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The invention provides a method for maintaining and promoting the stability of a protein present on a cell membrane by treating a cell with a carboxylic acid or a derivative thereof including 4-phenylbutyric acid thereby suppressing degradation of the protein on the membrane, and an agent for stabilizing a membrane protein containing a carboxylic acid or a derivative thereof including 4-phenylbutyric acid.","lang":"en","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}],"fr":[{"text":"L'invention vise à proposer un agent et un procédé pour conserver et favoriser la stabilisation d'une protéine membranaire, en particulier un transporteur (par exemple, un transporteur ABC) sur une membrane cellulaire. L'invention porte sur un procédé pour conserver et favoriser la stabilité d'une protéine présente sur une membrane cellulaire par traitement d'une cellule avec un acide carboxylique ou un dérivé de celui-ci comprenant l'acide 4-phénulbutyrique, supprimant ainsi la dégradation de la protéine sur la membrane, et sur un agent pour stabiliser une protéine membranaire contenant un acide carboxylique ou un dérivé de celui-ci comprenant l'acide 4-phénylbutyrique.","lang":"fr","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}],"ja":[{"text":"【課題】本発明は、膜タンパク質、特に、トランスポーター(例えば、ABCトランスポーター)の細胞膜上における安定化を維持、促進するための薬剤及び方法の提供を目的とする。 【解決手段】本発明は、4-フェニルブチル酸を含むカルボン酸及びその誘導体で細胞を処理することで、細胞膜上に存在するタンパク質の分解を抑制し、膜上におけるタンパク質の安定性を維持促進する方法、及び、4-フェニルブチル酸を含むカルボン酸及びその誘導体を含有する膜タンパク質の安定化剤を提供する。","lang":"ja","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}]},"abstract_lang":["en","fr","ja"],"has_abstract":true,"claim":{"ja":[{"text":"一般式(1): (式中、Rは水素原子、メチル基、又は無置換若しくは置換基を有していてもよいフェニル基を表し、Xは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、nは1~8の整数である) 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膜タンパク質のうち、例えば、トランスポーターは細胞内環境の維持において重要な役割を担っており、その機能的変異は様々な疾患の原因となることが知られている。トランスポーターは、広義には、生体膜に存在し、生体膜を横切る物質輸送の仲介を行うタンパク質のことである。特に、薬物の取り込み及び排出に関与するトランスポーターは、有機アニオンや有機カチオンの輸送を行い、薬物の吸収、排泄など、生体にとって欠くことのできない役割を果たしており、肝臓、腸管、腎臓、脳などの各種臓器を形成する細胞に存在する。 薬物の取り込みや排出に関与するトランスポーターの機能が低下すると、毒性を有する物質が細胞内に蓄積して、重篤な疾患の発症への契機になる場合がある。例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症2(PFIC2)は、胆管側膜に存在する胆汁酸塩排出ポンプ(BSEP/ABCB11)の発現における遺伝的欠損が原因の遺伝性疾患で、肝移植などの外科的処置を施さない場合、肝硬変を発症し、生命の危険を招来せしめる難病の1つである。 BSEPは、胆管側膜上に局在するATP結合カセット膜透過トランスポーター(ABCトランスポーター)に分類され、胆汁酸(タウロコール酸)の排出を行っている。BSEPの機能に何らかの障害が発生すると、肝細胞に胆汁酸が蓄積し、その結果、高濃度の胆汁酸の毒性により肝細胞が大きなダメージを受けることになる。PFIC2患者の遺伝子解析の結果から、BSEP遺伝子変異として、様々なミスセンス、未成熟ターミネーション、フレームシフト、及びスプライシングジャンクションにおける変異の存在が明らかとなってきた。中でも、2番目の細胞内ループ及び最初のATP結合ドメイン中における2つのミスセンス変異であるE297G及びD482Gは、PFIC2患者においてしばしば見出されている(非特許文献1)。 BSEP以外のトランスポーターにおいても、その機能異常による活性の低下が疾患の発症へとつながる例は多く、トランスポーターの活性を有効に維持することは、関連疾患の有効な治療法の開発に寄与する可能性が考えられている。これまでに、細胞膜上における発現が著しく低下する特徴を持つ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR/ABCC7;塩素イオンチャンネル)の変異体(CFTRΔF508)が、4-フェニルブチル酸(4PBA)により、細胞膜上発現を回復することが報告されている(非特許文献2)。しかし、トランスポーターの細胞膜上への回復を含む、膜上における安定性を維持するメカニズムについては、まだ明らかにされていない。 本発明は、膜タンパク質、特に、トランスポーター(例えば、ABCトランスポーター)の細胞膜上における安定化剤及び安定化方法の提供を目的とする。 本発明者らは、トランスポーターの機能維持及び機能促進を目的として、鋭意研究を重ねた結果、4-フェニルブチル酸(4PBAとも記する)を含むカルボン酸が胆管側膜上に存在するBSEPの分解を抑制することを見出し、本発明を完成させた。即ち本発明は、 一般式(1): (式中、Rは水素原子、メチル基、又は無置換若しくは置換基を有していてもよいフェニル基を表し、Xは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、nは1~8の整数である) で表される化合物、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする、膜タンパク質の安定化剤である。 あるいは、 一般式(2): (式中、R 1 は水素原子又は炭素数1~5のアルキル基を表し、Xは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、nは1~8の整数である) で表される化合物、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする、膜タンパク質の安定化剤である。 また、上記安定化剤を用いた膜タンパク質の安定化方法である。 さらに、上記安定化剤を含む利胆剤である。 本発明に係る安定化剤を用いることにより、膜タンパク質、特に、トランスポーター(例えば、ABCトランスポーター)の膜上における安定性を維持又は促進することができる。 また、本発明の安定化剤を含む薬剤により、トランスポーター(例えば、ABCトランスポーター)(例えば、BSEP)の機能異常により発症する疾患(例えば、胆汁うっ滞性疾患)の治療剤及び治療方法を提供することができる。 図1は、BSEPを発現するMDCKII細胞に対する4PBA処理の時間及び濃度依存的な効果を示す。 Aは、BSEPの発現に対する4PBAの時間依存的な効果を示す。野生型、E297G及びD482Gを発現するMDCKII細胞を図に示す時点において1mM4PBA処理を行い、粗膜画分を調製した。得られた試料(40μg)を6%SDS-PAGEにかけ、ウェスタンブロッティングを行った。Bは、BSEPの発現に対する4PBAの濃度依存的な効果を示す。野生型、E297G及びD482Gを発現するMDCKII細胞を図に示す濃度の4PBAで24時間処理を行い、粗膜画分を調製した。得られた試料(40μg)を6%SDS-PAGEにかけ、ウェスタンブロッティングを行った。 図2は、BSEPのMDCKII細胞表面上での発現に対する4PBA処理の効果を示す。実験の行う前に、野生型、E297G、D482G BSEP及びGFPを発現する細胞を1mM 4PBAの存在下又は非存在下において24時間処理を行った。BSEPの細胞表面上での発現は経細胞輸送アッセイ及び細胞表面ビオチン化法により測定した。 Aは、MDCKIIの単層培養を横切る[ 3 H]TCの経細胞輸送の経時変化を示す。黒丸、黒四角及び白丸、白四角は、各々、4PBA存在下及び非存在下で処理したMDCKII細胞を示す。丸と四角は、基底側から頂端側方向、及び頂端側から基底側方向の経細胞輸送を示す。各点及び垂直のバーは、3回の測定値の平均値±標準誤差である。 Bは、MDCKII単層培養の頂端膜を横切る[ 3 H]TCの経細胞輸送の様子を示す。野生型、E297G、D482G BSEP及びGFPを発現するMDCKII単層培養の頂端膜を横切る[ 3 H]TC輸送のクリアランスを測定した。各バーは3回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差( * P<0.05; ** P<0.01) 図3は、ビオチン化分析による細胞表面発現の測定結果を示す。細胞尿面画分をビオチン化法により単離し、得られた試料に対し、6%SDS-PAGE後、ウェスタンブロッティングを行った。 図4は、MDCKII細胞でのBSEP発現に対する、4PBAの転写及び翻訳への影響を検討した結果を示す。 Aは、BSEPmRNAの発現レベルのリアルタイムPCRによる測定結果である。各反応におけるBSEPの発現量は、GAPDHの発現量により標準化した。各バーは、3回の測定の平均値±標準誤差を表す。 B及びCは、アクチノマイシンDによる転写阻害(B)及びシクロヘキシミドによる翻訳阻害(C)条件下での、4PBAによるBSEPの上方制御について検討した結果である。野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKII細胞を、1mM 4PBAの存在下又は非存在下において、アクチノマイシンD(5μg/ml)の有無、又はシクロヘキシミド(20μg/ml)の有無の条件下にて、6時間(E297G及びD482G BSEP)又は8時間(野生型BSEP)処理を行った。40μgの試料を6%SDS-PAGEにかけ、その後、ウェスタンブロッティングを行った。 図5は、MDCKII細胞中のBSEPの成熟過程に対する4PBA処理の影響を調べた結果である。 Aは、BSEPの成熟経過を調べた結果である。野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKII細胞を、5μg/mlBFAの存在下又は非存在において、1mM 4PBAの添加又は非添加で処理を行った。BFAによって蓄積した未成熟の低分子量BSEPが、成熟型の高分子量BSEPへ変換される様子を確認するために、1mM 4PBAの存在下又は非存在下においてBFAを経時的に洗い流し、粗膜画分を調製した。得られた試料の40μgを6%SDS-PAGEにかけ、ウェスタンブロッティングを行った。 Bは、Aに示す成熟型BSEPのバンド密度を定量した結果を示す。バンド強度は、Image Gauge softwareで定量化した。黒丸及び白丸は、各々、4PBAの存在下及び非存在下において、成熟型BSEPのバンドから得られるシグナルの強度を示す。 図6は、MDCKII細胞表面上に存在するBSEPの分解速度に対する4PBAの効果を調べた結果である。Aは、細胞表面に存在する野生型とE297G BSEPの分解速度について検討した結果を示す。野生型及びE297G BSEPを発現するMDCKII細胞を1mM 4PBAの存在下又は非存在下において処理を行った。細胞表面をビオチン化した後、1mM 4PBAの存在下又は非存在下にて、図中に示す時間、37℃で培養した。残存したビオチン化タンパク質は、ストレプタビジンビーズを用いて単離し、6%SDS-PAGEで分離後、ウェスタンブロッティングを行った。 Bは、Aに示される野生型及びE297G BSEPのバンド密度を定量した結果である。バンド強度は、Image Gauge softwareで定量化し、0時間の強度に対する比率で示した。黒丸及び白丸は、各々、4PBAで処理したMDCKII細胞及び処理しなかったMDCKII細胞の表面上に残存する各BSEPの値を示す。各バーは、3回の実験の平均値±標準誤差を表す。同様な方法により、P-gp及びDPPIVについても測定した。 図7は、MDCKII細胞表面上に存在するD482G BSEPの分解速度に対する4PBAの効果を調べた結果である。 Aは、低温(27℃)条件下におけるD482G BSEPの細胞表面上における発現について検討した結果である。D482G BSEPを発現するMDCKII細胞を27℃、24時間培養した後、細胞表面をビオチン化した。ビオチン化したタンパク質は、ストレプタビジンビーズを用いて単離し、6%SDS-PAGEで分離後、ウェスタンブロッティングを行った。 Bは、細胞表面に存在するD482G BSEPの分解速度を調べた結果である。D482G BSEPを発現するMDCKII細胞は、1mM 4PBAの存在下又は非存在下において、27℃で24時間培養した。Aと同じ方法により、調製した試料を6%SDS-PAGEで分離後、ウェスタンブロッティングを行った。 Cは、Dに示されるD482G BSEPのバンド密度を定量した結果である。Bと同様な方法で定量化し、グラフ化した。 図8は、SDラットの胆管側膜上のBSEPの発現に対する4PBAの影響を検討した結果である。実験の行う前に、雄のSDラット(6-7週齢)に、チューブを介して0.6g/kg/日用量で10日間4PBA又はビークルを与えた。4PBA又はビークルは3回に分けて与えた。 Aは、CMVsによる時間依存的な[ 3 H]TCの取り込みを示す。4PBA処理(黒丸)及びビークル処理(白丸)のSDラットから調製したCMVsを5mmol/LのATP又はAMPの存在下、37℃でインキュベートした。[ 3 H]TCの濃度は1μMであった。[ 3 H]TCの取り込みは、ATP存在下の値からAMP存在下での値を差し引いて算出した。各点及び水平のバーは、3回の実験の平均値±標準誤差を表す。 Bは、[ 3 H]TCのCMVsによる取り込みのホフスティープロットを示す。4PBA処理(黒丸)及びビークル処理(白丸)のSDラットから調製したCMVsを5mmol/LのATP又はAMPの存在下、37℃で0.5分間又は1分間インキュベートした。[ 3 H]TCの濃度は1μMであった。[ 3 H]TCの取り込みは、ATP存在下の値からAMP存在下での値を差し引いて算出した。各点及び水平のバーは、3回の実験の平均値±標準誤差を表す。 Cは、CMVsに対するウェスタンブロッティングの結果を示す。4PBA処理及びビークル処理のSDラットから調製したCMVs(10μg)は、6%SDS-PAGE後ウェスタンブロッティングを行った。 図9は、BSEPを発現するMDCKII細胞に対する4PBA又はオクタン酸(Octanoic acid)処理の効果を示す。 野生型BSEPを発現するMDCKII細胞を1mM4PBA又はオクタン酸で、24時間処理を行い、細胞表面画分をビオチン化法により単離し、得られた試料に対し、6%SDS-PAGE後、ウェスタンブロッティングを行った。 図10は、野生型BSEPを発現したMDCKII単層培養の頂端膜を横切る[3H]TCの経細胞輸送に対する、4PBA、Propionic acid(プロピオン酸)、Butyric acid(ブタン酸)、Octanoic acid(オクタン酸)及びDecanoic acid(デカン酸)処理の効果を示す。野生型BSEPを発現するMDCKII単層培養細胞を、1mM 4PBA、プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸及びデカン酸の存在下又は非存在下において24時間処理のち、頂端膜を横切る[3H]TC輸送のクリアランスを測定した。各バーは3回の測定の平均値±標準誤差を表す。スチューデントテストによるコントロールとの有意差(*P<0.05;**P<0.01) 図11は、MDCKII細胞表面上に存在するBSEPの分解速度に対するオクタン酸(Octanoic acid)の効果を調べた結果である。Aは、細胞表面に存在する野生型BSEPの分解速度について検討した結果を示す。野生型BSEPを発現するMDCKII細胞を1mM オクタン酸の存在下又は非存在下において処理を行った。細胞表面をビオチン化した後、1mM オクタン酸の存在下又は非存在下にて、図中に示す時間、37℃で培養した。残存したビオチン化タンパク質は、ストレプタビジンビーズを用いて単離し、6%SDS-PAGEで分離後、ウェスタンブロッティングを行った。 Bは、Aに示される野生型BSEPのバンド密度を定量した結果である。バンド強度は、Image Gauge softwareで定量化し、0時間の強度に対する比率で示した。黒丸は、カルボン酸無処理のMDCKII細胞表面上に残存する各BSEPの値(コントロール)、白丸及び黒四角は、各々、4PBA又はオクタン酸で処理したMDCKII細胞表面上に残存する各BSEPの値を示す。各バーは、3回の実験の平均値±標準誤差を表す。 一般式(1)において、Rは、水素原子、メチル基、又は無置換若しくは置換基を有していてもよいフェニル基を表し、Xは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、nは1~8の整数を表す。この場合、好ましくは、Rはメチル基であり、nは1、2、6又は8である。 あるいは、一般式(1)において、Rは下記式で表され(ただし、R 1 は水素原子又は炭素数1~5のアルキル基を表す)、Xは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、nは1~8の整数を表す。 この場合、好ましくは、R 1 は水素原子であり、nは3である。 本発明の一般式(1)で表される化合物は、当業者にとって公知の方法により製造することができるが、市販のものを購入することも可能である(例えば、Scandinavian Formulas Inc.)。 本発明は、膜タンパク質の細胞膜上での安定性の維持又は促進のための薬剤及び方法を提供するものである。 ここで、膜タンパク質とは、生体膜を構成するタンパク質のことで、好ましくは、トランスポーター、特に好ましくは、ABCトランスポーターであり、例えば、MDR1、MRP1、MRP2、MRP3、MRP4、MRP5、MRP6、BCRP、OCT1、OCT2、OCTN2、OAT-K1、OATP-A、OATP-2、LST1、BSEPなどを挙げることができる。最も好ましくは、BSEP(bile salt export pump)(例えば、ヒトBSEPの配列として、配列番号1及び配列番号2を参照のこと)である。あるいは、BSEPと同様に肝細胞毛細胆管側膜上に発現しているABCトランスポーターであるMRP2も、本発明のトランスポーターとして好適である。MRP2は、フェニルブチル酸により安定化が起こり、その機能異常は、黄疸を惹起し、肝機能障害を引き起こす。 本発明に係る薬剤は、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で膜タンパク質、特に、トランスポーターの機能異常に関連する疾患の治療薬として使用することができる。通常、そのような組成物には、本発明の化合物の他、薬剤上許容される担体が含まれる。 「薬剤上許容される担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、コラーゲン、ヒト血清アルブミン、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等などが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、本発明の化合物の活性を保護又は促進するような特定の化合物が、該組成物中に包含されていてもよい。 本発明に係る医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口(例えば、吸入なども含む)、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。 pHは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製することができる。非経口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。 注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒、使用時に調製するための滅菌水溶液(水溶性の)又は分散媒及び滅菌されたパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションを防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションの防止に対して使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。 滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で、又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液を調製するための滅菌的パウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。 経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び/又はアジュバント物質などが包含されてもよい。 錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る:微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤;スターチ又はラクトースなどの、アルギン酸、PRIMOGEL、又はコーンスターチなどの膨化剤;ステアリン酸マグネシウム又はSTRROTESなどの潤滑剤;コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤;スクロース又はサッカリンなどの甘味剤;又はペパーミント、メチルサリチル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。 本発明の化合物は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG誘導ホスファチジルエタノール(PEG-PE)を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。 本発明の化合物による特定の疾患の予防又は治療において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。 注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約0.1μg/kgから約500mg/kgを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約0.1μg/kgから約250mg/kgであり、より好ましくは一日に約0.5μg~約100mg/kgである。 経口投与の場合は、組成物は、好ましくは1.0から1000mgの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が1.0,5.0,10.0,15.0,20.0,25.0,50.0,75.0,100.0,150.0,200.0,250.0,300.0,400.0,500.0,600.0,750.0,800.0,900.0及び1000.0mgである。化合物は一日に1~4回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。 医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。 本発明の医薬組成物はキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。 キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。 また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び/又はフロッピー(登録商標)ディスク、CD-ROM、DVD-ROM、Zipディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。 さらに、本発明には、膜タンパク質、特にトランスポーターの機能異常に関連した疾患に罹患した、又は罹患する危険性のある哺乳動物の該疾患に関する予防又は治療方法も含まれる。 ここで「治療」とは、前記疾患に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、該疾患の病態の進行を阻止又は緩和することを意味し、治療的処置のみならず予防的処置をも含む広い意味として使用される。 治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。 以下に本発明につき、式(3)に示すフェニルブチル酸塩の他、プロピオン酸塩、ブタン酸塩、オクタン酸塩及びデカン酸塩を用い、トランスポータータンパク質であるBSEPの胆管側膜上における安定性の維持、促進を例として、以下に詳細に説明する。 なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 方法及び試薬類 1.試薬類 医薬品グレードのフェニルブチル酸(4PBA)及び他のカルボン酸(プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸及びデカン酸)は、Scandinavian Formulas Inc.から購入した。[ 3 H]タウロコール酸(2Ci/PA)はNEN Life Science Products社から購入した。ヒトBSEP、P-糖タンパク質(P-gp)(C219)、及びジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)に対する抗体は、Santa Cruz Biotechnology社、Signet社及びBD Biosciences社CA)からそれぞれ購入した。rBSEPに対する抗血清はオリゴペプチド(rBSEPのC末端、AYYKLVITGAPIS(配列番号3))に関し、ウサギを用いて作成した。その他すべての試薬類は分析用グレードを用いた。MDCKII細胞は、10% FBS、ペニシリン(100U/ml)、及びストレプトマイシン(100U/ml)を含むDMEM培地(Invitrogen社)中、37℃、5%CO 2 及び95%湿度の条件下で培養した。 2.リコンビナントアデノウィルスの調製 ヒト野生型、E297G及びD482G BSEPのリコンビナントアデノウィルスを調製するために、BD Adeno-X Adenoviral Expression System(BD Biosciences社)を用いた(Hayashiら,Hepatology,41:916-924,2005、を参照のこと)。ウィルスの力価はAdeno-X Rapid Titer Kit(Clontech社)でチェックした。コントロールとして、GFPを保持するリコンビナントアデノウィルスを用いた。 3.4PBA、オクタン酸処理 MDCKII細胞を6ウェルプレートに2.5×10 5 細胞/ウェルの密度となるように播いた。24時間培養後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、E297G、D482G BSEP、及びGFPのcDNAを保持するリコンビナントアデノウィルスで、200MOIにて感染させた。4PBA又はオクタン酸処理は、処理期間及び処理濃度を変えて行った。4PBA又はオクタン酸処理の終了後、粗膜画分を調製した(Mitaら,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290:G550-G556,2006を参照のこと)。得られた試料を6%SDS-PAGEで分離し、ウェスタンブロッティングを行った(Hayashiら,Hepatology,41:916-924,2005、を参照のこと)。抗体反応は、ECL(Amersham Biosciences社)で検出した。成熟型BSEPを示すバンドの強度をMulti Gauge software Ver 2.0(Fujifilm社)で定量した。 4.経細胞輸送アッセイ MDCKII細胞を、24ウェルプレートのトランスウェルメンブレンインサート(ポアサイズ3μM、Falcon)上に、1.5×10 5 細胞/インサートの密度になるように播いた。培養2日後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、E297G、D482G BSEP、及びGFPのcDNAを保持するリコンビナントアデノウィルスで、50MOIにて感染させた。感染後、細胞を24時間培養し、次いで、1mM 4PBA又は他のカルボン酸(プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸及びデカン酸)で処理した。24時間処理後、経細胞輸送アッセイを行った(Mitaら,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290:G550-G556,2006を参照のこと)。 頂端膜を横切る見かけの排出値(PS apical )は、2時間の[ 3 H]TCの経細胞輸送に対する定常速度を実験の終了時(2時間後)の[ 3 H]TCの細胞内濃度で割ることにより算出した。 5.細胞表面のビオチン化と細胞表面発現タンパク質の分解速度の測定 MDCKII細胞を6ウェルプレートに2.5×10 5 細胞/ウェルとなるように播いた。培養24時間後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、E297G、D482G BSEP、及びGFPのcDNAを保持するリコンビナントアデノウィルスで、200MOIにて感染させた。感染後、細胞を24時間培養し、次いで、1mM 4PBA又はオクタン酸で処理した。24時間処理後、ビオチン化を行った(Hayashiら,Hepatology,41:916-924,2005、を参照のこと)。 細胞表面に存在するタンパク質の分解速度を測定する場合、ビオチン化したMDCKII細胞は、可溶化前、1mMの4PBA又はオクタン酸の存在下又は非存在下にて、37℃で、一定時間インキュベーションした。残存したビオチン化タンパク質を単離し、6%SDS-PAGE後、ウェスタンブロッティングを行った。 6.BSEPmRNAレベルの測定 MDCKII細胞を6ウェルプレートに2.5×10 5 細胞/ウェルとなるように播いた。培養24時間後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、E297G、D482G BSEP、及びGFPのcDNAを保持するリコンビナントアデノウィルスで、50MOIにて感染させた。感染後、細胞を24時間培養し、次いで、1mM 4PBAで処理した。24時間処理後、RNAをISOGEN(Wako Pure Chemical Industries社)を用いて添付の説明書に従い単離した。37℃で1時間、DNaseI処理をした後、逆転写反応を行った(Hayashiら,Hepatology,41:916-924,2005、を参照のこと)。BSEPmRNAレベルはリアルタイム定量PCRにより、定法に従い測定した。定量PCRは以下のプライマーを用いて行った。 BSEP :5’-dAGTGGGGGAGCTGAATACAA-3’(配列番号4) 5’-dCCAATGGTGGCTGCTCCAAT-3’(配列番号5) GAPDH:5’-AACGACCCCTTCATTGAC-3’ (配列番号6) 5’-TCCACGACATACTCAGCAC-3’ (配列番号7) なお、各反応におけるBSEP遺伝子の発現はGAPDHの発現により標準化した。 7.アクチノマイシンD(ActD)及びシクロヘキシミド(CHX)処理 MDCKII細胞を6ウェルプレートに2.5×10 5 細胞/ウェルとなるように播いた。培養24時間後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、E297G、D482G BSEP、及びGFPのcDNAを保持するリコンビナントアデノウィルスで、200MOIにて感染させた。感染後36時間細胞を培養し、その後、mRNA合成を阻害するために5μg/mlのアクチノマイシンDの存在下(Sigma社)又は非存在下で、あるいは、タンパク質合成を阻害するために20μg/mlのシクロヘキシミドの存在下(Sigma社)又は非存在下で処理を行った。2時間の処理後、アクチノマイシンD又はシクロヘキシミドの存在下又は非存在下において、1mMとなるように4PBAを添加した。4PBA処理後6時間(E297G、D482G BSEP)又は8時間(野生型 BSEP)の時点で、粗膜画分を調製した。得られた画分を6%SDS-PAGEで分離した後、ウェスタンブロッティングを行った。 8.ブレフェルジンA洗浄実験 MDCKII細胞を6ウェルプレートに2.5×10 5 細胞/ウェルとなるように播いた。培養24時間後、コンフルエントになった細胞に対し、野生型、E297G、D482G BSEP、及びGFPのcDNAを保持するリコンビナントアデノウィルスで、200MOIにて感染させた。感染後12時間細胞を培養し、その後、小胞体からゴルジ体へのBSEPの輸送を阻害するために5μg/mlのブレフェルジンAの存在下(Sigma社)又は非存在下で処理を行った。2時間の処理後、ブレフェルジンAの存在下又は非存在下において、1mMとなるように4PBAを添加した。4PBA処理後12時間の時点で、粗膜画分を調製した。得られた画分を6%SDS-PAGEで分離した後、ウェスタンブロッティングを行った。 9.動物実験 雄のSDラット(6-7週齢)をNippon SLCから購入した。全ての動物は昼夜を逆転させ、標準的な条件下、動物愛護の精神にて取り扱った。食餌及び水は制限することなく与えた。 なお、本研究は学内の動物実験委員会の定めるガイドラインに従って行った。 SDラットに対し、チューブを介して4PBA又はビークルを一定の期間(5、10、15日間)、種々の用量(0.2、0.6、2.4kg/日)で与えた。4PBA処理後、インビボにおける[ 3 H]TC注入実験を行った(Hiranoら, Mol Pharmacol 68:800-807.2005を参照のこと)。生理食塩水に溶解させた[ 3 H]TCを大腿静脈へ挿入したカニューレを介して、90分間に70ng/分/kgの速度で注入した。血液及び胆汁を特定の時間で採取した。血漿、胆汁及び肝臓からの放射活性を測定した。 10.薬物動態解析 血漿の総クリアランス(CL total )、循環する血漿で標準化した胆汁のクリアランス(CL bile,plasma )、及び肝臓における濃度で標準化した胆汁のクリアランス(CL bile,liver )を以下の式で算出した; CL total =I/C ss, plasma CL bile, plasma =V ss, bile /C ss, plasma CL bile, liver =V ss, bile /C ss, liver (I、C ss, plasma 、V ss, bile 及びC ss, liver は、各々、注入速度(ng/分/kg)、定常状態の血漿濃度(ng/分/kg)、定常状態の胆汁排出速度(ng/分/kg)及び平均肝臓濃度(ng/ml)を表す)。定常状態の血漿濃度(C ss, plasma )は、15,30、60及び90分の時点における血漿[ 3 H]TC濃度の平均値である。胆汁排出速度(V ss, bile )は、10~15分、25~30分、55~60分及び85~90分間における、[ 3 H]TCの胆汁排出速度の平均値である。C ss, liver は、インビボの実験の終了時点における肝臓[ 3 H]TC濃度の平均値である。 11.胆管側膜ベジクルによる輸送アッセイ 雄のSDラット(6-7週齢)に対し、0.6kg/日の4PBA又はビークを、10日間、3回に分けて与えた。胆管側膜ベジクルをラットの肝臓から調製し(Akitaら,Biochim Biophys Acta,1511:7-16,2001)、ウェスタンブロッティング及び輸送アッセイに用いた。トランスポートアッセイは迅速濾過法により行った(Hayashiら,Biochim Biophys Acta,1738:54-62,2005)。 結果 1.4PBA又はオクタン酸を介した細胞表面上におけるBSEPの上方制御 野生型、E297G及びD482Gを発現するMDCKII細胞に対し、4PBA処理を行った(図1A及びB)。発明者らは、これまでに膜表面上の成熟型BSEPと小胞体に存在する未成熟型BSEPの分子量が、各々、173kDaと150kDaであることを報告している(Hayashiら,Hepatology,41:916-924,2005)。粗膜画分に対するウェスタンブロッティングにより、成熟型BSEPの発現レベルを調べることにより、4PBAの効果を検討した。4PBA処理により、成熟型BESPの発現レベルは、E297G及びD482Gのみならず、野生型の発現レベルも変化した。処理の至適条件は、1mM 4PBAによる24時間処理(臨床適用量)で、この条件の処理により、野生型、E297G及びD482G BSEPの発現量が2.5倍~3倍に上昇した。 また、野生型のBSEPを1mM オクタン酸(Octanoic acid)で24時間処理した場合にも、発現量の上昇が認められた(図9)。 次に、4PBA又は他のカルボン酸によるBSEPの細胞表面での発現上昇を、経細胞輸送アッセイ及び細胞表面ビオチン化法を用いて検討した。 経細胞輸送アッセイについては、頂端側への[ 3 H]TCの排出をメディエートするBSEPの機能に関し、MDCKIIの単層培養の横切る[ 3 H]TCの経細胞輸送を測定した(図2)。頂端側への方向性のある[ 3 H]TC輸送は、野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するいずれの細胞において観察されたが、GFPを発現する細胞ではほとんど観察されなかった。 野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKII単層細胞を横切る[ 3 H]TCの基底側から頂端側への排出は、4PBA処理(1mM、24時間)により、各々、1.5倍、2.5倍及び3倍に増大した。一方、GFPを発現する細胞では、このような効果は見られなかった。また、4PBAは、いずれのMDCKII細胞においても頂端側から基底側への排出には影響を与えなかった。 また、4PBAと同様に他のカルボン酸(プロピオン酸、ブタン酸、オクタン酸、デカン酸)で野生型BSEPを処理した場合にも、基底側から頂端側への[ 3 H]TCの排出が増大した(図10)。 BSEPの機能に対する4PBA処理の効果を直接確認するため、BSEPの機能に必須な動力学的パラメーターである、PS apical (Hayashiら,Hepatology,41:916-924,2005;Mitaら,Drug Metab Dispos,34:1575-1591,2006)を算出した(図2B)。PS apical は、4PBA処理により、野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKII細胞において増加したが、GFPを発現する細胞では変化を示さなかった。野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKIIにおけるBSEP依存性PS apical (PS apical,BSEP )を、野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKIIのPS apica からGFPを発現するMDCKIIのPS apica を差し引いて算出した。野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKIIのPS apical,BSEP は、至適条件下(1mM、24時間)での4PBA処理によって、各々、1.7倍、3.0倍及び2.8倍増加した。 さらに、野生型及び変異型BSEPの細胞表面での発現を、MDCKII細胞における細胞表面ビオチン化法により検討した(図3A)。野生型、E297G及びD482G BSEPの細胞表面での発現は、至適条件下(1mM、24時間)での4PBA処理によって、各々、1.8倍、3.1倍及び2.6倍増加した。一方、外来性のP-gp及び内在性のジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)の発現は影響を受けなかった(図3B)。4PBA処理によりBSEPの細胞表面発現の増加レベルとPS apical,BSEP の増加レベルが同等であったことから、臨床適用濃度での4PBA処理は、細胞表面における野生型、E297G及びD482G BSEPの発現を増加させることにより、BSEPの輸送能力を促進することが示唆された。 2.BSEPの細胞表面発現の増加に対する4PBAの転写及び翻訳への影響 4PBA処理がBSEPの細胞表面上での発現を増加させるメカニズムについて検討した。4PBAがBSEPタンパク質の転写あるいは翻訳レベルを上昇させることにより、細胞表面での発現が増加している可能性が考えられた。4PBA処理の有無によるMDCKII細胞中でのBSEPmRNAの発現を定量的PCRにより測定した。BSEPmRNAの発現量は、4PBAによって影響を受けないGAPDHmRNAの発現量により標準化した。野生型、E297G及びD482G BSEPmRNAの発現量は4PBA処理により、僅かに上昇したが、その上昇値は統計的に有意ではなかった(P=0.10(野生型)、0.20(E297G及びD482G)、図4A)。 次に、アクチノマイシンD及びシクロヘキシミドで前処理したMDCKII細胞を用いて、BSEPの発現増加に関し、4PBA処理の転写及び翻訳への影響について検討した(図4B及びC)。アクチノマイシンDによる転写阻害及びシクロヘキシミドによる翻訳阻害は、野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKII細胞における、4PBAを介したBSEP成熟型の発現増加に対して影響を与えなかった。これらの結果から、主として、翻訳後のメカニズムが4PBAを介するBSEPの細胞表面での発現増加に寄与していることが示された。 3.BSEPの成熟に対する4PBA処理の影響 成熟型BSEPの細胞表面での発現増加に関与する可能性のある翻訳後メカニズムの1つとして、小胞体に存在する未成熟型BSEPから細胞表面上の成熟型BSEPへの変換過程の促進が考えられる。BSEPの成熟に対する4PBA処理の効果を評価するため、ブレフェルジンA(BFA)を用いて、小胞体からゴルジ体へのBSEPの輸送を阻害し、BFAを洗い流した後、MDCKII細胞上における成熟速度を測定した。BFAは、未成熟な小胞体存在型BSEPの蓄積を引き起こす薬剤である(図5A及びB)。成熟速度は、BFAを洗い流した後、成熟型BSEPのバンド密度の増加量を経時的にウェスタンブロッティングにより測定することで評価した。成熟型のバンド密度は、各測定時におけるバンド密度から0時間における密度を差し引いて算出した(図5B)。MDCKII細胞中での、BFAを洗い流した直後の野生型、E297G及びD482G BSEPの未成熟な小胞体存在型の発現レベルは、4PBA処理の有無にかかわらずほぼ同じであった(図5A;0時間)。また、成熟型については、BFAの洗い流し後3時間までは4PBAの有無にかかわらず発現レベルに変化はなかったが、3時間後から直線的に増加し始めた。BFAの洗い流し後8時間の時点において、4PBAで処理しないMDCKII細胞と比較すると、4PBAで処理したMDCKII細胞では、成熟型の発現レベルがより高かった。この結果から、4PBA処理は、野生型、E297G及びD482G BSEPの成熟を促進せずに、これら成熟型を安定化することが示唆された。 4.細胞表面存在型BSEPの半減期の4PBA又はオクタン酸による延長 細胞表面に存在するBSEPは、胆管側膜と細胞内コンパートメントとの間を循環し、最終的にはタンパク質分解経路によって除去される。従って、分解経路へのエントリーのブロックにより、細胞表面におけるBSEPの発現の増加が誘導される可能性も考えられた。そこで、細胞表面に存在するBSEPが分解経路に入ることが、4PBA処理により阻害されるかどうか検討するため、野生型、E297G及びD482G BSEPを発現するMDCKII細胞表面のBSEPの分解速度を、ビオチン標識法を用いて測定した。細胞表面に存在する野生型及びE297 BSEPの半減期は、4PBA処理によって、各々、1.8倍及び2.5倍長くなった(図6A及びB)。また、野生型BSEPについては、4PBAに代えてオクタン酸を用いた場合にも同様の結果が得られた(図11)。 一方、外来性のP-gp及び内在性のジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)は影響を受けなかった(図6A及びB)。細胞表面に存在するD482G BSEPの分解速度は、発現量が少なかったため、野生型及びE297Gと同じ測定条件下では検出することができなかった。そこで、D482G BSEPに関し、変異型のミスフォールドされたタンパク質の輸送を正しく補正することが知られている低温処理の効果について検討を行った(Denningら,Nature 358:761-764,1992;Plassら,J Hepatol 40:24-30,2004)(図7A)。低温条件下(27℃)で細胞を24時間培養すると、細胞表面上での発現が4倍増加した。その後、37℃で細胞表面に存在するD482GBSEPの分解速度を測定したところ、4PBA処理により細胞表面上での半減期が3.3倍になった(図7B及びC)。この結果から、4PBAの処理によってBSEPの成熟型が安定化されることが明らかとなった(図5A及びB) 5.インビボ条件下での胆管側膜上で発現するBSEPの4PBAによる上方制御 4PBAの処理により、MDCKII細胞表面での野生型、E297G及びD482G BSEPの機能的な発現を増加させることができる(図2及び3)。そこで、インビボにおいても4PBAが同じ効果を示すか検討するために、SDラットを用いて実験を行った。SDラットに対する4PBAの適量は、子供に対して承認されている用量(0.45-0.6g/kg/日)に従って決定した。0.6g/kg/日の用量の4PBAで10日間繰り返し処理した後に[ 3 H]TC注入実験を行った。ビークル処理と4PBA処理のSDラットとの間で、[ 3 H]TCのC ss, plasma 、V ss, bile に有意差はみられなかったが、4PBA処理のSDラットにおける[ 3 H]TCのC ss, liver は、ビークル処理のラットのC ss, liver の1/2であった(表1及び2)。従って、ビークル処理と4PBA処理のSDラットとの間で、[ 3 H]TCに対するCL total 及びCL bile,plasma に有意差はみられなかった。逆に、4PBA処理のラットの[ 3 H]TCに対するCL bile,liver は、ビークル処理のラットと比べて2倍大きかった。これらの結果から、胆管側膜を介する[ 3 H]TCの胆汁排出は促進されていることが示唆された。 4PBAの至適な処理条件を検討するために、種々の時間及び用量に関して[ 3 H]TC注入実験を行った(表1及び2)。至適条件は、4PBAによる0.6g/kg/日用量での10~15日間処理であった。全ての条件下において明らかな副作用はみとめられなかった。 胆管側膜上でのBSEPの発現増加が胆管側膜を介した[ 3 H]TCの胆汁排出の促進と関連するかどうか検討するため、胆管側膜ベジクル(CMVs)を用いてベジクルの取り込み実験及びウェスタンブロッティングを行った。CMVsは0.6g/kg/日用量で4PBA又はビークル処理を10日間繰り返し行ったSDラットから調製した。4PBA処理ラット由来のCMVsによるATP依存的な[ 3 H]TCの取り込みは、0.5分間直線的に上昇し、ビークル処理ラットのCMVsの0.5分後の取り込み量と比較すると、3倍であった(図8A)。4PBA処理ラット及びビークル処理ラット由来のCMVsへの[ 3 H]TCの取り込みの初期速度は、各々、13.5±2.4及び9.5±1.0μMのK m 値を持つ単一の飽和成分で表された(図8B)。[ 3 H]TCのV max 値は、4PBA処理により270±20から1,000±110に増大した(図8B)。さらに、CMVsのウェスタンブロッティングにより、BSEPの発現レベルが4PBA処理によって3.2倍増加したのに対し、P-gp及びDPPIVの発現レベルは変化がなかったことも明らかとなった(図8C)。これらの結果から、SDラットにおいて、ヒトに対する臨床適用量の4PBA処理によって、胆管側膜上の機能的なBSEPの発現レベルが増加し、胆管膜を介した胆汁酸の輸送が促進されることが示唆される。 本発明の安定化剤及び安定化方法は、膜タンパク質、特に、トランスポーター(例えば、ABCトランスポーター)の細胞膜上における安定性を維持、促進することから、トランスポーター(例えば、ABCトランスポーター)の活性の促進を実現することができる。従って、該トランスポーターの機能異常に関連する疾患の治療剤及び治療方法の開発に大いに貢献するものである。","source":"WIPO_FULLTEXT","data_format":"ORIGINAL"}},"description_lang":["ja"],"has_description":true,"has_docdb":true,"has_inpadoc":true,"has_full_text":true,"biblio_lang":"ja"},"jurisdiction":"WO","collections":[],"usersTags":[],"lensId":"021-535-021-001-495","publicationKey":"WO_2009_008120_A1","displayKey":"WO 2009/008120 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\n \n
\n(式中、Rは水素原子、メチル基、又は無置換若しくは置換基を有していてもよいフェニル基を表し、Xは水素原子又はアルカリ金属原子を表し、nは1~8の整数である)
\nで表される化合物、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする、膜タンパク質の安定化剤。"],"number":1,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":["前記Rがメチル基であることを特徴とする請求項1に記載の安定化剤。"],"number":2,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":["nが1、2、6又は8であることを特徴とする請求項2に記載の安定化剤。"],"number":3,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 前記Rが以下の置換基、
\n \n
\n(ただし、R1は水素原子又は炭素数1~5のアルキル基を表す)であることを特徴とする請求項1に記載の安定剤。"],"number":4,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 前記R1が水素原子、nが3であることを特徴とする請求項4に記載の安定化剤。"],"number":5,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 前記膜タンパク質がトランスポーターであることを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載の安定化剤。"],"number":6,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 前記トランスポーターがABCトランスポーターであることを特徴とする請求項6に記載の安定化剤。"],"number":7,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 前記ABCトランスポーターがBSEPであることを特徴とする請求項7に記載の安定化剤。"],"number":8,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":["前記ABCトランスポーターがMRP2であることを特徴とする請求項7に記載の安定化剤。"],"number":9,"annotation":false,"claim":true,"title":false},{"lines":[" 請求項8に記載の安定化剤を含む利胆剤。"],"number":10,"annotation":false,"claim":true,"title":false}]}},"filters":{"npl":[],"notNpl":[],"applicant":[],"notApplicant":[],"inventor":[],"notInventor":[],"owner":[],"notOwner":[],"tags":[],"dates":[],"types":[],"notTypes":[],"j":[],"notJ":[],"fj":[],"notFj":[],"classIpcr":[],"notClassIpcr":[],"classNat":[],"notClassNat":[],"classCpc":[],"notClassCpc":[],"so":[],"notSo":[],"sat":[]},"sequenceFilters":{"s":"SEQIDNO","d":"ASCENDING","p":0,"n":10,"sp":[],"si":[],"len":[],"t":[],"loc":[]}}