性核酸により、上記遺伝子の発現を抑制することが可能である。阻害の対象となるFEAT遺伝子の塩基配列は上記の通りであり、それぞれ配列情報を入手することができる。本発明において、FEAT遺伝子の塩基配列は配列番号1に示すものであるが、FEATのコード領域のみならず、非コード領域を使用することも可能である。 (1)RNA干渉 本発明者らは、shRNAを用いたRNAiにより宿主細胞のFEAT発現をノックダウンし(図3C)、該宿主細胞のアポトーシスを促進することに成功している(図3D)。 RNAiは、複数の段階を経て行われるマルチステッププロセスである。最初に、RNAi発現ベクターから発現したdsRNA又はshRNAがDicerによって認識され、21~23ヌクレオチドのsiRNAsに分解される。次に、siRNAsはRNA誘導型サイレンシング複合体(RNA−Induced Silencing Complex:RISC)と呼ばれるRNAi標的複合体に組み込まれ、RISCとsiRNAsとの複合体がsiRNAの配列と相補的な配列を含む標的mRNAに結合し、mRNAを分解する。標的mRNAは、siRNAに相補的な領域の中央で切断され、最終的に標的mRNAが速やかに分解されてタンパク発現量が低下する。最も効力の高いsiRNA二重鎖は、19bpの二重鎖の各3’末端にウリジン残基2個の突出部分を持つ21ヌクレオチド長の配列であることが知られている(Elbashir S.M.et al.,Genes and Dev,15,188−200(2001))。 一般に、mRNA上の標的配列は、mRNAに対応するcDNA配列から選択することができる。但し、本発明においてはこの領域に限定されるものではない。 siRNA分子は、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的mRNAの標的セグメントは、好ましくはAA、TA、GA又はCAで始まる連続する15~30塩基、好ましくは19~25塩基のセグメントを選択することができる。siRNA分子のGC比は、30~70%、好ましくは35~55%である。あるいは、RNAiの標的配列は、Ui−Tei K.et al.((2004)Nucleic Acids Res.32,936−948)の記載に沿って適宜選択することができる。例えば、ヒトFEAT遺伝子に対するRNAiを行う場合、FEAT cDNAのOpen Reading Frame領域の第183、259、1385、1550、1634、2056番目を始点とする19塩基対の下記塩基配列(それぞれ、配列番号3、4、5、6、7、8)を標的としてRNAiを行うことにより、FEAT遺伝子の発現を抑制することができる。 siRNAを細胞に導入するには、合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、2本鎖RNAをアニールする方法などを採用することができる。 また、本発明は、RNAi効果をもたらすためにshRNAを使用することもできる。shRNAとは、ショートヘアピンRNAと呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。 shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Aとし、配列Aに対する相補鎖を配列Bとすると、配列A、スペーサー、配列Bの順でこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するように連結し、全体で45~60塩基の長さとなるように設計する。スペーサーの長さも特に限定されるものではない。 配列Aは、標的となるFEAT遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Aの長さは19~25塩基、好ましくは19~21塩基である。 さらに、本発明は、マイクロRNAを用いてFEAT遺伝子の発現を阻害することができる。マイクロRNA(miRNA)とは、細胞内に存在する長さ20~25塩基ほどの1本鎖RNAであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているncRNA(non coding RNA)の一種である。miRNAは、RNAに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。 miRNAも、RNAiに基づく阻害性核酸であるため、shRNA又はsiRNAに準じて設計し合成することができる。 RNAi用の発現ベクターは、pMuniH1プラスミド、pSINsiベクター(タカラバイオ)、pSIF1−H1(システムバイオサイエンス社)等をベースに、市販のDNA/RNAシンセサイザー(例えば、Applied Biosystems394型)を用いて容易に作製することができる。あるいは、RNAi用の発現ベクターは、コスモ・バイオ株式会社、タカラ・バイオ株式会社、Invitrogen社、Promega社等の第三者機関に作製を委託することもできる。 (2)アンチセンス核酸 本発明の別の態様において、FEAT遺伝子の発現を阻害するためにアンチセンス核酸を使用することができる。アンチセンス核酸は、FEAT遺伝子のmRNA又はDNA配列に結合できる一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)である。アンチセンス核酸配列の長さは、少なくとも14ヌクレオチドであり、好ましくは14~100ヌクレオチドである。アンチセンス核酸は、上記遺伝子配列に結合して二重鎖を形成し、FEAT遺伝子の転写又は翻訳を抑制する。 アンチセンス核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。 (3)デコイ核酸 本発明の別の態様では、デコイ核酸と呼ばれるおとり核酸を使用することにより、FEAT遺伝子の発現を阻害することができる。 デコイ核酸は、FEAT遺伝子又はFEAT受容体遺伝子の転写因子に結合してプロモーター活性を抑制することにより、FEAT遺伝子発現を抑制する核酸であって、転写因子の結合部位を含む短いおとり核酸を意味する。この核酸が癌細胞内に導入されると、転写因子がこの核酸に結合する。これにより、転写因子のゲノム結合部位への結合が競合的に阻害され、その結果、転写因子の発現が抑制される。 本発明の好ましいデコイ核酸としては、例えばFEAT遺伝子のプロモーターに結合する核酸、あるいはFEATのmRNAやFEATの上流に存在する因子のプロモーターに結合する核酸などが挙げられる。デコイ核酸は、FEAT遺伝子のプロモーター配列をもとに、1本鎖又は2本鎖として設計することができる。デコイ核酸の長さは特に限定されるものではなく、15~60塩基、好ましくは20~30塩基である。 デコイ核酸は、DNAでもRNAでもよく、修飾された核酸が含まれていてもよい。 本発明で用いられるデコイ核酸は、当分野で公知の化学合成法又は生化学的合成法を用いて製造することができる。例えば、遺伝子組換え技術に一般的に用いられるDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となる塩基配列を単離又は合成した後に、PCR法又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を使用することもできる。さらに、細胞内でより安定なデコイ核酸を得るために、塩基等にアルキル化、アシル化等の化学修飾を付加することができる。 なお、デコイ核酸を使用した場合のプロモーターの転写活性の解析は、一般的に行なわれるルシフェラーゼアッセイ、ゲルシフトアッセイ、RT−PCR等を採用することができる。これらのアッセイを行なうためのキットも市販されている(例えばPromega dual luciferase assay kit)。 (4)アプタマー さらに、本発明は、アプタマーを用いてFEAT遺伝子の発現を阻害することができる。 アプタマーとは、特異的に標的物質に結合する能力を持つ合成DNA又はRNA分子及びペプチド性分子であり、試験管内において化学的に短時間で合成することができる。従って、配列番号1に示す塩基配列を基準にして、あるいは、in vitro selection法又はSELEX法として知られている進化工学的手法により得ることができる。 核酸アプタマーは、血流中ではヌクレアーゼにより速やかに分解及び除去されるため、必要に応じてポリエチレングリコール(PEG)鎖などによる分子修飾を行って半減期を伸ばしておくことが好ましい。 (i−2) FEATタンパク質の活性を阻害する物質 上記(i)に記載の「FEATタンパク質の活性を阻害する物質」の具体例としては、FEATタンパク質を分解する物質(例えば、各種プロテアーゼ)及びFEATタンパク質の拮抗物質(例えば、低分子化合物、ホルモン、タンパク質、抗体及び核酸等)が挙げられ、ある実施態様では、FEATタンパク質に対する抗体である。FEATタンパク質に対する抗体は、検査用試薬の項目で述べたとおりである。 (ii) FEATタンパク質に反応する免疫細胞 上記(ii)に記載の「FEATタンパク質に反応する免疫細胞」の具体例としては、FEATタンパク質を抗原として認識する免疫細胞が挙げられる。免疫細胞の例としては、ヘルパーT細胞、キラーT細胞、ナチュラルキラー細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージ等が挙げられるが、これに限定されるものではない。 このような免疫細胞は、遺伝子組換えにより、抗癌剤の遺伝子又は抗癌剤のプロドラッグを活性薬剤に変換するプロドラッグ変換酵素の遺伝子を発現するように形質転換されたものであってもよい。 例えば、FEATタンパク質に反応する免疫細胞が抗腫瘍作用を持つ分子(以下において、「抗癌剤」と総称する)を発現する細胞である場合、FEATタンパク質は、腫瘍細胞で限定的に発現しているため、このような免疫細胞は、FEATタンパク質を介して腫瘍細胞と接触し、該免疫細胞内に発現する抗癌剤により腫瘍細胞が死滅する。ここで、「抗癌剤」には、そのプロドラッグも含まれる。 抗癌剤の例としては、以下に限定されるものではないが、パラスポリン、POGZ、パニツムマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツマブ、イムノマックス、ベバシツマブ、L−アスパラギナーゼ、ダサチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ、アキシチニブ、スニチニブ、モテサニブ、デノスマブ、ニモツズマブ、イブリツモマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、CS−1008、MORAb−009、MORAb−003、ONO−4538、KW−0761、AMG655、R7159(GA101)、R1507、CMC−544、GC33、KRN330m、U3−1287等が挙げられる。これらの抗癌剤をコードする遺伝子の塩基配列は、公知である。 また、抗癌剤は、癌遺伝子に対するsiRNA、又は該siRNAを生じさせるshRNA若しくはdsRNAであってもよい。癌遺伝子の具体例としては、myelocytomatosis oncogene(c−Myc)遺伝子、v−Src遺伝子、RAS遺伝子、B−cell leukemia/lymphoma2(BCL2)遺伝子、phosphatidyl inositol 3−kinase catalytic subunit(PIK3CA)遺伝子、Cyclin D1遺伝子、Liver Kinase B1(LKB1)遺伝子、c−Abl遺伝子、c−Sis遺伝子、epidermal growth factor receptor(EGFR)遺伝子、platelet−derived growth factor receptor(PDGFR)遺伝子、vascular endothelial growth factor receptor(VEGFR)遺伝子,HER2/neu遺伝子、Rafキナーゼ遺伝子、サイクリン依存性キナーゼ遺伝子(例えば、Cyclin dependent kinase 4:Cdk4)、及びこれらの変異遺伝子が挙げられる。siRNAについては、RNA干渉の項目で述べたとおりである。 本発明の免疫細胞がプロドラッグ変換酵素を発現する場合、前記免疫細胞と抗癌剤のプロドラッグとを患者に投与すると、前記細胞がFEATタンパク質を発現する腫瘍細胞又は前癌細胞(以下、「腫瘍細胞」と総称する)を認識して、その腫瘍細胞周囲に局在し、その場で限定的にプロドラッグ変換酵素を生産する。その結果、投与されたプロドラッグは、腫瘍細胞周囲のみで抗癌剤に変換されるため、抗癌剤は、腫瘍細胞に限定的に効力を示し、正常細胞に対する影響を最小限にとどめることができる。 プロドラッグ変換酵素の例としては、チミジンキナーゼ、チミジンキナーゼとチミジレートキナーゼ(thymidylate kinase)との融合タンパク質及びシトシンデアミナーゼ等が挙げられる。チミジンキナーゼは、ガンシクロビルのプロドラッグ変換酵素であり、チミジンキナーゼとチミジレートキナーゼとの融合タンパク質は、アジドチミジンのプロドラッグ変換酵素であり、シトシンデアミナーゼは、5−フルオロウラシル(5−FU)のプロドラッグ変換酵素である。これらのプロドラッグ変換酵素をコードする遺伝子の配列は公知である。 上記抗癌剤(癌遺伝子に対するsiRNAを除く)又はプロドラッグ変換酵素の遺伝子(以下、「抗癌遺伝子」)は、適切な発現カセットとして発現ベクターに挿入し、該ベクターで宿主細胞(例えば、免疫細胞)を形質転換すればよい。適切な発現カセットは、少なくとも以下を構成要素として含む。 宿主細胞で転写可能なプロモーター; 該プロモーターにin−frameに結合した抗癌遺伝子;及び RNA分子の転写終結及びポリアデニル化シグナルをコードする配列 哺乳動物由来の免疫細胞を宿主細胞とする場合、該宿主細胞で転写可能なプロモーターの例としては、CMV、CAG、LTR、EF−1α、SV40プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 癌遺伝子に対するsiRNAの発現ベクターについては、RNA干渉の項目で述べたとおりである。 前記発現ベクターは、前記発現カセットの他に、形質転換された宿主細胞をセレクションするための選択マーカー発現カセットを有していてもよい。選択マーカーの例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、LacZ、GFP(Green Fluorescence Protein)及びルシフェラーゼ遺伝子などの発現レポーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(HSV−TK)、ジフテリア毒素A断片(DTA)等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。 形質転換された宿主細胞は、上記マーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、G418を加えた培地中で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。また、ターゲティングベクターがGFP等の蛍光タンパク質の遺伝子をマーカーとして含む場合には、薬剤耐性によるセレクションに加えて、FACS(Fluorescence Activated Cell Sorter)等を用いた蛍光タンパク質発現細胞のソーティングを行ってもよい。 宿主細胞への抗癌遺伝子の導入に使用可能な発現ベクターは市販されており、例としてpEGFP−C1 TM (Clontech)、pCMV−HA TM (Clontech)、pMSCVpuro TM (Clontech)、pEF−DEST51 TM (Invitrogen)、pCEP4 TM (Invitrogen)、ViraPowerII Lentiviral Gateway System TM (Invitrogen)等が挙げられる。発現ベクターは、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウィルス感染等、公知の遺伝子導入法により宿主細胞へ導入することができる。遺伝子導入法の詳細については、「Sambrook & Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor,Laboratory Press 2001」等を参照することができる。 FEATタンパク質に反応する免疫細胞は、以下の手順により作製することができる。 まず、FEATのアミノ酸配列の中で、個々人の組織適合抗原(HLA)に合った免疫用のペプチドのアミノ酸配列を予測し、そのようなアミノ酸配列を有するペプチドを合成する。HLAに合った免疫用のペプチドのアミノ酸配列の予測は、BIMAS( http://www−bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/ )又はSYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)のソフトウェアを用いて行うことができる。次に、(1)前記ペプチドをフロイト不完全アジュバントと混和し、ペプチドワクチンとしてヒトに皮下接種し、ヒトの体内で免疫細胞を作製させるか、又は、(2)ヒト末梢血より分離した細胞にペプチドおよび各種のサイトカインを加えて培養することで免疫細胞を作製させる。 (iii) FEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記(i)の物質若しくは前記(ii)の細胞を担持した物質 本発明において、「FEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記(i)の物質若しくは前記(ii)の細胞を担持した物質」は、抗腫瘍剤、前記(i)の物質若しくは前記(ii)の細胞をFEAT発現細胞に送達可能な物質を意味する。このような物質の例としては、FEATタンパク質に結合可能なペプチド、糖、低分子、高分子、核酸、金属、抗体等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、前記物質は、抗腫瘍剤が結合した抗FEAT抗体である。 本発明の医薬組成物の投与経路は、該候補薬剤の投与に一般的に採用されている経路であれば、特に限定はされないが、具体例としては、経口、舌下、経鼻、経肺、経消化管、経皮、点眼、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、局所注射、外科的移殖が挙げられ、好ましくは静脈内注射である。 本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、粉末等の固形剤であってもよく、溶液、懸濁液若しくは乳液等の液剤、又は軟膏、クリーム若しくはペースト等の半液体製剤であってもよい。 本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、適切な剤形の例としては、細胞懸濁液が挙げられる。細胞懸濁液は、細胞の生存に適した培養培地、サイトカイン、血清(好ましくは、投与対象である患者から採取した自家血清)、非必須アミノ酸、抗生物質等を含んでいてもよい。一方、本発明の医薬組成物が細胞以外の物質を含む場合、適切な剤形の例としては、適切な剤形の例としては、懸濁液又は溶液が挙げられる。懸濁液又は剤形は、前記物質(例えば、siRNA、抗体又は抗癌剤等)の構造維持に適した緩衝剤、生理食塩水、プロテアーゼ阻害剤、キレート剤(EDTA等)等を含んでいてもよい。 上記有効成分は、単独で使用してもよく、又は薬理学的に許容可能な他の成分と共に調合してもよい。薬理学的に許容可能な他の成分の例としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、抗酸化剤、保存剤、補助剤、滑沢剤、甘味剤、香料等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 本発明の医薬組成物は、有効成分であるFEAT阻害物質を治療上有効量で含み得る。ここで、「治療上有効量」とは、その量の有効成分を対象に投与することにより、腫瘍細胞又は前癌細胞の増殖率を低下させることが可能な量を意味する。例えば、静脈内注射剤の場合、治療上有効量は、0.001~10重量%であり、好ましくは、0.01~5重量%であり、より好ましくは、0.1~2重量%である。本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、治療上有効量は、1x10 3 ~10 10 細胞/mlであり、好ましくは、1x10 4 ~10 9 細胞/mlであり、より好ましくは、1x10 5 ~10 8 細胞/mlである。 本発明の医薬組成物の投与量及び投与頻度は、対象の種、体重、性別、年齢、腫瘍疾患の進行度、投与経路といった種々の要因に依存して変化するが、医師、獣医師、歯科医師又は薬剤師等の当業者であれば、それぞれの要因を考慮して投与量を決定することができる。例えば、本発明の医薬組成物を体重60kgの成人に局所投与する場合、毎日1~4回、好ましくは1又は2回投与してもよく、1回あたりの投与量は、0.1~150mgであり、好ましくは1~50mgである。本発明の医薬組成物が細胞を含む場合、1回あたりの投与量は、1x10 3 ~10 10 細胞であり、好ましくは、1x10 4 ~10 9 細胞であり、より好ましくは、1x10 5 ~10 8 細胞である。 例えば、患者に、活性化リンパ球を1回当たり5X10 7 または2X10 8 個を点滴投与し、樹状細胞を1×10 7 個を皮下注射してもよいが、投与量は、これに限定されるものではない。 上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度は、典型的な数値を列挙したものであり、これを超える数値又は下回る数値であっても腫瘍細胞又は前癌細胞の増殖率の増加率が低下する場合も十分に考えられる。従って、上記の治療上有効量、投与量及び投与頻度を超える数値又は下回る数値であっても、本発明の医薬組成物の治療上有効量、投与量及び投与頻度として包含される。 本発明の医薬組成物の対象となる腫瘍の種類は、特に限定されず、良性腫瘍又は悪性腫瘍のいずれでもよい。このような腫瘍の例としては、(1)骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、(2)乳癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢癌、子宮癌、大腸癌、直腸癌、精巣癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、舌癌、咽頭喉頭癌等の癌腫、(3)ホジキンや非ホジキン型のリンパ腫、(4)神経芽細胞腫、(5)メラノーマ、(6)多発性骨髄腫、(7)ウィルムス腫瘍、(8)急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ性白血病(ALL)及び慢性リンパ性白血病(CLL)等の白血病、(9)グリオーマ等の脳腫瘍、(10)網膜芽細胞腫等が挙げられ、好ましくは、ヒトでFEATタンパク質を発現していることがウェスタンブロッティング、免疫組織的解析、マイクロアレイ解析で既に確認されている腫瘍、例えば、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭喉頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、大腸癌、膀胱癌、網膜芽細胞腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 本発明の医薬組成物は、腫瘍増殖を抑制することが可能であるので、腫瘍の予防だけではなく、腫瘍の治療用医薬組成物としても使用することができる。本発明の医薬組成物の投与による、患者体内の腫瘍組織の縮小は、X線、CT、MRI(磁気共鳴画像)、PET(ポジトロン断層法)又はエコー等の診断機器を用いて容易にトレースすることができる。 3.検査方法 本発明は、生体から採取された被験試料と本発明の試薬とを反応させることを特徴とする、腫瘍の検出方法を提供する。 FEAT遺伝子又はFEATタンパク質は、腫瘍細胞又は前癌細胞で限定的に発現されており、正常細胞では殆ど発現されていないため、被検細胞からFEAT遺伝子又はFEATタンパク質が検出された場合には、該被検細胞は、腫瘍細胞又は前癌細胞であると判断することができる。 本発明において、生体は、特に限定されず、いずれの生物種の生体であってもよい。好ましくは、生体は哺乳動物であり、例えば、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 被検試料は、組織、細胞、粘膜、血液成分(血清、血漿、血球細胞)、涙液、鼻汁、喀痰、唾液、胃液、胆汁、膵液等の消化液、尿、糞便、汗、体毛、乳汁等の生体に由来するサンプルであってもよく、又は培養組織若しくは細胞、培養細胞の抽出物、培養上清等の培養組織若しくは細胞に由来するサンプルであってもよい。 生体から被検試料を採取する方法は、被検試料の種類に応じて変化するが、一般的には、採血、バイオプシー、吸引細胞診、採尿、採便又は腫瘍の外科的切除が挙げられる。このように採取された腫瘍組織から、細胞抽出物を調製するが、細胞抽出物は、採取した腫瘍に含まれる細胞(初代腫瘍細胞)から直接調製してもよく、あるいは、採取した腫瘍に含まれる細胞を適切な条件で培養した後に、初代腫瘍細胞から1又は複数回の細胞分裂によって生じた細胞から調製してもよい。初代腫瘍細胞又は初代腫瘍細胞から細胞分裂によって生じた細胞を回収し、超音波破砕、細胞溶解剤の添加、ホモジェナイジング等によって細胞抽出物を得ることができる。細胞抽出物には、核酸又はタンパク質の分解を防ぐために、ヌクレアーゼインヒビター又はプロテアーゼインヒビターが添加されていてもよい。また、細胞抽出物は、冷凍保存(好ましくは、−80℃以下の温度で)した後に、本発明の方法に用いてもよい。さらに、被検試料は、上記のように調製した細胞抽出物から更なる精製工程を経て得られた精製タンパク質又は核酸であってもよい。細胞抽出物の調製方法並びにタンパク質及び核酸の精製方法の詳細については、以下を参照できる。 ”Sambrook & Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol.3,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001”、”Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons 1987−1997”。 本検出方法において、被検試料と本発明の検査用試薬を反応させるには、これらの資料及び試薬を混合すればよい。混合した後に、混合物の組成分布を均一に保つため、混合物を(シェーカー又はローター等を用いて)穏やかに撹拌することが好ましい。本発明の方法は、サンプルに含まれるFEATタンパク質若しくはFEAT遺伝子及び本発明の試薬に含まれる核酸若しくは抗体の分解を防ぐ観点から、常温(25℃前後)以下、好ましくは、15℃、10℃、8℃、5℃以下で行われ、最も好ましくは4±1℃で行われる。 また、被検試料と本発明の試薬との反応に先立って、被検試料若しくは本発明の試薬のいずれか又は両方をブロッキング剤と混合してブロッキング処理してもよい。あるいは、被検試料、本発明の試薬及びブロッキング剤を全て混合した混合物中で反応を行ってもよい。ブロッキング剤の例としては、血清含有緩衝溶液又はスキムミルク含有緩衝溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 FEAT遺伝子又はタンパク質を検出するためのアッセイ方法は、腫瘍の検出用試薬の項目で述べた通りである。 4.腫瘍のモデル動物 本発明者らは、FEAT遺伝子を導入することによりFEATタンパク質を過剰発現するトランスジェニック(Tg)動物を作製した。FEATタンパク質の過剰発現により、Tg動物が複数の器官において腫瘍を形成することが判明した。該Tg動物に形成された腫瘍は、ヒト患者の腫瘍と病理学的特徴及び遺伝子変化が重複することから、該Tg動物は、ヒトの腫瘍を詳細に反映する腫瘍モデルとして有用である。 従って、本発明は、FEAT遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物を提供する。 本発明において、「FEAT遺伝子」は、検査用試薬の項目で述べた通りである。 また、本発明にかかる「トランスジェニック非ヒト動物」は、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物(例えば、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ)であり、より好ましくは、遺伝子組換及び交配による次世代動物取得の容易性の観点からマウス、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類動物である。 4−1.トランスジェニック動物の作製方法 FEAT遺伝子の発現ベクターを作製し、これを受精卵に導入する。発現ベクターの種類、宿主細胞への導入方法、形質転換体のセレクション方法は、医薬組成物の項目で述べた通りである。 受精卵への導入は、マイクロインジェクション法(Hogan,B.et al.”Manipulating the Mouse Embryo”Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)により行うことができる。 マイクロインジェクション法は、FEAT遺伝子の発現ベクターを受精卵に直接注入する方法である。この方法では、動物から採取した受精卵に、マイクロマニピュレーター等を用いてFEAT遺伝子の発現ベクターを顕微鏡下で直接注入する。 このようにして作製された受精卵を、仮親(偽妊娠動物)の子宮に移植して発生させることにより所望のトランスジェニック動物を得ることができる。 前記トランスジェニック動物を、さらに同系の野性型動物とあるいはトランスジェニック動物同士で交配させることにより、トランスジェニック動物系統を維持できる。各個体のジェノタイプは、前述したサザンブロッティングやPCR法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。 上記のようにして作製されたFEAT遺伝子トランスジェニック動物の子孫も、FEAT遺伝子が過剰発現されている限り、本発明のモデル動物に含まれる。 本発明のモデル動物は、動物の種類や系統を変えることにより、種々の腫瘍のモデルとして有用であると考えられる。例えば、腫瘍の例としては、(1)骨肉腫や軟部組織肉腫等の肉腫、(2)乳癌、肺癌、膀胱癌、腎癌、甲状腺癌、前立腺癌、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆嚢癌、子宮癌、大腸癌、直腸癌、精巣癌、子宮頸癌、卵巣癌、皮膚癌、舌癌、咽頭喉頭癌等の癌腫、(3)ホジキンや非ホジキン型のリンパ腫、(4)神経芽細胞腫、(5)メラノーマ、(6)多発性骨髄腫、(7)ウィルムス腫瘍、(8)急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、急性リンパ性白血病(ALL)及び慢性リンパ性白血病(CLL)等の白血病、(9)グリオーマ等の脳腫瘍、(10)網膜芽細胞腫等が挙げられ、好ましくは、ヒトでFEATタンパク質を発現していることがウェスタンブロッティング、免疫組織的解析、マイクロアレイ解析で既に確認されている腫瘍、例えば、卵巣癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、メラノーマ、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、胃癌、咽頭喉頭癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、リンパ腫、大腸癌、膀胱癌、網膜芽細胞腫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のモデル動物は、好ましくは、トランスジェニックマウスである。 本発明のモデル動物は、特に肝細胞癌(hepatocellular carcinoma:HCC)及び/又は悪性リンパ腫のモデル動物として有用である。 以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例に記載された態様に限定されるものではない。 <1.実験方法> 試薬 アゴニスト作用性抗Fas IgMモノクローナル抗体(CH−11)は、MBL(名古屋、日本)から購入した。カスパーゼ阻害剤のベンジルオキシカルボニル−Val−Ala−Asp(OMe)−fluoromethylketone(zVAD−fmk)は、Enzyme Systems(Dublin,California,USA)から購入した。 プラスミド Hisタグ化DNA fragmentation factor(DFF)40及びDFF45(Liu,X.(1999)J.Biol.Chem.274,13836−13840)は、Dr.Xiaodong Wang(Howard Hughes Medical Institute and Department of Biochemistry,University of Texas Southwestern Medical Center,Dallas,Texas)から提供して頂いた。プラスミドpcDL−SRα−procaspase−3は、Dr.Fumiko Toyoshima−Morimoto(Institute for Virus Research,Kyoto University,Kyoto,Japan)から提供して頂いた。 組換えカスパーゼの精製 pET−16bプラスミド(Novagen,Merck KgaA,Darmstadt,Germany)にコードされるHisタグ化組換えカスパーゼ3及びカスパーゼ6を、大腸菌BL21(DE3)pLys株(Novagen,Merck KGaA)から以下の手順で精製した。 1mMのイソプロピル−β−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)を添加してカスパーゼ発現を1時間誘導した後に大腸菌をリン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、その後、溶解バッファー(50mM TrisHCl(pH8.0),0.5mMスクロース,5%グリセロール,1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF),1%(v/v)アプロチニン(Sigma,Saint Louis,MO),CLAP(キモトリプシン、リューペプチン、アンチパイン及びペプスタチン)を1μg/ml含む)中で超音波破砕することにより、細胞を溶解させた。その後、以下の工程を4℃にて行った。 細胞溶解物を遠心し、上清に10mMのβ−メルカプトエタノール及び5mMのイミダゾールを添加し、これを溶解バッファーで平衡化させておいたNi 2+ −NTAアガロースカラム(Qiagen,Hilden,Germany)にアプライした。次いで、カラムを洗浄バッファー(50mM TrisHCl(pH8.0),0.5mMスクロース,5%グリセロール,10mM β−メルカプトエタノール,60mMイミダゾール,400mM NaCl,0.04%(v/v)Nonidet P−40(NP−40))で十分に洗浄した。Hisタグ化カスパーゼを溶出バッファー(50mM TrisHCl(pH8.0),0.5mMスクロース,5%グリセロール,500mMイミダゾール,1mM PMSF,1%(v/v)アプロチニン,1μg/ml CLAP)で溶出し、KPMバッファー(50mM KCl,50mM PIPES,pH7.0,10mM EGTA,1.92mM MgCl 2 ,1mMジチオトレイトール(DTT),20μMサイトカラシンB,100μM PMSF,1μg/ml CLAP)に対して透析を行った。 ラット由来FEATタンパク質の精製 ラットの肝臓の細胞質抽出物(6匹のWisterラットから採取して、100,000xgで遠心した上清のうち4g)を陽イオン交換クロマトグラフィー(SP−セファローズFF;GE Healthcare Bio−Sciences)、硫安分画、疎水性相互作用クロマトグラフィー(フェニルセファローズHP;GE Healthcare Bio−Sciences)、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィー(DE52;Whatman,GE Healthcare Bio−Sciences)、金属キレートクロマトグラフィー(亜鉛)(HiTrap chelating,FPLC;GE Healthcare Bio−Sciences)及びゲルろ過(Superdex 200,FPLC;GE Healthcare Bio−Sciences)の順に精製した。 上記の各精製工程で得られた分画は、脱塩カラム(Econo−Pac 10DGカラム又はBio−Spinクロマトグラフィーカラム;Bio−Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA)にアプライして、溶媒をKPMバッファーに交換した。各分画を、Hisタグ化カスパーゼ3及びカスパーゼ6、単離した核(Lazebnik,Y.A.et al(1993)J.Cell Biol.123,7−22)及びATP再生系(ATP regeneration system)(Takahashi,A.et al(1997)Exp.Cell Res.231,123−131)と共に37℃で2時間インキュベートした。核を1μg/mlの4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)で染色し、蛍光顕微鏡(Olympus,東京、日本)を用いて形態を観察した。 また、各分画に含まれるタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動(SDS−PAGE)(BIO CRAFT,東京、日本)で分離し、2D silver staining kit II(Daiichi Pure Chemicals,東京、日本)を用いて染色した(図1A、上段パネル)。 精製したタンパク質をSDS−PAGEで分離し、フッ化ポリビニリデン(PVDF)膜(ProBlott;Applied Biosystems,Lincoln Centre Drive Foster City,California)に転写し、0.2%Ponceau S及び1%酢酸で染色した。これを切り取ってトリプシン消化した後に質量分析を行った。タンパク質は、マイクロシークエンスに十分な量を回収できていないことが分かった。収量を増加させるため、上記の精製工程を以下のように変更する工夫を加えた。 陽イオン交換クロマトグラフィー(SP−セファローズFF)、硫安分画、陰イオン交換クロマトグラフィー(DE52)、再度の陽イオン交換クロマトグラフィー(SP−セファローズHP,FPLC;GE Healthcare Bio−Sciences)、及びゲルろ過(Superdex 200,FPLC)。このように精製工程を変更することにより、精製タンパク質を複数種類の内部オリゴペプチドとしてマイクロシークエンスすることができた。 ヒトFEAT cDNAのクローニング Jurkat T細胞、KB上皮がん細胞及びHeLa細胞からRNAを回収した。ヒトFEATのexpressed sequence tag(EST)の配列に基づいて作製したプライマーを用いて、逆転写PCR反応(RT−PCR)を行った。全ての細胞株で検出された2.5kbのcDNA断片を、サブクローニングし、シークエンスした後に[ 32 P]−ラベルプローブとして用いて、ヒト皮膚λZAP II cDNAライブラリー(Stratagene,La Jolla,CA)(Takahashi,K.et al(1994)J.Cell Biol.127,505−520)に対して製造元の使用説明に基づいてスクリーニングを行った。 抗体の作製 プラスミドpET−16b(Novagen,Merck KGaA)にコードされるHisタグ化FEATアミノ末端(N末端)タンパク質(第1−274番目のアミノ酸(aa)配列;His−FEATΔC)及びHisタグ化カルボキシル末端(C末端)タンパク質(第288−699番目アミノ酸配列;His−FEATΔN)を、大腸菌BL21(DE3)pLys株(Novagen,Merck KGaA)にて発現させた。発現タンパク質を、Ni 2+ −NTAカラム(Qiagen)を用いて、製造元の使用説明に従って変性条件下で精製した。精製したタンパク質をPBSで希釈し、これをウサギに注射した。ウサギの抗血清を、His−FEATΔCタンパク質及びHis−FEATΔNタンパク質を用いてアフィニティー精製した(Operon Biotechnologies,東京、日本)。 トランスフェクション 哺乳動物細胞発現プラスミドを、FuGENE6(Roche,Indianapolis,Indiana)を用いて、COS−7、293、HeLa又はMCF−7の各細胞にトランスフェクトした。また、同プラスミドを、DMRIE−C(Roche)を用いて、Karpas299細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは、トランスフェクション試薬の製造元の使用説明に従って行った。 免疫沈降 以下の全ての工程は、4℃で行った。1mM PMSF、1%(v/v)アプロチニン及び1μg/ml CLAPを添加したTNEバッファー(10mM TrisHCl(pH7.8),150mM NaCl,1% NP−40,1mM EDTA)で15分間かけて溶解させ、15000rpmで30分間遠心した。上清に各抗体を添加して30分間インキュベートした。TNEバッファーで平衡化させておいてProtein Gセファローズ(GE Healthcare Bio−Sciences)を添加し、得られた混合物を2時間ローターで混和させた。ビーズをTNEバッファーで3回洗浄した。ビーズを95℃のSDS−PAGE用サンプルバッファー中に3分間インキュベートすることにより、ビーズに結合したタンパク質を溶離させた。 メチル基転移酵素活性アッセイ プラスミドpcDL−SRα−myc及びpcDL−SRα−HAを用いて、Mycタグ化又はHAタグ化したヒト由来のFEAT、FEATΔC及びFEATΔNをCOS−7細胞中で過剰発現させ、抗ヒトc−Mycモノクローナル抗体(9E10;sc−40:Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)及び抗HAモノクローナル抗体(Y−11;sc−805:Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)を用いて免疫沈降を行った。免疫沈降物をメチル基転移酵素バッファー(25mM TrisHCl,pH7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,1mM EGTA)で平衡化させた。Hisタグ化FEAT及びFEAT変異体をコードするpET−16bプラスミドを含む大腸菌BL21(DE3)pLys株を1mM IPTGの存在下で16℃で16時間でインキュベートして発現を誘導し、発現タンパク質をNi 2+ −NTAカラム(Qiagen)を用いて、製造元の使用説明に従って変性条件下で精製した。次に、精製タンパク質を透析バッファー(50mM リン酸バッファー(pH7.4),50mM NaCl,10%グリセロール,5mM DTT)に対して透析した。 健康な成人ボランティアから採取した末梢血から、先の文献(Takahashi,A.et al(1992)Eur.J.Haematol.48,196−201)の記載に沿って、Percoll(GE Healthcare Bio−Sciences)を用いて単核球を単離した。Jurkat細胞、Karpas299細胞及びヒト末梢血単核球を溶解バッファー(25mM TrisHCl(pH7.5),0.1% NP−40,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM PMSF,1%(v/v)アプロチニン,1μg/ml CLAP)で溶解したものを基質として使用した。組換えFEAT(80ng/μl)、免疫沈降FEAT又はその変異体を、メチル基転移酵素バッファー中で細胞溶解物(1μl当たり4μgのタンパク質を含む)及び5nCi/μl[ 14 C]−S−アデノシルメチオニンと混合し、37℃で60分間インキュベートした。放射性同位体標識メチル化タンパク質を12.5% SDS−PAGEで分離し、イメージアナライザー(Fuji Photo Film Co.,Ltd.,東京、日本)を用いて可視化した。 スペルミン/スペルミジン合成活性 大腸菌BL21(DE3)pLys株を、1mM IPTGで37℃にて4時間又は16時間処理することにより、pET−16bプラスミドにコードされるHisタグ化FEAT及びその変異体の発現を誘導した。大腸菌におけるスペルミン及びスペルミジンの生成量を測定するため、スペルミン/プトレシン比及びスペルミジン/プトレシン比を測定した。in vitroでのスペルミン及びスペルミジン合成酵素活性を測定するため、組換えFEAT(30μg/ml)、免疫沈降FEAT又はその変異体を、1mM プトレシンジヒドロクロリド(Wako Pure Chemical Industries,大阪、日本)及び0.2mM 脱カルボキシル化S−アデノシルメチオニン(Department of Pharmaceutical Sciences,Josai University,Saitama,JapanのDr.Akira Shirahataから提供)を添加した反応バッファー(100mM Tris HCl(pH7.5),5mM DTT,1mM EDTA,1mM EGTA)と混合し、37℃で30分間インキュベートした。5%(w/v)トリクロロ酢酸を添加して反応を停止させた。サンプルを14000rpm、4℃で10分間遠心し、上清をスペルミン及びスペルミジンについて解析した。ポジティブコントロールとしてNicotiana sylyvestris由来のスペルミジン合成酵素(cDNAは、Division of Molecular Biology,Nara Institute of Science and Technology,Nara,JapanのDr.Takashi Hashimotoから提供)を用いた。 ユビキノン生合成の酵母相補性試験 N末端にSAM結合モチーフを有することは、ユビキノン合成酵素にも共通する特徴であるので、ヒトFEATをコードする2.6kbの完全長cDNA若しくはオープンリーディングフレーム(ORF)又はFEATΔCのcDNAをpENTR3Cベクター(Invitrogen Corp.,Carlsbad,California)にサブクローニングした。GatewayクローニングシステムのリーディングフレームカセットAが酵母発現用プラスミドpDR196(Rentsch,D.et al(1995)FEBS Lett.370,264−268)のSmaI部位に組み込まれたpDR196GWベクター(Carnegie Institution,Washington DCのDr.W.Frommerから提供)とLR組換えすることにより、pDR196GW−FEAT(full−length)、pDR196GW−FEAT(ORF)及びpDR196GW−FEATΔCのプラスミドを作製した。これらのプラスミドは、酵母内で強力な恒常的遺伝子発現を可能にする細胞膜ATPase1プロモーターの制御下でFEAT又はFEATΔCをコードするものである。これらのプラスミドを、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303−1A−Δcoq5株(University of California,Los Angeles,CaliforniaのDr.C.F.Clarke及びDr.P.Ginからの提供)に導入した。同株は、COQ5遺伝子が破壊されている(Barkovich,R.J.et al(1997)J.Biol.Chem.272,9182−9188)。 上記FEAT発現ベクターを導入した酵母株を、中間対数期(OD 600 ~2.0)に達するまでSD(−ウラシル)液体培地中で培養した。次いで、この培養物5μlを、唯一の炭素源としてグルコース(コントロール)又はグリセロールのいずれかを含む基礎培地を含有するSD(−ウラシル)アガープレート上にスポッティングした。ユビキノンは、非発酵性炭素源を消費する必要があるため、C−メチル基転移酵素活性を欠損した出芽酵母ΔCOQ5株は、グリセロールプレート上では、増殖障害を示す。これらのプレートを30℃で24時間(グルコース)又は48時間(グリセロール)インキュベートし、グリセロールプレート上での増殖能の回復を指標としてCOQ5遺伝子の相補性を評価した。 上記相補性試験のポジティブコントロールとして、COQ5遺伝子を発現する酵母を以下の手順で作製した。RNeasy Plant Mini kit(Qiagen)を用いて野生型出芽酵母(W303−1A株)からtotal RNAを抽出した。2.0μgのtotal RNAとSuperscript III RNase H − (Invitrogen)とを用いて、逆転写反応を行った。得られたcDNA、KOD−Plus−DNAポリメラーゼ(TOYOBO Co.,Ltd.,大阪、日本)及び以下のプライマーを用いて、COQ5遺伝子のコード領域をPCR増幅した。 上記プライマーの下線部は、それぞれKpnI及びXhoI認識部位である。得られたPCT産物(924bp)をpENTR3CベクターにサブクローニングしてpENTR3C−COQ5を作製した。次に、pENTR3C−COQ5をpDR196GWとのLRれコンビネーションに用いて、pDR196GW−COQ5を作製した。 ウェスタンブロッティング 氷上で細胞を氷温の10%(w/v)トリクロロ酢酸/PBSに30分間浸して固定した。15000rpm、37℃にて5分間遠心した後、150mM TrisHCl(pH8.8)を添加したSDS−PAGEサンプルバッファーにペレットを再懸濁し、95℃で3分間インキュベートした。以下の全ての工程は室温で行った。 SDS−PAGEで分離したタンパク質は、NA−1512 semidry electric transfer apparatuses(Nihon Eido,Tokyo,Japan)及びトランスファーバッファー(175mM Tris,1.344 M glycine,and 5% methanol)を用いて、180mAで45分間かけてImmobilon−P PVDF膜(Millipore,Billerica,Massachusetts)に転写した。膜をブロッキングバッファー(PBS、0.1% Tween−20(Bio−Rad)、5%脱脂粉乳(Difco Skim Milk;Difco Laboratories,BD Biosciences,San Jose,California))で15分間ブロッキングし、次いで、1次抗体を含むブロッキングバッファーで45分間インキュベートすることで染色を行った。PBS/0.1% Tween−20(PBS−Tween)で5分間の洗浄を3回行い、ブロッキングバッファーで1:10000希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合2次抗体(ヒツジ由来抗ウサギIgG(sc−2004:Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,California)又は抗マウスIgG(sc−2005:Santa Cruz Biotechnology))と15分インキュベートして、膜をプローブした。膜に対し、PBS−Tweenで5分間の洗浄を4回行い、ECL detection system(GE Healthcare Bio−Sciences)を用いて可視化した。 用いた1次抗体は、以下の通りである:抗アクチン抗体(A5060;Sigma);抗ヒトc−Myc抗体(Anti−Myc Tag,06−549;Upstate,Millipore)。 INSTA−Blot membrane(IMB−105)(IMGENEX,San Diego,California)は、以下のヒト細胞株の細胞溶解物を含む(1レーン当たり10μgのタンパク質量):HeLa(子宮頸癌)、Jurkat(T細胞白血病)、Daudi(Burkittリンパ腫)、293(5型アデノウィルスで形質転換した胎児腎臓細胞)、Rh30(横紋筋肉腫)、A375(悪性メラノーマ)、T98G(グリオブラストーマ)、HCT−116(大腸癌)、Hep−2(咽頭癌)。Multiple Tissue Blot(ヒト)(WB46)及びHuman Tumor Tissue Blot(WB51)は、Calbiochem(Merck KGaA)から購入した。WB46は、種々の正常組織に由来するタンパク質を含む(1レーン当たり75μgのタンパク質量)。WB51は、以下の癌細胞に由来するタンパク質を含む(1レーン当たり50μgのタンパク質量):卵巣間質肉腫(ovary stromal sarcoma)、肺腺癌、肝細胞癌、直腸腺癌、頸部扁平上皮癌、皮膚悪性メラノーマ、精巣胚性癌腫、濾胞性甲状腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、咽喉頭扁平上皮癌、乳管癌、前立腺肥大、膵臓腺癌。 カスパーゼ切断部位の決定 カスパーゼは、一般的には基質のアスパラギン酸残基のカルボキシル側を切断することが知られている(Earnshaw,W.C.et al(1999)Annu.Rev.Biochem.68,383−424)。pBluescript SK(−)プラスミド(Stratagene)に挿入したFEAT cDNAにコードされる、切断項部位候補となるアスパラギン酸を、GeneEditor in vitro Site−Directed Mutagenesis System(Promega,Madison,Wisconsin)を用いてアラニンに変異させた。cDNAのin vitroでの転写/翻訳は、TNT T7/T3 Coupled Reticulocyte Lysate System(Promega)及びTran 35 S−label(MP Biomedicals,Irvine,California)を用いて行った。[ 35 S]−標識組換え野生型又は変異型FEATタンパク質を、精製した組換えカスパーゼ−3と共に37℃で2時間インキュベートし、生成物をSDS−PAGEで分離し、autoradiographyで可視化した。 悪性リンパ腫細胞株のRT−PCR解析 悪性リンパ腫患者からは、以下の細胞株が樹立されている(Akasaka et al.,1996):Satoh(風土病性Burkittリンパ腫細胞株)、KS−Bu3(散発性Burkittリンパ腫細胞株)、DL−4(t(8;14)転座を有するDLBL細胞株)、KIS−1(t(9;14)染色体転座を有するDLBL細胞株)、Yoshikawa(精巣DLBL細胞株)、Muranaka(T細胞リンパ腫細胞株)、Karpas(t(2;5)染色体トランスロケーションを有するALCL細胞株)、DLBL(びまん性巨大B細胞リンパ腫(diffuse large B−cell lymphoma))、ALCL(未分化巨大細胞リンパ腫(anaplastic large cell lymphoma))。 TRIzol(Invitrogen)を用いてtotal RNAを単離した。Superscript II reverse transcriptase(Invitrogen)及びオリゴ(dT)プライマーを用いてcDNAの1stストランドを合成した。KOD Dash DNA polymerase(TOYOBO)及び以下のプライマーを用いてPCR反応を行った: Enhanced Green Fluorescent Protein(EGFP)発現細胞におけるアポトーシス性DNA切断の解析 細胞に野生型FEAT若しくは変異型FEATタンパク質をコードするプラスミド及びpEGFP(Clontech Laboratories,Inc.,Takara Bio Inc)をコトランスフェクトし、スタウロスポリン(STS)(Sigma)で処理した。断片化DNA含有を有するEGFP発現アポトーシス細胞を、Lamm et al.,1997の記載に沿って定量した。即ち、細胞を、穏やかな固定溶液(2%パラホルムアルデヒド、100mM NaCl、300mMスクロース、3mM MgCl 2 、1mM EGTA、10mM PIPES(pH7.0))を用いて室温で30分間固定し、次いでエタノール固定を行い、ヨウ化プロピジウム(PI:Calbiochem,Merck KGaA)染色し、フローサイトメトリー解析を行った。 好中球の単離、タンパク質導入及び自発的アポトーシスの解析 Takahashi,A.et al.((1992)Eur.J.Haematol.48,196−201)の記載に沿って、two−step Percoll濃度勾配による分離(GE Healthcare Bio−Sciences)を行い、健康な成人ボランティアから採取した末梢血から好中球を単離した。Hisタグと野生型又は変異型FEATタンパク質のN末端との間に、タンパク質を細胞膜透過性に変化させるPTD−4配列(YARAAARQARA:配列番号15)(Ho,A.et al(2001)Cancer Res.61,474−477)を導入した。好中球は、10%ウシ胎児血清(FBS)(GIBCO,Invitrogen)、50unit/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン(GIBCO,Invitrogen)を補充したRPMI−1640(Sigma)培地(FBS−RPMI)に懸濁し、1μMの精製タンパク質で37℃にて15分間処理した。その後、細胞をFBS−RPMIで希釈し、37℃で24時間インキュベートした。細胞をFITC結合annexin V及びPI(ApoAlert annexin V Apoptosis Detection kit,Clontech Laboratories,Takara Bio)で染色し、断片化DNA含有細胞の量をフローサイトメトリー解析することにより好中球のアポトーシス率を測定した。 RNA干渉(RNAi). pMuniH1プラスミドは、Dr.Arasambattu K.Munirajan(University of Madras,Teramani,India)から提供して頂いた。pMuniH1プラスミドには、H1 RNAプロモーターにより発現されるshort hairpin RNA(shRNA)とネオマイシン選択マーカーがコードされている。Ui−Tei,K.et al.((2004)Nucleic Acids Res.32,936−948)に記載される基準に沿って、FEAT cDNAのうちRNAiに適切な部位を選択した。選択の結果、ORF内の第183、259、1385、1550、1634、2056番目を始点とする21塩基対を標的とするオリゴヌクレオチドを合成し、pMuniH1にライゲーションした。shRNAプラスミドを、Mycタグ化FEATをコードするプラスミドと共にHeLa細胞にコトランスフェクションし、各プラスミドによるmyc−FEAT発現の抑制能力を、抗ヒトc−Mycポリクローナル抗体(抗Mycタグ)を用いたウェスタンブロッティングにより評価した。RNAi活性を有するプラスミドを選択してHeLa細胞にトランスフェクトした。400μg/ml G418(Sigma)の存在下で10日間セレクションを行った後にコロニーピックアップを行い、内在性FEATタンパク質の発現が抑制されたクローンのスクリーニングを行った。 免疫蛍光法 特記しない限り、下記の全ての工程は室温で行った。35mmガラス底ディッシュ(Matsunami Glass,大阪、日本)に接着させた細胞を、3.7%ホルムアルデヒド/PBSで10分間固定し、0.5%(w/w)Triton X−100/PBSで30分間透過処理し、次いで、3%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBSでブロッキングした。PBSで洗浄した後、細胞を、3%BSA−PBSで希釈した抗FEATΔN抗体(他のタンパク質と最も交差反応性が低い:図4A及び図5A参照)と1時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、Alexa Fluor 488又は588と結合した抗ウサギ抗体(Molecular Probes,Invitrogen)及び1μg/ml DAPIと1時間インキュベートした。PBSで洗浄した後、ガラス底ディッシュにカバースリップを乗せ、Prolong Gold Antifade Reagent(Molecular Probes,Invitrogen)でマウントした。染色細胞をDM IRE2蛍光顕微鏡(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)で観察し、Leica Q Fluoro software(Leica Microsystems Imaging Solutions,Cambridge,UK)で制御可能なDC 350Fカメラ(Leica Microsystems)を用いて画像撮影を行った。アクチンを可視化させるため、Alexa Fluor 488結合phalloidin(Molecular Probes,Invitrogen)を2次抗体と共に添加した。ミトコンドリアを可視化させるため、生細胞を固定化する前に、Mitotracker Red(Molecular Probes,Invitrogen)と37℃で30分間インキュベートした。小胞体(ER)を可視化させるため、細胞を4%パラホルムアルデヒド/PBSで15分間固定し、0.1% Triton X−100/PBSで10分間透過化させ、ER染色試薬(Subcellular Structure Localization Kit;Chemicon International,Millipore)と37℃で30分間インキュベートした。次いで、ブロッキングを行い、更にFEAT染色を行った。 マイクロアレイを用いた遺伝子発現プロファイリング ヒトFEATのORFのcDNAを、Gatewayクローニングシステム(Invitrogen)のエントリーベクターpENTR3Cにサブクローニングした。pEF−DEST51ベクター(Invitrogen)とのLRリコンビネーションにより、elongation factor 1αプロモーター制御下でFEATが発現されるpEF−DEST51−FEATを作製した。HilyMax(Dojindo Laboratories,熊本、日本)を用いてpEF−DEST51−FEATをNIH3T3細胞にトランスフェクトした。10μg/mlのブラストサイジンS(Kaken Pharmaceutical Co.,Ltd.,東京、日本)の存在下で7日間セレクションを行った後に、コロニーピックアップを行い、FEATタンパク質を過剰発現するクローンを選別した。pEF−DEST51ベクターのccdB遺伝子を切除してpEF−DEST51−ΔccdBプラスミドを作製した。pEF−DEST51−ΔccdBプラスミドを、NIH3T3細胞に安定にトランスフェクトすることで、コントロール細胞株ΔccdB−1、−2及び−3を作製した。 RNeasy Mini kit(Invitrogen)を用いたコントロール細胞並びにFEAT強制発現NIH3T3細胞株(FEAT−3、−15及び−20)からtotal RNAを抽出した。Research Support Center,Graduate School of Medical Sciences,Kyushu Universityが所有するSentrix Mouse WG−6 v2 BeadChip Array(Illumina Inc.,San Diego,CA)を用いて遺伝子発現プロファイルの解析を行った。最初に、BeadStudio 3.0softwareを用いて遺伝子発現の生データを正規化した。検出p値>0.01(Illumina replicate gene probeに基づく)の平均シグナルは、解析から除外した。以下のURLから入手可能なソフトウェアを用いてGene Set Enrichment Analysis(GSEA)を行った。 http://www.broadinstitute.org/gsea/ FEATトランスジェニック(Tg)マウスの作製 全ての動物実験は、千葉県がんセンターの動物実験委員会の承認に基づいて行った。ヒトFEAT ORFのcDNAをpKCR−H−2K d ベクター(Nishi,M.et al(1988)Nature 331,267−269)(Dr.T.Honjo及びDr.I.Chung−Okazaki(Kyoto University,Kyoto,Japan)から提供)のBamHI部位に挿入した。Nagy,A.,Gertsenstein,M.,Vintersten,C.,and Behringer,R.eds.((2003).Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual.,3rd Edition(CSH Laboratory Press))の記載に従って、H−2Kd(MHCクラスI)プロモーター、FEAT ORF、βグロビンのイントロン及びSV40ポリ(A)シグナルを含むKpnI/SphI断片を精製した。 Tgマウス及び同腹のトランスジーン陰性マウス(非トランスジェニック:non−Tg)は、千葉県がんセンター研究局のSPF(specific pathogen free)動物施設で飼育した。メスのTgマウスの子孫は殆ど生まれてくることがなく、ホモ接合Tgマウスを作製することはできなかった。従って、オスのTgマウスを正常メスC57BL/6マウス(Charles River Laboratories,Inc.,Wilmington,Massachusetts)と交配させることにより、Tgマウス系統を維持した。マウスは、定期的に腫瘍及び他の疾患の兆候について検査した。腫瘍を患ったマウス又は瀕死状態のマウスは、楽死させて死体解剖を行った。Tgマウスの副睾丸から精子を回収し、九動株式会社(鳥栖、日本)に凍結保存を委託した。 マウス臓器内でのタンパク質発現 6ヶ月齢のTgマウス及びnon−Tg同腹子を二酸化炭素で安楽死させた後に解剖した。各臓器を液体窒素で凍結させ、ハンマーで破砕した。破砕した組織をRIPAバッファー(50mM TrisHCl(pH7.4),150mM NaCl,1%(v/v)NP−40,1%デオキシコレート(Sigma)、0.05%SDS)に懸濁し、液体窒素と氷上での凍結融解を3回繰り返すことで完全に溶解させた。15000rpm、0℃で10分間遠心して上清を回収した。抽出物に含まれるタンパク質の濃度をBio−Rad Protein Assay kit(Bio−Rad)を用いて測定し、SDS−PAGEミニゲルに1レーン当たり30μgの総タンパク質量となるようにサンプルをローディングし、これを抗FEATΔN抗体でウェスタンブロッティングした。 マウス胸腺細胞のアポトーシス性細胞死 胸腺を切除して、37℃にて10%FBSを添加したRPMI−1640培地(Sigma)と共に1ml滅菌シリンジを用いて粉砕することにより胸腺細胞を単離した。次いで、5% CO 2 インキュベーターで、細胞をFasリガンド(rhsSuperFasLigand:Alexis,Lausen,Switzerland)又はデキサメタゾン(Nacalai Tesque,京都、日本)のいずれかで処理するか、あるいは未処理で維持した。細胞をannexin V−CFS(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,Minnesota)及びPIで染色し、次いでフローサイトメトリー解析することにより、細胞死を測定した。 マウス組織の顕微鏡解析 マウスの各臓器を切除した後、3.7%ホルムアルデヒド/PBSで固定し、2mm厚に切り出し、組織カセット(Tissue−Tek Uni−Cassette;サクラファインテックジャパン株式会社、東京、日本)にセットした上で、新たな固定液に浸潤させた。更なる加工及び病理組織学的検討は、奈良病理研究所(奈良、日本)において行った。 固定した組織をエタノールの段階希釈液(20%~100%)及びキシレン溶液を用いて脱水し、自動組織プロセッサーを用いて組織をパラフィン包埋し、マイクロトームで切片化し、脱パラフィン化して、再水和させ、ヘマトキシリン・エオジン染色(H&E)を行った。Autostainer(DAKO,Glostrup,Denmark)を用いて、以下のマーカーについて免疫組織化学染色を行った:CD45R(B220)(B細胞マーカー);CD3(T細胞マーカー)。 免疫組織化学 パラフィン包埋した切片をClear−Advantage(Polysciences,Inc.,Warrington,Pennsylvania)で脱パラフィン化し、再水和させ、Citrate−based Antigen Unmasking Solution(Vector Laboratories Inc.,Burlingame,California)で処理し、ImmPRESS kit(Vector Laboratories)及びImmPACT Chromogen(Vector Laboratories)を製造元の使用説明に従って用いて染色を行った。スライドをMayer’s Hematoxylin(Merck KGaA)で対比染色し、Gel/Mount aqueous mounting medium(Biomeda,Corp.,Foster City,California)を用いてカバースリップをマウントした。 以下の1次抗体を用いた:抗アルブミン・ウサギポリクローナル抗体(A0001;DakoCytomation Denmark A/S,Glostrup,Denmark)、抗prosurfactant protein C(proSP−C:2型肺胞上皮細胞のマーカー)ウサギポリクローナル抗体(AB3786;Chemicon International,Millipore);抗αフェトプロテイン(AFP)マウスモノクローナル抗体(AB3786;Vector Laboratories)及び抗βカテニン・マウスモノクローナル抗体(610153;BD Transduction Laboratories,BD Biosciences)。 MDM2は、抗MDM2マウスモノクローナル抗体(sc−965;Santa Cruz Biotechnology)、M.O.M immunodetection kit(Vector Laboratories)及びDABペルオキシダーゼ基質溶液(Vector Laboratories)を用いて染色した。抗FEATΔN抗体及び抗FEATΔC抗体は、それぞれ、FEATタンパク質の別の部位を認識する抗体であり、そのエピトープは、重複しない。これらの抗体で染色を行った結果、マウスの脳及び精巣において同一の領域が染色され、FEAT染色の特異性が示唆された。 アレイCGH用のゲノムDNAの調製 Tomioka et al.,2008の記載に沿って、マウス組織からゲノムDNAを調製した。即ち、2mlマイクロチューブ内で粉砕した組織を1mlの氷冷TENバッファー(50mM TrisHCl(pH8.0),1mM EDTA,pH8.0,100mM NaCl)に懸濁し、50μlの10% SDSと共に穏やかに撹拌した。20mg/mlのプロテイナーゼKを25μl添加し、組織を50℃で一晩インキュベートした。次に、1ml TE飽和フェノール(NIPPON GENE Co.,Ltd.,東京、日本)を添加し、サンプルを室温にて1時間ローターで混和した後に8000rpm、15℃で15分間遠心して水層を回収した。上記のフェノール抽出を繰り返した後、水層を回収し、1mlのクロロホルムイソアミルアルコールを添加した。混合物を室温にて1時間ローターで混和し、3000rpm、15℃で10分間遠心して水層を回収した。事前に−20℃に冷却しておいたエタノールを2ml添加し、穏やかに撹拌するとゲノムDNAの沈殿が生じた。パスツールピペットを用いてこの沈殿物を1mlの70%エタノールの入った1.5ml微小遠心管に写し、15000rpm、4℃で5分間遠心した。ペレットを200μlのTEバッファー(10mM TrisHCl(pH8.0),1mM EDTA)で再懸濁し、ローターで室温にて一晩混和させて溶解させた。DU 800 spectrophotometer(Beckman Coulter,Inc.,Fullerton,California)を用いて260nm吸光度を測定してDNA濃度を測定した。DNAの純度は、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含有する0.8%アガロースゲルを用いて200ngのDNAを電気泳動することにより評価した。スメアの生じなかったDNA試料のみを次の工程に用いた。 アレイ−CGH アレイ−CGH用の244kスライドフォーマット60−merオリゴヌクレオチドマイクロアレイ(Agilent Mouse Genome CGH Microarray Kit 244A)に対し、以下のDNAを用いてDNA標識及びハイブリダイゼーションを行った:マウス肝細胞癌由来ゲノムDNA(実験サンプル);正常C57BL/6マウス肝臓由来ゲノムDNA(対照サンプル)。Agilent Technologies社(Santa Clara,California)の使用説明に従い、MicroArray Scannerを用いてマイクロアレイをスキャンし、Feature Extractionソフトウェアを用いてデータ抽出を行い、CGH analytics 3.4ソフトウェアを用いてデータ解析を行った。 組織アレイ ホルマリン固定パラフィン包埋された種々の正常組織及び腫瘍組織断片スポットされた組織アレイ(Blow,2007)をUS Biomax,Inc.(Ijamsville,Maryland)から購入した。以下のマイクロアレイを用いた:MC5001(複数器官の癌及び正常組織の高密度マイクロアレイ);BR721(同一個体の癌隣接正常組織及び正常組織コントロールを含む乳癌組織マイクロアレイ;BC05021(大腸腺癌(悪性及び正常試料の組み合わせ);LV803(肝臓癌(癌組織、癌隣接組織及び正常組織の組み合わせ)。 マウス肝細胞癌におけるp53及びβカテニンの変異の解析 RNeasy Mini kit(Qiagen)を用いて切除直後のマウス肝細胞癌組織からtotal RNAを単離した。KOD−Plus−DNAポリメラーゼを用いてPCRを行った。p53のORFの増幅には、以下の2セットのプライマーを用いた: 増幅産物に対しダイレクト・シークエンスを行った。さらに遺伝子変異の確認を行うため、ゲノムDNAと以下のプライマーセットを用いてマウスp53遺伝子のシークエンスを行った: KOD−Plus−DNAポリメラーゼ、アレイ−CGH用に調製した肝細胞癌ゲノムDNA及び以下のプライマーセットを用いてマウスβカテニン遺伝子のエキソン1~3の領域をPCR増幅した。この領域に含まれるエキソン2は、変異が頻繁に生じるホットスポットである(de La Coste,A.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,8847−8851)。 さらにKOD−Plus−DNAポリメラーゼと以下のプライマーを用いてNested PCRを行った: 得られた増幅産物に対し、ダイレクト・シークエンスを行った。 統計解析 Microsoft ExcelのアドインパッケージであるStatcel2(オーエムエス出版、所沢、日本)を用いて統計解析を行った。 <2.実験結果> FEATタンパク質の生化学的精製 無細胞系を用いた核アポトーシスの制御分子の解析から、活性分画の中央においてアポトーシス促進活性の減弱が見られると共に、見かけの分子量がそれぞれ74kDa及び66kDaの2種類のペプチドが出現していることを見い出した(図1A)。これらのペプチドを精製したところ、66kDaのタンパク質は、SWAP−70と呼ばれるB細胞のアポトーシスを制御する分子であった。74kDaのタンパク質は、「comparative gene identification−01(CGI−01)」(Lai,C.H.et al.,(2000)Genome Res.10,703−713)、「KIAA0859」又は「methyltransferase like 13(METTL13)」と呼ばれるタンパク質のラットホモログであることが判明した。その発現パターン及び機能から、「FEAT」(faint expression in normal tissues,aberrant overexpression in tumors)と命名した。 FEATは、S−アデノシルメチオニン結合モチーフ(SAM結合モチーフ)を2つ含んでいる。SAM結合モチーフは、メチル基転移酵素及びその関連酵素に特徴的なモチーフである(Kagan,R.M.,and Clarke,S.(1994)Arch.Biochem.Biophys.310,417−427)。種間においてFEATの構造は高度に保存されている(図1B)。図1Bに示すアライメントの上部の棒線I、postI、II及びIIIは、SAM結合モチーフを示す。また、アライメント上の矢印は、カスパーゼ3の切断部位を示す。アライメントは、ClustalW及びBoxshadeソフトウェアを用いて作製した。 完全長又は切断型のいずれのタイプのFEATタンパク質においても、タンパクメチル基転移酵素活性又はスペルミジン/スペルミン合成活性は認められなかった(データ非公開)。酵母を用いた相補性試験では、FEATは、ユビキノン合成酵素ではないことが示唆された(図1C)。 カスパーゼ3によるFEATの切断 スタウロスポリン(STS)でCOS−7細胞のアポトーシスを誘導したところ、トランスフェクションで発現させたFEATが切断されていた(図2A)。in vitroで転写/翻訳されたFEATは、カスパーゼ3では切断されたが、カスパーゼ6では切断されなかった(図2B)。カスパーゼ3欠損のMCF−7細胞では、FEATは殆ど切断されていなかったが、プロカスパーゼ3を共発現させると、FEATは効率的に切断された(図2C)。部位特異的変異導入試験を行い、ヒトFEATタンパク質のカスパーゼ切断部位を同定した(図2D)。Fas及びSTSでアポトーシス誘導したJurkatT細胞では、内在性FEATは切断されていた(図2E)。これらの結果から、FEATは、アポトーシス細胞死においてカスパーゼ3によって切断されることが示された(図2F)。 FEATによるアポトーシス細胞死の抑制 ヒトFEAT遺伝子は、染色体の1q24.3に位置するが、この部位は、悪性リンパ腫において高頻度で増幅されており、予後不良と関連している。リンパ腫細胞株において、FEAT mRNAの発現量は、STS誘導性アポトーシスの抑制と相関していた(図3A)。カスパーゼによる抗アポトーシス性キナーゼ及びホスファターゼの切断により、生存系のシグナルが遮断され、アポトーシス誘導ペプチド断片が生じることにより、アポトーシスが誘導されることが知られている(Kurokawa,M.,and Kornbluth,S.(2009)Cell 138,838−854)。FEAT又はカスパーゼ3により切断されたFEAT断片がアポトーシスに影響するかどうかを確かめるため、カスパーゼ3切断部位に変異を有するFEAT又は有しないFEATをコードするcDNAをKarpas299細胞に導入した。D274A/D288A変異体を発現するKarpas299細胞では、STS誘導性アポトーシスが有意に減少していた(図3B)(Mean±SEM( * ,P<0.01; ** ,P<0.025,n=3;paired t−test))。D274A/D288A変異体に更にD112A変異を導入することにより、D274A/D288A変異体がアポトーシスを抑制する能力が消失した(D112A/D274A/D288A)。これにより、D112が、抗アポトーシス機能に不可欠であることが示唆された。 ウェスタンブロッティングを行ったところ、Karpas299細胞は、内在的にFEATを発現していることが判明した(データ非公開)。FEATを発現しない細胞を探索したところ、殆ど全ての癌由来細胞株はFEATを発現していたため(図4A)、好中球を用いることにした(図4B:急性リンパ性白血病患者から採取した末梢血単球(ALL)及び健常ボランティアから採取した好中球(normal−1~4))。野生型FEAT(FEAT wt)及びFEATΔN(アミノ酸(aa)289−699:カスパーゼ3に切断された断片に相当)のタンパク質導入により、好中球の自発的アポトーシスが有意に抑制された(図4C)(means±SEM; * ,P<0.002,n=9; ** ,P<0.0002,n=9; *** ,P<0.02,n=4; **** ,P<0.02,n=4;paired t−test)。D274A/D288A変異体では、FEAT wt又はFEATΔNと比べてより強力な抑制効果が認められた。一方、FEATΔC(aa 1−274)は、アポトーシスに対する抑制効果が認められないが、FEATΔNの抗アポトーシス効果に干渉することが判明した(図4CのFEATΔN+C)。ショートヘアピンRNAによりFEAT発現をノックダウンしたところ(図3C)、HeLa細胞のSTS誘導性アポトーシスが増加した(図3D)(Mean±SEM( * ,P<0.01; ** ,P<0.025,n=3;paired t−test))。これにより、内在性のFEATによってもアポトーシス細胞死が抑制されていることが示された。一方、FEATをノックダウンしても、細胞周期及び細胞増殖には影響が認められなかった。以上を考慮すると、FEATにはアポトーシス抑制能があり、この抑制能は、カスパーゼがFEATのD274及びD228を切断することにより失われることが導き出される。 図3Aは、リンパ腫細胞株のRT−PCRの結果を示すものであり、この結果は、FEAT発現量が、アポトーシス発生率と逆相関することを示している。 免疫染色を行ったところ、FEATは、びまん性に細胞質、核、及び部分的にERに局在していた(図3E)。PSORT II解析において得られた、34.8%の確率でERに存在するという予測と一致するものであった。FEATは、アクチン及びミトコンドリアとは共局在していなかった(図3E:拡大率x400)。 ヒト癌細胞におけるFEATの発現異常 FEATは、一連のヒトの遺伝子発現のSAGEトランスクリプトーム実験にて使用されるTGACCTCCAGタグ(Velculescu,V.E.et al.(1999)Nat.Genet.23,387−388)に相当することが判明した。TGACCTCCAGタグは、正常組織よりもヒトの大腸癌、脳腫瘍、乳癌、肺癌、メラノーマにおいて発現レベルが上昇している。ヒトの正常細胞をウェスタンブロット解析したところ、FEATは、精巣、脳及び肝臓において弱い発現が見られる程度であった(図5A)。このウェスタンブロット解析の結果は、メッセンジャーRNAの発現と一致している(Lai,C.H.et al.,(2000)Genome Res.10,703−713)。正常細胞とは対照的に、殆どの種類のヒト癌組織においてFEATタンパク質の中程度~強い発現が観察され(図5B)、FEATが腫瘍発達に関与する遍在タンパク質であることが示された。 腫瘍形成においてFEATが何らかの機能を有するか否かを調べるため、FEATタンパク質の発現量が低いNIH3T3細胞内でFEATを過剰発現させ、マイクロアレイにより転写プロファイルの変化を網羅的に解析した。図5Cにコントロールプラスミド(ΔccdB−1、ΔccdB−2及びΔccdB−3)並びにヒトFEAT cDNA発現プラスミド(FEAT−3、FEAT−15及びFEAT−20)が導入されたNIH3T3細胞の抗FEAT抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す。Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)(Subramanian,A.et al.(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102,15545−15550)を行ったところ、FEATの過剰発現に伴って、チロシンキナーゼ受容体(receptor tyrosine kinase:RTK)及びHedgehogシグナル経路のシグナルの上昇が認められた(図5D(左パネル、エンリッチメントプロット;右パネル、ヒートマップ)及び表1)。これらのシグナル経路は、腫瘍の発生及び維持に重要な役割を果たすことが知られている(Vogelstein,B.,and Kinzler,K.W.(2004)Nat.Med.10,789−799;Rubin,L.L.,and de Sauvage,F.J.(2006)Nat.Rev.Drug Discov.5,1026−1033)。これらの結果は、FEATが、腫瘍促進タンパク質としてのポテンシャルを有することを示唆している。 図5Dは、ヒトFEAT cDNAをトランスフェクトされたNIH3T3細胞のゲノムワイド発現プロファイルのGSEA解析結果を示す。図5Dの左パネル及び右パネルは、それぞれエンリッチメントプロット及びヒートマップを示し、これらには、エンリッチメントスコア(enrichment score:ES)>0.5及びフォルスディスカバリーレート(false discovery rate:FDR)q−value<0.25の遺伝子セットがリストされている。 FEATの上方制御によるin vivoでの腫瘍形成促進性 FEATの発現量の上昇の腫瘍形成への寄与を評価するため、ヒトFEATを発現するトランスジェニック(Tg)マウスを作製した(Hanahan,D.et al(2007)Genes Dev.21,2258−2270)。ヒトFEATは、種々のヒト組織で活性を示すプロモーターの制御下で発現させた。Tgマウスは、メンデルの法則に従った比率で出生した。新生Tgマウスの約15%に先天性の白内障が認められたこと以外は、月齢9ヶ月に成長するまで他の器官は正常に発達し、組織学的にも異常は認められなかった。初代Tgマウス6匹のうち、1匹のメス(ライン10)及び一匹のオス(ライン14)については、複数の正常C57BL/6マウスと交尾させたところ、生殖能を有していないものと判断した。1匹の初代Tgオスマウス(ライン23)の1世代目の子孫、及び1匹の初代Tgオスマウス(ライン18)の2世代目の子孫は、生殖能を有していなかった。 2世代目Tgマウス(ライン1、16及び18)の精子を顕微鏡観察したところ、同腹の非トランスジェニック(non−Tg)マウスと比べて精子の運動性が低下していた。ウェスタンブロット解析では、Tgマウスの胸腺、脾臓、肝臓及び肺においてヒトFEATの発現が認められた(図6A:左パネル、non−Tgマウス;右パネル、Tgマウス)。Tgマウス由来の胸腺細胞では、Fasリガンド誘導性細胞死及びグルココルチコイド誘導性細胞死が有意に減少しており(図6B)(Fasリガンド(左パネル);means±SEM、 * ,P<0.025; ** ,P<0.05; *** ,P<0.025,n=5;paired t−test:デキサメタゾン(右パネル);means±SEM、 * ,P<0.04; ** ,P<0.05,n=6;paired t−test))、Tgマウス内でのFEATの発現により、アポトーシスが抑制されたことが示された。初代、第1世代及び第2世代FEAT Tgマウスに発生した腫瘍を図6Cに示す(HCC:肝細胞癌)。 Tgマウスが月齢12ヶ月に達すると、肝臓内で肝細胞癌(hepatocellular carcinoma:HCC)(図7A:矢印)及び悪性リンパ腫の発生が観察され始めた(図7C:矢印)。対照的に、同腹のnon−Tgマウスでは、肝細胞癌の発症は認められず、リンパ腫についても、非常に低い発症率(18%、17匹中3匹)しか認められなかった。従って、Tgマウスは、同腹のnon−Tgマウスと比べて腫瘍を形成しやすいか、あるいは寿命が短かった(図8A:Tgマウス(赤線:n=40)及び同腹non−Tgマウス(青線:n=17)の非担癌生存率(tumor−free survival)のKaplan−Meierプロット(P<0.04,log−rank test))。Tgマウスの肝細胞癌及びリンパ腫は、4匹の異なる初代Tgマウスの子孫(ライン)において観察された(図6C)。このことは、内在性の癌遺伝子に導入遺伝子が挿入されて活性化された結果として腫瘍が形成されたという可能性を否定するものである。肝細胞癌は、ヒトにおいて男性に頻繁に発症するが(Naugler,W.E.et al.,(2007)Science 317,121−124)、マウスにおいても同様の傾向が認められた(図6C)。ヒトの肝細胞癌と同様、殆どのマウス肝細胞癌は、高分化腫瘍であった(図8Bの上段パネル)。また、マウス肝細胞癌では、明細胞型(図8Bの左下段パネル)及び細胞質封入体(図8Bの右下段パネル)といった変異型も観察された。2匹の肝細胞癌マウスでは、肺への転移も観察された(図8C)。殆どのリンパ腫は、胚中心芽球性(centroblastic)又は免疫芽球性(immunoblastic)のびまん性B細胞リンパ腫及び、いわゆる“星空像(starry−sky appearance)”を示すBurkitt様B細胞リンパ腫に属するものであった(図9A)。いずれの変異型もCD45R(B220)を発現し(100%,15匹中15匹)(図9Aの挿入図)、イムノグロブリン遺伝子のクローン性再構成を示した(83%、6匹中5匹)。これらの特徴は、ヒトのリンパ腫患者に最もよく見られるB細胞型リンパ腫の特徴と一致する。実験に用いたリンパ腫のいずれもCD3陽性を示さなかった(0%、7匹中0匹)。巨細胞を伴うCD45R及びCD3陰性の変異型も観察された(図9B)。これらのリンパ腫は、浸潤性が強く、高頻度で膵臓に浸潤していた(図9C)。2匹のマウスは、リンパ腫及び肝細胞癌の両方を患っており(図9D)、そのうち1匹は肺腺癌も患っていた(図9E)。肝細胞癌で発現するFEAT導入遺伝子をシークエンスしたところ、突然変異は認められなかった(0%、5匹中0匹)。このことは、腫瘍形成において、FEATの構造変化が必要とされないことを示している。CF−1及びC3H純系マウスとは異なり、C57BL/6純系マウスでは肝細胞癌は殆ど発症しないことが知られている(Anisimov,V.N.et al.,(2005)Nat.Rev.Cancer 5,807−819)。従って、FEAT Tgマウスは、C57BL/6純系種において肝細胞癌及びリンパ腫の両方を高い浸透度で発症するユニークなマウスモデルである。 肝細胞癌及び悪性リンパ腫を患うFEAT Tgマウスの初代、第1世代及び第2世代マウスの肉眼写真をそれぞれ図7A及び図7Cに示す。図7Aの矢印は、肝臓に発生した腫瘍を示し、図7Cの矢印は、悪性リンパ腫によって腫大した腸間膜リンパ節、縦隔リンパ節及び腋窩リンパ節並びに肝臓及び脾臓を示す。図7Bに示す写真は、精子保存のために解剖した際に偶然初期の肝細胞癌を発見された月齢9ヶ月のオスTgマウス(図8Bの左下段パネル)の写真であり、肝臓に微小な腫瘍(矢印)を有する。これにより、肝臓癌の発生は、月齢12ヶ月よりも早期に起こることが分かった。図7Dは、同じTgマウスに同時に生じたリンパ腫(上段パネル)及び横紋筋肉腫(下段パネル)の顕微鏡写真を示す(H&E染色:x400拡大率)。図7Eは、肝細胞癌を患うTgマウス(赤線)及びリンパ腫を患うTgマウス(青線)の非担癌生存率(tumor−free survival)のKaplan−Meierプロットである。 図10は、マウス染色体のうち、増幅個所(赤色)及び欠失個所(緑色)を示すGraphical Aberrationである。該Graphical Aberrationは、6匹のFEAT Tgマウスの肝細胞癌(HCC)、1匹のTgマウスの正常な肝臓、及び1匹のnon−Tgマウスの正常な肝臓由来のDNAをCGH Analytics 3.4 software(z−score threshold:2.5)(Agilent Technologies)で解析した結果である。 ヒト肝細胞癌モデルとしてのFEAT Tgマウス ヒト癌患者と生理学的及び分子レベルでの特徴が酷似する癌を生じるモデルマウスを用いれば、ヒトの癌の原因を決定し、癌の予防方法を開発し、新たな治療法を開発及び試験することができる。そこで、FEAT Tgマウスの肝細胞癌が、ヒト肝細胞癌と同様の遺伝子変化を有するかどうかを評価した。 マウス肝細胞癌が、ヒト患者と同様の染色体変化を有するかどうかを調べるため、マイクロアレイを用いた比較ゲノムハイブリダイゼーション(array comparative genomic hybridization(array−CGH)、アレイCGH)により、ゲノム領域の増幅(gain)及び欠失(loss)(コピー数変化:copy number alterations(CNA))を解析した。巨視的に、マウス肝細胞癌では、ゲノムの状態が不安定であり、欠失よりも増幅が多く観察された(図10)。この結果は、ヒトの肝細胞癌と類似するものであった(Zender,L.et al.(2006)Cell 125,1253−1267)。一方、肝細胞癌を患っていないTgマウスに由来する肝臓では、著しいコピー数変化は認められなかった。以上の結果から、ゲノムの不安定性は、FEAT導入遺伝子による直接的な影響によるものではなく、肝癌形成過程を通じて生じたものであることが示された。最近の研究において、ヒト乳癌のゲノムでは、3kb~1Mbの微小な領域のタンデム重複が、構造上の変化として共通して観察されることが報告されている(Stephens,P.J.et al.(2009)Nature 462,1005−1010)。今回の高分解能アレイCGHでも、マウス肝細胞癌において、染色体の微小な領域の増幅及び欠失が認められた。微小な領域のコピー数変化には、以下の18種類のがん関連遺伝(http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/)が含まれていた:MDS1,PDGFRA,PIK3R1,JAZF1,WHSC1L1,HOOK3,PCM1,MLLT3,PTEN,CBL,ERCC5,ERCC4,CYLD,CBFB,BRIP1,MLLT1,TMPRSS2,NF2)(表2)。がん関連遺伝子として登録されていないTTN、SKP2、EED1及びPVT1も腫瘍形成に寄与するものと考えられている。 マウス肝細胞癌及びヒト肝細胞癌の微小な領域のコピー数変化を直接比較するため、マウス肝細胞癌に共通するコピー数変化領域に対応するヒト染色体上のシンテニー領域に含まれる遺伝子をリストアップした(表2)。図8Dは、FEAT Tgマウス肝細胞癌(n=6)のアレイCGHで検出されたコピー数変化に対応するヒト染色体のシンテニー領域に存在する遺伝子数を示す図である。図8Dにおいて示されたシンテニー領域は、ヒト肝細胞癌に関与することが示唆されている染色体変異領域(Farazi,P.A.,and DePinho,R.A.(2006)Nat.Rev.Cancer 6,674−687)の殆どすべてを含む。しかも、マウス肝細胞癌のアレイCGHの結果は、既に報告されているヒト肝細胞癌のarray−CGHの結果(Zender,L.et al.(2006)Cell 125,1253−1267)と非常に類似するものであった。このように種間を超えて共通の遺伝子領域のコピー数変化が確認されたことにより、これらのTgマウスの肝細胞癌は、ヒト患者の肝細胞癌を忠実に再現したものであり、FEAT Tgマウスが、ヒト肝細胞癌の有用なモデル動物であることが示唆されたと言える。 種々のヒト癌組織におけるFEAT発現の上昇 FEATがヒトのどれだけの種類の癌の発生に寄与するかを見積もるため、組織アレイを用いてヒトの正常組織、種々の癌及びその亜型におけるFEATの発現レベルを調べた。大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌及び非小細胞性肺癌において、正常組織に比べてFEATの有意な発現上昇が確認された(図11、図12、表3)。FEATは、がん細胞では発現上昇していたが、癌組織に隣接する非腫瘍性間質細胞又は正常細胞では、発現上昇は見られなかった。従って、FEATの発現上昇は、ヒトの癌において広く共通する特徴であり、殆どの癌の発達において不可欠な過程であることが示唆される。驚くべきことに、ヒト肝細胞癌において、FEATの過剰発現が、腫瘍性形質変化に先立って起こっている:肝硬変組織中の肝細胞癌に隣接する肝細胞では、高レベルのFEAT発現が確認された(図13)。図13において、図中の数字は患者の年齢を示し、Mは、患者の性別(男性:Male)を示す。この結果から、これらの肝硬変組織において、癌形成が進行していることを反映しているものと考えられる。また、乳管内癌(早期進行性浸潤)においてもin situで著しいFEAT過剰発現が観察された(図12A)。以上の結果から、FEATは、多種多様なヒトの癌において、前癌段階又は早期腫瘍形成段階から関与するものと考えられる。 FEATは、正常細胞では発現されておらず、その発現が腫瘍細胞又は前癌細胞に限定されており、また、腫瘍形成の早期段階から発現しているため、本発明の検査用試薬を用いてFEAT発現細胞を検出することにより、腫瘍を早期に検出することが可能である。 また、本発明の医薬組成物を用いてFEAT発現細胞を死滅させることにより、腫瘍の更なる発達を予防することが可能であり、また、既に発達した腫瘍を治療することも可能である。 また、本発明のFEAT発現腫瘍モデル動物は、ヒトの肝細胞癌又は悪性リンパ腫の病理的特徴を忠実に再現したモデル動物であり、これらの癌及び腫瘍の研究に有用である。 配列番号9:合成DNA 配列番号10:合成DNA 配列番号11:合成DNA 配列番号12:合成DNA 配列番号13:合成DNA 配列番号14:合成DNA 配列番号15:合成ペプチド 配列番号16:合成DNA 配列番号17:合成DNA 配列番号18:合成DNA 配列番号19:合成DNA 配列番号20:合成DNA 配列番号21:合成DNA 配列番号22:合成DNA 配列番号23:合成DNA 配列番号24:合成DNA 配列番号25:合成DNA [配列表]","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}},"description_lang":["ja"],"has_description":true,"has_docdb":true,"has_inpadoc":true,"has_full_text":true,"biblio_lang":"ja"},"jurisdiction":"WO","collections":[],"usersTags":[],"lensId":"037-944-205-634-64X","publicationKey":"WO_2012_023622_A1","displayKey":"WO 2012/023622 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\n(a)FEAT遺伝子の発現若しくはFEATタンパク質の活性を阻害する物質
\n(b)FEATタンパク質に反応する免疫細胞
\n(c)FEATタンパク質に結合する物質であって抗腫瘍剤、前記(a)の物質若しくは前記(b)の細胞を担持した物質"],"number":2,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" FEAT遺伝子の発現を阻害する物質がFEAT遺伝子に対するsiRNAである請求項2に記載の医薬組成物。"],"number":3,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" FEATタンパク質の活性を阻害する物質がFEATタンパク質に対する抗体である請求項2に記載の医薬組成物。"],"number":4,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 免疫細胞がT細胞、B細胞又は樹状細胞である請求項2に記載の医薬組成物。"],"number":5,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 生体から採取された被験試料と請求項1に記載の試薬とを反応させることを特徴とする、腫瘍の検出方法。"],"number":6,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 被験試料が血液、体液又は組織切片である請求項6に記載の方法。"],"number":7,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" FEAT遺伝子が導入されたトランスジェニック非ヒト動物からなる、腫瘍のモデル動物。"],"number":8,"annotation":false,"claim":true,"title":false}]}},"filters":{"npl":[],"notNpl":[],"applicant":[],"notApplicant":[],"inventor":[],"notInventor":[],"owner":[],"notOwner":[],"tags":[],"dates":[],"types":[],"notTypes":[],"j":[],"notJ":[],"fj":[],"notFj":[],"classIpcr":[],"notClassIpcr":[],"classNat":[],"notClassNat":[],"classCpc":[],"notClassCpc":[],"so":[],"notSo":[],"sat":[]},"sequenceFilters":{"s":"SEQIDNO","d":"ASCENDING","p":0,"n":10,"sp":[],"si":[],"len":[],"t":[],"loc":[]}}